山羊CC類趨化因子受體(CCR2)基因的克隆及組織表達分析

朱江江，林亞秋，王 永,2，李 倩,2，林 森,2

(1. 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041；2. 西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041)

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山羊CC類趨化因子受體(CCR2)基因的克隆及組織表達分析

朱江江1，林亞秋2*，王 永1,2，李 倩1,2，林 森1,2

(1. 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041；2. 西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041)

本研究旨在克隆山羊CC類趨化因子受體基因(CCR2)的CDS區(qū)序列，并檢測其在山羊不同組織中mRNA和蛋白表達水平，從而為CCR2基因在山羊脂代謝中的作用研究奠定基礎。選取2～3周歲的健康簡州大耳羊和藏山羊羯羊各4只，屠宰后分別采集心、肝、脾、肺、腎、肌肉和皮下脂肪組織，分別提取組織總RNA及總蛋白，利用RT-PCR法克隆山羊CCR2基因序列，進行生物信息學分析，并利用實時定量PCR法和Western blot分別檢測CCR2基因mRNA和蛋白的表達水平。結果顯示，克隆得到CCR2基因cDNA序列1 186 bp，包含CDS全長1 100 bp，5′ UTR 2 bp 和3′ UTR 74 bp，編碼370個氨基酸殘基。山羊CCR2氨基酸序列與牛、豬、小鼠、人的相似性分別為97.3%、91.9%、77.0%和69.2%。山羊CCR2基因與牛具有最近的親緣關系，其次為豬、狗和小鼠，而與人的親緣關系較遠。組織表達結果顯示，CCR2在兩種山羊腎和心中均具有較高的表達水平，而在皮下脂肪和肌肉中的表達水平較低。這些結果表明，CCR2可能在山羊脂質代謝過程中具有重要的調控作用。

山羊；CCR2；克?。唤M織表達

隨著人們消費水平的提高和對綠色、健康生活飲食的倡導，羊肉因為味美、低膽固醇以及營養(yǎng)豐富而越來越深受人們的喜愛[1-3]。肌內脂肪(IMF)是山羊肉質的重要影響因素，與肉的嫩度、風味以及多汁性等性狀緊密相關[4]。因此，深入研究山羊脂質代謝的分子調控機制對于改善山羊肉質有著重要意義。

單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)是趨化細胞因子CC 亞家族中的一員[5]。MCP-1可招引單核細胞遷移至內皮下[6]，活化為巨噬細胞，進而吞噬已進入內膜的脂蛋白[7]。在人的脂肪細胞中，MCP-1釋放水平與CAAT區(qū)增強子結合蛋白D(CEBPD)的表達水平呈正相關，并參與到脂肪細胞的分化過程中[8]?？梢奙CP-1在脂質代謝過程中具有重要的調控作用。MCP-1主要是通過與CC類趨化因子受體2 (CCR2)相結合來發(fā)揮作用[9]。CCR2基因的過表達能夠增加機體對MCP-1的敏感性，進而促進單核細胞的遷移，其表達量與血液低密度脂蛋白呈正相關，而與高密度脂蛋白呈負相關[10-11]。MCP-1/CCR2能夠引起小鼠脂肪組織巨噬細胞的積累從而介導由肥胖導致的胰島素抵抗。敲除MCP-1或CCR2能夠降低細胞內巨噬細胞的數(shù)量[12]，促進小鼠的脂質代謝，抑制固醇調節(jié)元件結合蛋白1c(SREBP1c)的表達，促進ATP結合盒轉運子A1(ABCA1)基因的表達[13]，最終降低小鼠脂肪含量。而甘油三酯的積累則能夠抑制MCP-1和CCR2基因的表達[14]，推測CCR2基因在調控脂質代謝過程中具有重要作用。然而，現(xiàn)在對于山羊CCR2基因的序列及其在不同組織中表達特性方面研究的缺失，嚴重影響了對于CCR2功能的深入了解。

本研究以簡州大耳羊和藏山羊為研究對象，克隆CCR2基因，獲得其CDS區(qū)序列，利用實時定量PCR(qPCR)技術檢測其在山羊不同組織中的表達情況，從而為進一步研究CCR2基因在調控脂質代謝中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

