超濾法結(jié)合HPLC法測(cè)定白藜蘆醇的血漿蛋白結(jié)合率

鮑慧瑋　侯曉琳　劉芳馨　劉佳　李麗靜

【摘 要】 目的：建立測(cè)定白藜蘆醇與大鼠、小鼠、家兔血漿蛋白結(jié)合率的方法，并測(cè)定其結(jié)果，為白藜蘆醇的藥代動(dòng)力學(xué)及臨床用藥提供參考。方法：采用超濾法結(jié)合HPLC法對(duì)白藜蘆醇與大鼠、小鼠和家兔血漿的蛋白結(jié)合率進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：白藜蘆醇在0521～2297μg的線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=11434X-00409（r=09995）。白藜蘆醇與大鼠血漿、小鼠血漿和家兔在0504μg/mL、504μg/mL、2016μg/mL的含藥血漿中的蛋白結(jié)合率為（9032±009）%、（8932±004）%、（9152±012）%。結(jié)論：該方法重復(fù)性和專屬性好，操作簡(jiǎn)單、快捷，能夠滿足樣品定量分析測(cè)定要求；測(cè)定結(jié)果表明，白藜蘆醇與血漿蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合，且在考察范圍內(nèi)蛋白結(jié)合率對(duì)血藥濃度無(wú)明顯的依賴性。

【關(guān)鍵詞】 白藜蘆醇；超濾法；HPLC；血漿蛋白結(jié)合率

【中圖分類號(hào)】R2841 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）20-0023-04

白藜蘆醇（trans-3，5，4-o-trihydroxystilbene）是存在于虎杖、花生、桑椹、葡萄等植物中的一種生物活性極強(qiáng)的多酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2]和抗炎[3]等多方面作用，且在抑制血小板聚集、預(yù)防腹部、心臟病、關(guān)節(jié)等外科手術(shù)后纖維組織粘連和舒張血管方面也具有良好的藥理活性[4-6]。近年來(lái)其頗受關(guān)注和研究，是一種潛在開發(fā)的藥物。但其在藥代動(dòng)力學(xué)方面研究較少，尤其在血漿蛋白結(jié)合率方面并無(wú)研究。而藥物的血漿蛋白結(jié)合率是藥代動(dòng)力學(xué)中重要參數(shù)，與藥物在體內(nèi)的吸收、代謝、分布和排泄等密切相關(guān)[7-8]，對(duì)今后其新藥的研發(fā)和臨床應(yīng)用具有重要的意義[9-11]。實(shí)驗(yàn)采用超濾法和HPLC結(jié)合的方法[12-15]對(duì)白藜蘆醇和大鼠、小鼠、家兔的血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行研究，為對(duì)白藜蘆醇藥代動(dòng)力學(xué)的研究提供參考。

1 儀器與材料

11 儀器 Agilent1260型高效液相（含DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent有限公司）；WP-UP-III-10沃特浦實(shí)驗(yàn)室用超純水器（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；超濾管（醋酸纖維素膜，相對(duì)分子質(zhì)量截留值10kD，Millopore公司）；TG1650-WS 型高速離心機(jī)（上海盧湘儀）；SK-1快速混勻器（江蘇金壇市江南儀器制造廠）；AVW20D型電子天平（日本島津制作所）。

12 試藥 白藜蘆醇（批號(hào)：111535-200502，中國(guó)藥品生物制品鑒定所）；甲醇（色譜純，美國(guó)FISHER公司）；超純水（自制）；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、磷酸氫二鉀等均為分析純。

13 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體重（200±20）g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供（合格證號(hào)：SCXK（吉）2011-0004），毛細(xì)管眼眥取血，置肝素鈉抗凝離心管中，3000r/min離心10min，分離血漿，置于4℃冰箱中冷凍備用。SD小鼠，雄性，體重（200±20）g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供（合格證號(hào)：SCXK（吉）2011-0004），毛細(xì)管眼眥取血，置肝素鈉抗凝離心管中，3000r/min離心10min，分離血漿，置于4℃冰箱中冷凍備用。實(shí)驗(yàn)兔，雄性，體重18～22kg，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供（合格證號(hào)：SCXK（吉）2012-0002），毛細(xì)管眼眥取血，置肝素鈉抗凝離心管中，3000r/min離心10min，分離血漿，置于4℃冰箱中冷凍備用。

2 方法與結(jié)果

21 色譜條件 Venusil MP-C18（250mm×46mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水（V∶V=45∶55），流速1mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm，進(jìn)樣量為10μL，理論塔板數(shù)按照白藜蘆醇計(jì)算不低于2000，且與其他物質(zhì)分離度良好，符合藥典規(guī)定。

