虎門合劑對成癮模型及戒斷大鼠GABA免疫陽性神經元的影響

丁尤放 林 涵 李樹春

中央民族大學少數民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院，北京 100081

?

實驗研究

虎門合劑對成癮模型及戒斷大鼠GABA免疫陽性神經元的影響

丁尤放 林 涵 李樹春*

中央民族大學少數民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院，北京 100081

目的：研究嗎啡成癮性和戒斷大鼠在虎門合劑給藥后GABA陽性神經元數量的變化。方法：通過提升傳統(tǒng)建模方法建立大鼠成癮模型和模型評估系統(tǒng)，同時利用免疫組化法觀察虎門合劑給藥后嗎啡成癮和戒斷大鼠陽性細胞元的變化。結果：嗎啡依賴大鼠海馬CA1區(qū)和齒狀回GABA陽性神經元數目明顯減少,虎門合劑治療組海馬GABA陽性神經元數量和光密度均顯著升高。結論：虎門合劑對嗎啡損傷一般記憶的效應具有拮抗作用。

物質依賴；γ-氨基丁酸(GABA)；海馬；神經元；虎門合劑

虎門合劑為名醫(yī)驗方，在甘肅、河南等地進行的中藥戒毒的臨床研究中取得了滿意的療效。尤其是1996年底，該藥在云南思茅等地的戒毒所進行臨床研究時，快速、高效和無副作用的優(yōu)點得到了當地有關部門的重視[1]。本方依據阿片類物質戒斷綜合征的病因病機特點，以中醫(yī)氣血臟象理論為指導，以陰陽雙補、去瘀化痰、安神止痛，扶正固本等為治法，對改善成癮患者稽延性戒斷癥狀，對抗復吸具有明顯療效。

學習記憶在藥物依賴中的作用已越來越引起人們的重視，甚至有人提出藥物依賴是一種異常形式的記憶[2]。而老年性學習記憶能力減退的研究顯示，與學習記憶有密切關系的隔海馬投射系統(tǒng)除了有乙酰膽堿以外還有GABA，并且隔核內的膽堿能神經元接受伏核GABA能神經元的支配，GABA能神經元的活動可調節(jié)膽堿能神經元的功能[3]。但在阿片類物質依賴所致學習記憶功能改變中GABA的變化及意義未見報道。本研究用免疫組化方法對各組大鼠海馬GABA進行研究，試圖找出GABA在阿片類物質依賴中的變化規(guī)律及其與學習記憶減退間的關系，以及虎門合劑對此的調節(jié)作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物：SPF級SD健康雄性大鼠，體重200～400g。數目：60只(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，合格證號：SCXK(京)2006-0008。動物常規(guī)飼養(yǎng)，適應環(huán)境一周后，隨機分為6組，每組10只。模型組按造模方法皮下注射(sc)嗎啡，正常組sc生理鹽水。中藥組在造模同時以虎門合劑灌胃(ig)，對照組在造模同時ig生理鹽水。模后組在造模完成后以虎門合劑灌胃(ig)，模后對照組在造模后ig生理鹽水。

1.2 試劑和儀器 鹽酸嗎啡 (mor-phinehy-drochloride，MH)(沈陽市第一制藥廠)，L-精氨酸(L-Arg)、DAB、花生油，內源性生物素封閉液(ABB)、3%正常羊血清，GABA抗血清，生物素結合IgG(Co.1∶200)，ABC復合物 (武漢博士德生物工程有限公司)，虎門合劑免煎劑(北京中醫(yī)藥大學制劑室)。CM1900橫冷式冰凍切片機(德國LAICA公司)，Observor行為學研究裝置(荷蘭NODULES公司)。

2 實驗方法

2.1 大鼠成癮模型的建立 大鼠稱重，采用鹽酸嗎啡背部皮下注射，對照組將嗎啡換成生理鹽水，其他處理與模型組相同。給藥時間及劑量見表1。

表1 嗎啡給藥一覽表

2.2 免疫組織化學 取實驗大鼠，快速開胸，經左心室主動脈插管，生理鹽水快速沖洗后，灌入預冷的4%緩沖多聚甲醛500mL，含0.25%戊二醛，取腦后固定2～4h，再轉入20%蔗糖中，于-70℃冰凍保存。作厚5μm冠狀冰凍切片，對含背側海馬的組織切片隔五取一，依次加入含3%正常羊血清中30min(37℃)，0.01mol/L、PH7.4 PBS接片，0.3%(體積分數)甲醇過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，0.3%(體積分數)TritonX100 37℃處理30min，ABB封閉內源性生物素。切片上加入GABA一抗(1∶100)及正常血清，4℃下孵育48～72h，加入二抗室溫3h，SABC室溫反應2h，DAB/H2O2呈色，明膠貼片，脫水透明，中性樹膠封固。PBS代替一抗作為陰性對照。