QuantiTect Reverse Transcription Kit和QuantiFastTMSYBR?Green PCR Kit、pMD-19T Vector、gDNAse購于大連TaKaRa公司，Trizol購自Invitrogen公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)購自Axygen公司，2×Taq PCR Master Mix、質粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司，DH5α感受態(tài)細胞為本實驗室自制。苯酚、氯仿、異丙醇、酒精等其他試劑均為國產(chǎn)生化試劑。

1.2 樣品采集及總RNA提取

于四川省簡陽市和四川省若爾蓋縣選取健康的簡州大耳羊和藏山羊羯羊各4只。清晨空腹屠宰后，迅速采集心、肝、脾、肺、腎、背最長肌和皮下脂肪組織樣品各2 g，經(jīng)DEPC水清洗后，迅速裝入無RNA酶的冷凍管中并立即置于液氮中保存，用于組織總RNA及蛋白的提取。

利用Trizol法提取組織總RNA，并用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。采用NanoDrop ND-1000 (Agilent) 分光光度計測定RNA樣品的濃度以及OD260 nm/OD280 nm值，并控制在1.9～2.1之間。利用gDNAse去除基因組DNA后，利用QuantiTect Reverse Transcription Kit進行cDNA鏈的合成。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA的質量。

1.3 山羊CCR2基因的克隆

根據(jù)GenBank上牛(NM_001194959)、人(NM_001123041)、小鼠(NM_009915)的CCR2基因保守序列，利用Primer premier 5 設計克隆引物，上游引物：5′-AGATGGACGGCAATGATACG-3′，下游引物：5′-AACCCTGGCGGCTTATTATC-3′，預測產(chǎn)物長度1 186 bp。PCR反應體系為cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL, LaTaq 酶0.2 μL， dNTPs 2 μL, 水14.8 μL. PCR反應條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s, 72 ℃ 1.5 min，33個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應結束后，取5 μL擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，切膠回收DNA片段。連接pMD-19T載體后轉化DH5α感受態(tài)細胞，提取質粒后送深圳華大基因科技股份有限公司測序。

1.4 序列分析

利用NCBI網(wǎng)站上ORF Finder分析CCR2基因的開放閱讀框；利用NCBI在線工具進行外顯子分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi?textpage=online&level=form)；利用在線軟件blastn將測序結果進行同源性分析；利用BioXM2.6軟件對山羊、牛、人、小鼠、豬的氨基酸序列進行相似性比對，并利用PHYRE2在線工具(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index)和RasWin軟件對其三級結構進行預測比對；利用EXpASy在線工具對CCR2蛋白質分子量(MW)和等電點(PI)進行分析(http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam)；利用ProtScale在線工具對CCR2親水性結構進行分析(http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)；利用TMPRED在線工具進行跨膜結構分析(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)；利用MEGA5軟件進行CCR2基因物種進化樹分析。

1.5 實時定量PCR(qPCR)與組織表達檢測

采用Primer premier 5.0軟件設計目的基因的熒光特異性引物，引物由北京華大基因科技股份有限公司合成，上游引物：5′-TGTGAGGCTCATCTTCGTGATC-3′，下游引物：5′-GGCTGCTGCTCTTACAGGTACT-3′，預測長度122 bp。在進行正式試驗之前，所有的引物都經(jīng)過PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用CFX96 實時定量PCR儀(Bio-Rad)測定脂代謝相關基因的表達水平。qPCR反應體系：上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，SYBR 10 μL，水7 μL。定量程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，39個循環(huán)。熔解曲線分析：95 ℃ 10 s，然后以0.5 ℃/5 s 的速度從55 ℃升到95 ℃。每個品種為4個生物學重復，每個待測樣本設3個技術重復，并設置3個無cDNA模板的樣本為陰性對照，利用GAPDH作為內參[15]。

1.6 Western blot檢測

組織總蛋白樣品的提取和Western blot由成都丹鳳科技有限公司完成。利用RIPA裂解法提取組織總蛋白，利用濕轉法進行Western blot操作。Anti-CCR2兔多克隆抗體(ab21667)購自abcam公司，β-actin鼠單克隆抗體及蛋白二抗均購自北京天根生化有限公司。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct法對實時定量PCR數(shù)據(jù)進行均一化處理。利用SPSS19.0進行方差分析，采用Duncan法對各組織間mRNA表達進行多重比較。