22 溶液配制

221 等滲PBS溶液的配制 分別稱取磷酸二氫鉀259g，磷酸氫二鉀1411g，氯化鈉199g，磷酸氫二鉀1411g，置于1000mL容量瓶中，加入適量超純水，超聲溶解，超純水定容至刻度，搖勻，即為等滲PBS溶液。

222 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品約5mg，置1L容量瓶中，加入適量等滲PBS，均勻混合，定容至刻度，搖勻，即得濃度約為5μg/mL的白藜蘆醇儲(chǔ)備液。

223 供試品溶液的配制 精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品252mg，置于50mL容量瓶中，加入等滲PBS溶液適量，充分溶解，定容至刻度，搖勻。分別吸取025、25、100mL加入25mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，得濃度為504、504、2016μg/mL的PBS溶液。分別精密吸取50μL，置于450μL空白大鼠、小鼠、家兔血樣中，均勻混合，得到濃度為0504、504、2016μg/mL的高、中、低濃度的血漿樣品。分別置于37℃水浴鍋中溫預(yù)3h后，將溫預(yù)后的大鼠血漿、小鼠血漿和家兔血漿移至超濾管中，6000r/min離心15min，得到各血漿超濾液，即得高、中、低濃度的供試品，在4℃下保存。

23 專屬性考察 取空白大鼠血漿、小鼠血漿和家兔血漿各400μL，分別置于37℃水浴鍋中溫預(yù)3h后，將溫預(yù)后的大鼠血漿、小鼠血漿和家兔血漿移至超濾管中，6000r/min離心15min，得到空白血漿超濾液。分別將白藜蘆醇對(duì)照品、空白血漿超濾液和供試品溶液按照“21”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)入高效液相，白藜蘆醇對(duì)照品峰形良好，且與其它峰分離度良好，具有良好的專屬性，見(jiàn)圖2、3、4。

24 線性關(guān)系考察 精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品252mg，置于50mL容量瓶中，加入等滲PBS溶液適量，充分溶解，定容至刻度，搖勻。分別吸取01、02、10、20、40、50mL加入100mL容量瓶中，

定容至刻度，搖勻，得濃度為0504、1008、504、1008、2016、252μg/mL的PBS溶液。按照“21”項(xiàng)下色譜條件方法進(jìn)入高效液相色譜中，記錄峰面積，以白藜蘆醇的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程為Y=11434X-00409（r=09995），線性范圍為0504～252μg。

25 精密度考察

251 PBS液精密度考察 取“24 線性關(guān)系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6d，計(jì)算日內(nèi)精密度的RSD值，連續(xù)進(jìn)樣6d，計(jì)算日間精密度RSD，結(jié)果見(jiàn)表1。

252 超濾液精密度考察 取“223”項(xiàng)下供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算日內(nèi)精密度的RSD值，連續(xù)進(jìn)樣6d，計(jì)算日間精密度RSD，結(jié)果見(jiàn)表1。

26 穩(wěn)定性考察

261 PBS溶液穩(wěn)定性考察 取“24 線性關(guān)系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對(duì)照品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進(jìn)入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果見(jiàn)表1。

262 超濾液穩(wěn)定性考察 取“223”項(xiàng)下供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進(jìn)入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。

27 超濾液回收率的考察 取“24 線性關(guān)系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對(duì)照品溶液，分別吸取400μL，置于超濾管中，以6000r/min離心15min，吸取超濾液，按照“21”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)入高效液相色譜儀，與相應(yīng)對(duì)照品溶液峰面積對(duì)比計(jì)算回收率。結(jié)果超濾膜回收率均≥95%，證明超濾膜對(duì)白藜蘆醇無(wú)特異性吸附。

28 血漿蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn) 取“252”項(xiàng)下中0504、504、2016μg/mL的低、中、高3個(gè)濃度的大鼠、小鼠、家兔樣品，分別吸取400μL，置于超濾管中，以6000r/min離心15min，得到空白血漿超濾液。按照“21”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)入高效液相，計(jì)算其血漿蛋白結(jié)合率。

蛋白結(jié)合率=ρ超濾前-ρ超濾后ρ超濾前×100%

式中：ρ超濾前為超濾前溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，μg/L；ρ超濾后為超濾液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，μg/L。

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 130軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明低、中、高3種濃度的供試品溶液與大鼠、小鼠和家兔的血漿蛋白結(jié)合率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

31 波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)DAD檢測(cè)器，在各波長(zhǎng)下，對(duì)不同色譜條件超濾液和對(duì)照品進(jìn)行分析。最終確定在波長(zhǎng)為290nm時(shí)，樣品分離效果最好，與其它雜質(zhì)的分離度均符合藥典藥典規(guī)定。