3 數據處理

4 結果

4.1 大鼠成癮模型的評定 各組在末次注射后12小時將大鼠放入行為學觀察記錄箱中，1min后開始用Observor觀察戒斷體征，歷時20min，戒斷體征分為可數和不可數體征，可數體征包括：齒顫，咀嚼，直立，濕狗樣抖動，跳躍。直接記錄20min內的次數得分。不可數體征包括：上瞼下垂、流淚、流涎、眨眼、腹瀉等，按評分標準評定(表2)。凡有接觸驚叫大鼠均增加2分。全部體征得分之和為戒斷總評分[3]。

表2 戒斷癥狀評分標準

嗎啡成癮大鼠和對照組大鼠戒斷后，經過20min觀察，兩組動物戒斷癥狀出現(xiàn)頻次情況見表3?？梢?嗎啡成癮大鼠模型的建立是成功的。模型組自然戒斷誘發(fā)戒斷癥狀結果是(34.82±0.53)次,對照組的結果是(1.01±0.64)次,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表3 嗎啡成癮大鼠和對照組戒斷癥狀

注：與對照組相比，*P<0.05；**P<0.01。

4.2 海馬不同亞區(qū)GABA陽性神經元的分布 海馬結構內GABA免疫組化染色可見陽性胞體和突起,細胞分布于海馬各區(qū),其中CA1區(qū)較多,并可見有較長突起的Golgi樣染色細胞(圖1A)。齒狀回分子層的細胞相對稀疏(圖1B)。

與正常組相比,GABA免疫染色陽性細胞在模型動物海馬內的密度較低,定量結果顯示,海馬結構內CA1區(qū)的GABA陽性細胞與模型組對比明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖1C)，齒狀回分子層內的GABA陽性細胞(圖1D)在模型組表達與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

中藥組海馬內GABA陽性神經元在CA1區(qū)數目與模型組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖1E、F)。中藥對照組海馬結構內GABA陽性神經元見于CA1、CA3區(qū)和齒狀回，各區(qū)的細胞形態(tài)和分布模式與對照組和模型組比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但在CA1區(qū)GABA陽性神經元數目與中藥組比較顯著降低，差異具有統(tǒng)計學之義(P<0.01)(表4),染色的強度也極度變淡(圖1G、H)，說明中藥具有治療作用。

表4 各組大鼠海馬GABA圖像分析結果

組別視野 CA1區(qū) CH區(qū) 陽性神經元數 NA 陽性神經元數 NA 正常組638.32±12.910.205±0.00123.91±5.360.204±0.001模型組623.45±7.53#0.201±0.002##14.90±5.64##0.198±0.003##中藥組632.75±9.17*0.208±0.004**22.72±9.18*0.207±0.003**對照組624.91±9.13#0.201±0.002##19.77±6.45#0.198±0.003##模后組632.91±10.79*0.205±0.003**24.81±8.17*0.207±0.003**模后對照組626.38±6.82#0.198±0.003##21.13±5.26*0.205±0.001##

注：與正常組比較，#P<0.05，與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

5 討論

GABA是哺乳類中樞神經系統(tǒng)中的主要抑制性神經遞質,廣泛分布于與學習記憶有密切關系的隔海馬投射系統(tǒng)。與學習記憶有密切關系的隔海馬投射系統(tǒng)除了有乙酰膽堿以外還有GABA,并且隔核內的膽堿能神經元接受伏核GABA能神經元的支配,GABA能神經元的活動可調節(jié)膽堿能神經元的功能[5]。GABA在老年學習記憶能力損害的過程中起著非常重要的作用[6]。有研究顯示行為學訓練前隔區(qū)內注射GABA受體激動劑可損害動物的空間學習記憶能力,若訓練后給藥則可易化學習過程；訓練后紋狀體內注射GABA受體拮抗劑荷包牡丹堿可引起嚴重的逆行性遺忘癥[7]。此外,GABA代謝酶抑制劑可通過提高腦內GABA水平而加重基底核損傷所致的空間定向能力障礙[8]。因此,可以認為GABA是參與學習記憶過程的另一重要的神經遞質系統(tǒng)。

在海馬GABA存在于非錐體神經元,按其與其它遞質的共存情況可分為多種亞型:①含鈣結合蛋白的GABA能中間神經元，主要是含小白蛋白和鈣結合素D28K。②含神經肽的GABA能神經元,目前已發(fā)現(xiàn)的GABA能神經元內的神經肽有生長抑素,膽囊收縮素,血管活性腸多肽和神經肽-Y。③含一氧化氮合酶的GABA能神經元。④不含上述物質的GABA能神經元。這些亞群間的神經元有很多相互重疊,即GABA能神經元可與多種神經活性物質共存。如大鼠海馬CA1區(qū)GABA陽性神經元中約有30%含有PV,而PV陽性神經元中有9.6%含CaBP,14%PV陽性神經元含有SOM?？梢奊ABA神經元是一類非常復雜的神經元[9]。

本交實驗結果顯示,模型組海馬本部各區(qū)的GABA能神經元均明顯減少(P<0.01)；在齒狀回分子層,GABA陽性神經元的光密度在模型組明顯少于對照和中藥組；而成癮組與用藥對照組之間沒有明顯差異(P>0.05)。因此,可以認為海馬CA1區(qū)和CH區(qū)的GABA能神經元在戒斷時明顯減少,但學習記憶能力的改變究竟是GABA的直接作用還是GABA通過影響其他神經遞質而間接作用，還有待進一步的研究。