2 結 果

2.1 山羊CCR2基因的克隆及序列分析

分別以簡州大耳羊和藏山羊組織總RNA為模板，反轉錄得到cDNA,并以此cDNA為模板利用T-A克隆的方法克隆得到山羊CCR2基因CDS區(qū)序列。結果顯示，克隆得到山羊序列為1 186 bp，其中包含CDS區(qū)1 110 bp，5′ UTR序列2 bp，3′UTR序列74 bp。其終止密碼子為TAG，編碼370個氨基酸殘基。兩個品種山羊CDS區(qū)相似性為99.7%，僅在第191位氨基酸具有差異，在簡州大耳羊中為絲氨酸(S)而在藏山羊中為脯氨酸(P)(圖1A)。山羊序列已經(jīng)登錄GenBank并得到登錄號為KR013053。山羊CCR2氨基酸序列與牛、豬、鼠、人的相似性分別為97.3%、91.9%、77.0%和69.2%(圖1B)。

山羊CCR2蛋白MW值為41 871.3 u，其PI值為8.66。氨基酸組成結果顯示，亮氨酸(L)所占的比例最高為12.2%(45個氨基酸)，同時包含24個負電荷氨基酸堿基(天冬氨酸D+谷氨酸E),包含30個正電荷氨基酸堿基(精氨酸R+賴氨酸K)。不穩(wěn)定指數(shù)為31.57，屬于穩(wěn)定蛋白，在哺乳動物細胞中的半衰期為30 h。脂溶系數(shù)為105.62，總平均親水性為0.463，蛋白整體表現(xiàn)出較強的疏水性，僅在前50位、第250位和后20位左右具有較強的親水性，其中250位左右親水性最強。山羊CCR2蛋白具有7個跨膜結構，分別為61～78、89～111、128～146、167～189、214～233、254～275、299～318。

三級結構分析結果顯示，CCR2基因具有GPCR家族的典型特點，具有7個跨膜結構，在山羊、牛、人、小鼠、豬等物種間CCR2蛋白結構具有較高的相似度(圖2)。

2.2 山羊CCR2基因系統(tǒng)進化樹分析

為了研究山羊CCR2基因的進化過程，本試驗對6種哺乳動物進行了生物進化樹分析，結果表明山羊CCR2基因與牛具有最近的親緣關系，其次為豬、狗、小鼠，而與人的親緣關系最遠(圖3)。

2.3 CCR2基因組織定量分析

qPCR結果顯示，CCR2基因在不同山羊品種間mRNA表達水平具有顯著差異。在藏山羊中，腎和心具有最高的表達水平，均顯著高于其他各個組織，在各肌肉組織中(背最長肌、臂三頭肌和后腿股二頭肌)中的表達量最低(圖4A)。蛋白結果也顯示CCR2在腎和心中的表達量最高，而在肌肉和皮下脂肪中表達量較低(圖5)。

而在簡州大耳羊中，肺、脾和皮下脂肪的mRNA的含量最高，而在肌肉組織和心中的表達量較低(圖4B)。蛋白結果顯示CCR2在腎和心的表達量最高，而在肌肉和脂肪中的表達量較低(圖5)。

圖1 不同品種山羊(A)和物種間(B)CCR2蛋白相似性分析Fig.1 Similarity of CCR2 protein between breeds of goat (A) and various species (B)

圖2 不同物種間CCR2蛋白三級結構對比Fig.2 Structure comparison of CCR2 protein among various species

圖3 基于6個代表物種的CCR2基因生物進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree based on CCR2 gene sequences of 6 representative species