32 測(cè)定方法的選擇 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，有多種血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定的方法，常用的有超濾法、平衡透析法、凝膠過(guò)濾法、白蛋白微球測(cè)定法、超速離心法等。實(shí)驗(yàn)采用超濾法，其是一種經(jīng)典的測(cè)定方法，具有樣品測(cè)定準(zhǔn)確、速率高、成本低等顯著優(yōu)勢(shì)，適用于大量樣品的測(cè)定。超濾法減少了非特異性的表面吸附，縮短了平衡時(shí)間，加快了待測(cè)樣品的測(cè)定時(shí)間，且不受稀釋效應(yīng)和體積遷移的影響。

33 超濾管的選擇 實(shí)驗(yàn)選用截留向相對(duì)分子質(zhì)量為10K的超濾管，可以將超濾管內(nèi)的血漿蛋白、內(nèi)源性物質(zhì)及其他成分在透析的過(guò)程中穩(wěn)定的保存于超濾管濾膜內(nèi)，不對(duì)樣品進(jìn)行干擾，可以很好的測(cè)定白藜蘆醇與大鼠、小鼠和家兔血漿蛋白的結(jié)合率。

34 樣品的選擇和意義 白藜蘆醇在抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多方面性質(zhì)等方面都有良好的藥理作用，是一種很有潛力的藥品[10-11]，但對(duì)于其血漿蛋白結(jié)合率并沒(méi)有研究。白藜蘆醇藥物被吸收后部分呈游離的分子狀態(tài)，這部分游離的藥物分子能從血液中進(jìn)入作用部位，并發(fā)揮藥理作用，與血漿蛋白結(jié)合的藥物卻沒(méi)有藥理活性。當(dāng)游離的白藜蘆醇被代謝或者進(jìn)入組織后，部分與血漿蛋白結(jié)合的白藜蘆醇又可以分開并彌補(bǔ)游離的藥物。藥物的這種可逆性結(jié)合可以影響白藜蘆醇的藥代動(dòng)力學(xué)、作用時(shí)間、作用強(qiáng)度都密切相關(guān)，且與其作用機(jī)制、藥物相互作用等密切相關(guān)，故本試驗(yàn)對(duì)白藜蘆醇的血漿蛋白結(jié)合率的研究具有重要意義。

研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇具有高蛋白結(jié)合率，可使其在體內(nèi)的表觀分布容積相對(duì)較大，半衰期增長(zhǎng)，腎清除速率減慢；通過(guò)對(duì)大鼠、小鼠和家兔的超濾液色譜圖對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們色譜圖基本相同，可能因?yàn)檠獫{蛋白其成分相似。此方法適用于大鼠、小鼠、家兔的血漿蛋白蛋白結(jié)合率的測(cè)定，其對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)和臨床應(yīng)用也有極大的意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Chow S E， Kao C H， Liu Y T A， et al. Resveratrol induced ER expansion and ER caspase-mediated apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Apoptosis， 2014， 19（3）： 527-541.

[2]Hangun-Balkir Y， McKenney M L. Determination of antioxidant activities of berries and resveratrol[J]. Green Chemistry Letters and Reviews， 2012， 5（2）： 147-153.

[3]Riveiro-Naveira R R， Loureiro J， Valcárcel-Ares M N， et al. Anti-inflammatory effect of resveratrol as a dietary supplement in an antigen-induced arthritis rat model[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2014， 22： 290.

定容至刻度，搖勻，得濃度為0504、1008、504、1008、2016、252μg/mL的PBS溶液。按照“21”項(xiàng)下色譜條件方法進(jìn)入高效液相色譜中，記錄峰面積，以白藜蘆醇的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程為Y=11434X-00409（r=09995），線性范圍為0504～252μg。

25 精密度考察

251 PBS液精密度考察 取“24 線性關(guān)系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6d，計(jì)算日內(nèi)精密度的RSD值，連續(xù)進(jìn)樣6d，計(jì)算日間精密度RSD，結(jié)果見(jiàn)表1。

252 超濾液精密度考察 取“223”項(xiàng)下供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算日內(nèi)精密度的RSD值，連續(xù)進(jìn)樣6d，計(jì)算日間精密度RSD，結(jié)果見(jiàn)表1。

26 穩(wěn)定性考察

261 PBS溶液穩(wěn)定性考察 取“24 線性關(guān)系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對(duì)照品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進(jìn)入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果見(jiàn)表1。

262 超濾液穩(wěn)定性考察 取“223”項(xiàng)下供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進(jìn)入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。