眾所周知，海馬結構內的GABA能神經元是一類中間神經元。它接受基底前腦GABA能傳入纖維的支配,而不接受膽堿能傳入纖維和谷氨酸能傳入纖維的支配。它發(fā)出的軸突支配海馬的錐體細胞。損傷研究顯示,致癲癇藥物可引起海馬內GABA免疫反應終扣的丟失,并有不同程度的GABA能神經元結構損傷,表現(xiàn)為線粒體腫脹,細胞器崩解和神經末梢變性[10]。也有研究顯示[11],GABA可通過控制其靶細胞BDNF的表達水平而調節(jié)海馬中間神經元的表型,表現(xiàn)在發(fā)育早期GABA可促進神經元以旁分泌的形式產生大量BDNF,從而使GABA能中間神經元體積增大,表達NPY增加,發(fā)育晚期,GABA抑制BDNF合成,GABA受體激動劑蠅蕈醇可引起中間神經元體積縮小,NPY表達減少。NPY是與GABA共存的一種神經肽,可抑制CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體細胞的興奮性傳遞?？梢奊ABA有可能是成癮過程中GABA能神經元環(huán)路變性的一種使動因子。

本實驗發(fā)現(xiàn)虎門合劑治療組海馬GABA均有所升高，說明虎門合劑對嗎啡的損傷一般記憶效應具有拮抗作用。這種改善作用可能是中藥促進學習記憶的一般機制之一。同時按著中醫(yī)對腦病的研究成果來看，完全可以將依賴疾病定義為腦絡之病，至少是一種腦病。

[1]李樹春，滿序聰，徐斯凡，等.虎門合劑對嗎啡依賴大鼠學習記憶功能的影響[J].山西中醫(yī)，2010,26(8)：50-53.

[2]Nestler EJ. Neurobiology. Total recall-the memory of addiction[J]. Science,2001, 292(5525):2266-2267.

[3]Jacobson LH, Kelly PH, Bettler B,et al. GABA[B(1)]receptor isoforms differentially mediate the acquisition and extinction of aversive taste memories[J].J Neurosci, 2006,26(34):8800-8803.

[4]紀家濤.嗎啡依賴大鼠模型的建立[J].第二軍醫(yī)大學學報,1997,18(1):81-82.

[5]Sullivan MA, Chen H, Morikawa H. Recurrent inhibitory network among striatal cholinergic interneurons[J]. J Neurosci，2008，28(35):8682-8690.

[6]Saulle E, Gubellini P, Picconi B, Centonze D, Tropepi D, Pisani A, Morari M, Marti M, Rossi L, Papa M, Bernardi G, Calabresi P. Neuronal vulnerability following inhibition of mitochondrial complex II: a possible ionic mechanism for Huntington’s disease[J]. Mol Cell Neurosci. 2004,25(1):9-20.

[7]Ishitobi S, Ayuse T, Yoshida H,et al. Effects of midazolam on acquisition and extinction of conditioned taste aversion memory in rats[J]. Neurosci Lett. 2009，450(3):270-274. Epub 2008 Nov 24.

[8]Pitk?nen A, Halonen T. Prevention of neuronal cell death by anticonvulsants in experimental epilepsy (extended abstract)[J].Acta Neurol Scand Suppl. 1995,162:22-23.

[9]Fiorentino H, Kuczewski N, Diabira D, Ferrand N, Pangalos MN, Porcher C, Gaiarsa JL. GABA(B) receptor activation triggers BDNF release and promotes the maturation of GABAergic synapses[J]. J Neurosci. 2009 Sep 16; 29(37):11650-11661.

(編輯：梁志慶)

Influences from Traditional Chinese HuMen Composition on GABA Immune Positive Neurons of Morphine-Dependence and Withdrawal Rats

DING Youfang LIN Han LI Shuchun*

Institute of Chinese Minority Traditional Medicine, Minzu University of China, Beijing 100081, China

Objective To discuss the changes occurring in GABA positive neurons of morphine-dependence and withdrawal Rats after given HuMen Composition. Methods Rats addiction models and model evaluation system were established in the study through improving the traditional methods of building models. At the same time, immunohistochemical method was used to observe the changes occurring in positive neurons of morphine-dependence and withdrawal Rats after given HuMen Composition. Results the number of positive neurons is obviously decreased in hippocampus CA1 and Dentate Gyrus areas of morphine-dependent rats. In the treatment group of HuMen Composition, the number of hippocampus GABA and optical density are all increased respectively. Conclusion HuMen Composition may have certain antagonistic effect in curing damaged memory induced by morphine.

Addiction；GABA；Hippocampus；Neurons；HuMen Composition

2016-08-28

丁尤放(1994-)，男，漢族，研究生在讀，研究方向為民族醫(yī)藥。E-mail:shirakawahonoo@163.com

李樹春(1978-)，男，滿族，副研究員，博士，研究方向為民族醫(yī)藥。E-mail：jason@muc.edu.cn

R965

A

1007-8517(2016)21-0015-04