3 討 論

IMF是反映山羊肉品質的重要指標，與羊肉嫩度和口感有很大關系，因此研究IMF形成的分子調控機制具有重要的現(xiàn)實意義?，F(xiàn)在，雖然已經(jīng)有很多關于脂代謝基因功能的研究報導[16]，然而關注山羊CCR2基因調控IMF沉積的研究并不多見，而基因序列的缺乏和組織表達信息的不完善嚴重阻礙了對其功能的研究。本研究的創(chuàng)新之處在于以簡州大耳羊和藏山羊為研究對象，克隆得到山羊CCR2基因CDS區(qū)序列，并通過比較在兩種山羊品種不同組織中的表達水平，初步預測其功能。簡州大耳羊是四川地區(qū)特有的全國肉用山羊新品種，該品種具有生長速度快、產(chǎn)肉性能優(yōu)良、繁殖性能高、體格大、遺傳性能穩(wěn)定、耐粗飼、適應性好等優(yōu)點，是四川地區(qū)重要的肉用山羊品種。藏山羊是川西北高原地區(qū)主要的山羊品種，具有顯著的高原動物的特征，在川西北牧區(qū)畜牧業(yè)中具有重要地位。兩種山羊品種生活條件的差異造成了不同的生長性狀，簡州大耳羊具有顯著高于其他山羊品種的肌內脂肪含量，然而現(xiàn)在關于IMF沉積的具體的調控機制尚不清楚。通過分析這兩種山羊基因序列和組織表達的特異性，為以后進一步系統(tǒng)的研究CCR2基因在調控脂質代謝中的功能提供了依據(jù)，也為促進四川地區(qū)山羊產(chǎn)業(yè)的長遠發(fā)展奠定了基礎。

圖4 藏山羊(A)和簡州大耳羊(B)CCR2基因mRNA的組織表達分析Fig.4 Tissue mRNA expression of CCR2 gene in Tibetan goat (A) and Jianzhou Big-eared goat (B)

A.CCR2蛋白在簡州大耳羊和藏山羊不同組織中表達的Western blot結果；B.CCR2蛋白在簡州大耳羊不同組織中的表達分析；C.CCR2蛋白在藏山羊不同組織中的表達分析A. The Western blot result of CCR2 expression in various tissues in Jianzhou Big-eared goat and Tibetan goat; B. The expression analysis of CCR2 in various tissues in Jianzhou Big-eared goat; C. The expression analysis of CCR2 in various tissues in Tibetan goat圖5 不同組織CCR2蛋白的Western blot分析Fig.5 Western blot determination of CCR2 protein in various tissues

本研究通過比較簡州大耳羊和藏山羊的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，兩品種山羊在第191位氨基酸具有差異，在簡州大耳羊中為絲氨酸(S)而在藏山羊中為脯氨酸(P)，而在牛、豬和鼠等低海拔動物中此位點均為絲氨酸(S)，推測此位點可能和藏山羊的高原適應性相關。盡管如此，此位點的改變卻并沒有引起蛋白三維結構的顯著變化，不同物種間CCR2均具有明顯的7個跨膜結構。然而，在不同的物種/品種間，CCR2的蛋白結構尚不完全一致，推測可能與物種的特異性有關。很顯然，這種改變是否會引起蛋白功能的變化還需要在細胞和活體水平上進行進一步的驗證，然而其保守的7個跨膜結構則暗示了其作用主要是作為GPCRs蛋白來實現(xiàn)的。

進化樹結果顯示，山羊CCR2基因與牛有最近的親緣關系，這與FASN等其他基因的結果一致[15,17]。之前通常利用人和小鼠作為參考來研究山羊基因的功能，然而由于親緣關系較遠，其功能往往具有較大的差異。隨著近年來對于豬研究的深入[18]，其逐漸成為一種較為成熟的模式動物。本研究中山羊與豬具有最近的親緣關系(除牛以外)，這與之前的研究結果一致[19]，表明山羊CCR2基因可能具有與豬相近的功能。這也為利用豬作為模式動物應用于山羊研究中提供了依據(jù)。

與藏山羊的情況不同，本研究中簡州大耳羊CCR2基因在腎和心中的mRNA表達較低，而在肺和脾中的表達量較高，然而，Western blot的結果發(fā)現(xiàn)，簡州大耳羊和藏山羊CCR2蛋白在腎和心中均具有較高的表達水平。推測可能有兩種原因，雖然簡州大耳羊在肺和脾中的mRNA的表達水平較高，但僅有較少的mRNA翻譯為蛋白質，轉錄后水平的調控是造成差異的主要原因，其次，在肺和脾中CCR2具有較高的降解率，從而導致了CCR2蛋白含量的降低。雖然對于造成這種差異的具體調控機制還需要進一步的確認，然而在腎和心中的高表達亦預示著CCR2在這兩種組織中發(fā)揮著重要作用。