27 超濾液回收率的考察 取“24 線性關(guān)系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對(duì)照品溶液，分別吸取400μL，置于超濾管中，以6000r/min離心15min，吸取超濾液，按照“21”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)入高效液相色譜儀，與相應(yīng)對(duì)照品溶液峰面積對(duì)比計(jì)算回收率。結(jié)果超濾膜回收率均≥95%，證明超濾膜對(duì)白藜蘆醇無(wú)特異性吸附。

28 血漿蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn) 取“252”項(xiàng)下中0504、504、2016μg/mL的低、中、高3個(gè)濃度的大鼠、小鼠、家兔樣品，分別吸取400μL，置于超濾管中，以6000r/min離心15min，得到空白血漿超濾液。按照“21”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)入高效液相，計(jì)算其血漿蛋白結(jié)合率。

蛋白結(jié)合率=ρ超濾前-ρ超濾后ρ超濾前×100%

式中：ρ超濾前為超濾前溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，μg/L；ρ超濾后為超濾液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，μg/L。

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 130軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明低、中、高3種濃度的供試品溶液與大鼠、小鼠和家兔的血漿蛋白結(jié)合率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

31 波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)DAD檢測(cè)器，在各波長(zhǎng)下，對(duì)不同色譜條件超濾液和對(duì)照品進(jìn)行分析。最終確定在波長(zhǎng)為290nm時(shí)，樣品分離效果最好，與其它雜質(zhì)的分離度均符合藥典藥典規(guī)定。

32 測(cè)定方法的選擇 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，有多種血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定的方法，常用的有超濾法、平衡透析法、凝膠過(guò)濾法、白蛋白微球測(cè)定法、超速離心法等。實(shí)驗(yàn)采用超濾法，其是一種經(jīng)典的測(cè)定方法，具有樣品測(cè)定準(zhǔn)確、速率高、成本低等顯著優(yōu)勢(shì)，適用于大量樣品的測(cè)定。超濾法減少了非特異性的表面吸附，縮短了平衡時(shí)間，加快了待測(cè)樣品的測(cè)定時(shí)間，且不受稀釋效應(yīng)和體積遷移的影響。

33 超濾管的選擇 實(shí)驗(yàn)選用截留向相對(duì)分子質(zhì)量為10K的超濾管，可以將超濾管內(nèi)的血漿蛋白、內(nèi)源性物質(zhì)及其他成分在透析的過(guò)程中穩(wěn)定的保存于超濾管濾膜內(nèi)，不對(duì)樣品進(jìn)行干擾，可以很好的測(cè)定白藜蘆醇與大鼠、小鼠和家兔血漿蛋白的結(jié)合率。

34 樣品的選擇和意義 白藜蘆醇在抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多方面性質(zhì)等方面都有良好的藥理作用，是一種很有潛力的藥品[10-11]，但對(duì)于其血漿蛋白結(jié)合率并沒(méi)有研究。白藜蘆醇藥物被吸收后部分呈游離的分子狀態(tài)，這部分游離的藥物分子能從血液中進(jìn)入作用部位，并發(fā)揮藥理作用，與血漿蛋白結(jié)合的藥物卻沒(méi)有藥理活性。當(dāng)游離的白藜蘆醇被代謝或者進(jìn)入組織后，部分與血漿蛋白結(jié)合的白藜蘆醇又可以分開并彌補(bǔ)游離的藥物。藥物的這種可逆性結(jié)合可以影響白藜蘆醇的藥代動(dòng)力學(xué)、作用時(shí)間、作用強(qiáng)度都密切相關(guān)，且與其作用機(jī)制、藥物相互作用等密切相關(guān)，故本試驗(yàn)對(duì)白藜蘆醇的血漿蛋白結(jié)合率的研究具有重要意義。

研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇具有高蛋白結(jié)合率，可使其在體內(nèi)的表觀分布容積相對(duì)較大，半衰期增長(zhǎng)，腎清除速率減慢；通過(guò)對(duì)大鼠、小鼠和家兔的超濾液色譜圖對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們色譜圖基本相同，可能因?yàn)檠獫{蛋白其成分相似。此方法適用于大鼠、小鼠、家兔的血漿蛋白蛋白結(jié)合率的測(cè)定，其對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)和臨床應(yīng)用也有極大的意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Chow S E， Kao C H， Liu Y T A， et al. Resveratrol induced ER expansion and ER caspase-mediated apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Apoptosis， 2014， 19（3）： 527-541.

[2]Hangun-Balkir Y， McKenney M L. Determination of antioxidant activities of berries and resveratrol[J]. Green Chemistry Letters and Reviews， 2012， 5（2）： 147-153.

[3]Riveiro-Naveira R R， Loureiro J， Valcárcel-Ares M N， et al. Anti-inflammatory effect of resveratrol as a dietary supplement in an antigen-induced arthritis rat model[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2014， 22： 290.