此外，mRNA水平和蛋白水平的結果均顯示CCR2基因在肌肉組織中具有較低的表達水平。由于CCR2主要是作為GPCRs家族的一員來發(fā)揮作用的，具有級聯(lián)放大的效應[20]。 孫雨婷研究發(fā)現(xiàn)，GPR41在山羊乳腺中具有較低的表達量，然而卻能夠顯著調控脂肪酸代謝相關基因的表達，并影響乳脂的合成和分泌[21]，因此并不能排除其對肌內脂肪沉積具有重要調控作用的可能性。C.E. Egan等發(fā)現(xiàn)敲除CCR2能夠抑制B6小鼠肝脂質的積累[22]。CCR2還可以MCP-1/CCR2軸的形式參與到肥胖的產(chǎn)生和脂質代謝過程中[23]?？梢姡M管CCR2在肌肉中的表達水平較低，但在脂質代謝過程中具有重要的調控作用。

本試驗中雖然GAPDH也可作為內參基因來使用，然而同時使用3種不同的內參基因對檢測結果進行標準化被認為是一種更為可靠的組織定量分析方法[24]。內參基因的選擇可直接影響定量分析結果的穩(wěn)定性，本試驗中利用GAPDH作為qPCR的內參基因，這可能是導致mRNA檢測結果與蛋白檢測結果具有差異的原因。在以后的試驗中繼續(xù)利用3種不同的內參基因檢測CCR2基因在不同組織中的表達對我們更好的理解CCR2的功能具有重要作用。

4 結 論

CCR2基因CDS全長1 100 bp，編碼370個氨基酸殘基。山羊CCR2氨基酸序列與牛、豬、小鼠、人的相似性分別為97.3%、91.9%、77.0%和69.2%，山羊CCR2基因與牛具有最近的親緣關系，而與人的親緣關系較遠。組織表達結果顯示，CCR2在兩種山羊腎和心中均具有最高的表達水平，而在皮下脂肪和肌肉中的表達水平較低。推測CCR2在調控肌肉脂質代謝中可能具有重要的作用，本研究結果也為進一步研究CCR2在山羊脂質代謝中的作用奠定了基礎。

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(編輯 郭云雁)

Molecular Cloning and Tissue Expression of Goat Chemokine (CC motif) Receptor 2 (CCR2) Gene

ZHU Jiang-jiang1, LIN Ya-qiu2*, WANG Yong1,2, LI Qian1,2, LIN Sen1,2

(1.KeyLaboratoryofSichuanProvinceforQinghai-TibetanPlateauAnimalGeneticResourceReservationandExploitation,Chengdu610041,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu610041,China)

The aim of the study was to clone the CDS ofCCR2 gene, and to determine its expression in various tissues, which might provide basis for its functional research on regulating lipid metabolism. Each of 4 healthy, 2-3 years old castrated Jianzhou Big-eared goats and Tibetan goats were selected. After slaughter, the tissue samples from heart, liver, spleen, lung, kidney,longissimusdorsimuscle,bicepsfemorismuscle,tricepsbrachiimuscle and subcutaneous fat were collected for the total protein and RNA extraction. The sequence ofCCR2 gene was cloned by RT-PCR and analyzed using bioinformatics. The mRNA and protein expression ofCCR2 was determined using real-time fluorescent quantitative (qPCR) and Western blot, respectively. A length of 1 186 bp cDNA ofCCR2 gene was cloned, containing 1 100 bp CDS, 2 bp 5′ UTR and 74 bp 3′ UTR, encoding 370 amino acids. The goat CCR2 protein shared 97.3%, 91.9%, 77.0% and 69.2% similarity with bovine, pig, mouse and human, respectively. The goatCCR2 gene was closest associated with that of bovine, followed by pig, dog and mouse, and distant with human. The tissue expression analysis showed that expression ofCCR2 was higher in kidney and heart, and lowest in subcutaneous fat and muscles in both of the goat breeds. These data indicate thatCCR2 gene may play an important role in regulating lipid metabolism in goat.

goat;CCR2; cloning; tissue expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.007

2016-03-30

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目 (2015NZYQN80)；四川省應用基礎研究計劃(2016JY0147)

朱江江(1986-)，男，湖北鐘祥人，博士，助理研究員，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail: zhujiang4656@hotmail.com

*通信作者：林亞秋，博士，研究員，碩士生導師，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail: linyq1999@163.com

S827；S813.3

A

0366-6964(2016)11-2202-08