吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺、松脂酸銅復(fù)配對(duì)杧果蒂腐病菌的毒力增效

葉火春　馮崗　楊佳何　王瑤　閆超　張靜

摘 要 為延緩吡唑醚菌酯抗藥性發(fā)展及科學(xué)防治杧果蒂腐病，探索吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺、松脂酸銅對(duì)杧果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobroma Pat.）毒力增效的最佳配方，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定吡唑醚菌酯、嘧菌環(huán)胺及松脂酸銅對(duì)杧果蒂腐病菌的室內(nèi)毒力，并在此基礎(chǔ)上，采用Horsfall法定性篩選復(fù)配藥劑的增效比例，以孫云沛共毒系數(shù)法測(cè)定聯(lián)合毒力并確定最佳復(fù)配比例。結(jié)果表明：吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺增效配比體積為7∶3、6∶4、5∶5、3∶7、2∶8和1∶9，其中以6∶4增效作用最顯著，CTC值達(dá)880.96；吡唑醚菌酯與松脂酸銅按Horsfall法設(shè)計(jì)9種配比均無(wú)拮抗作用，除配比8∶2為相加作用外，其他配比均表現(xiàn)為不同程度的增效作用，其中以3∶7增效毒性比率最大，CTC值為430.30，增效顯著。吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺、松脂酸銅2種殺菌劑復(fù)配對(duì)杧果蒂腐病菌最佳毒力增效配比體積分別為6∶4和3∶7。

關(guān)鍵詞 吡唑醚菌酯 ；嘧菌環(huán)胺 ；松脂酸銅 ；可可球二孢菌 ；聯(lián)合毒力

中圖分類號(hào) S482.2+99 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.009

Abstract Pyraclostrobin was mixed with cyprodinil or copper abietate to prepare a mixed fungicide against mango stem end rot caused by Botryodiplodia theobroma to reduce the tolerance of pyraclostrobin against the disease. The toxicity of the mixed fungicides to B. theobroma Pat was determined by using mycelium growth rate test. Horsfall design method and Sun-Johnson method were used to evaluate the synergistic effect of the fungicides against B. theobroma Pat and to screen the mixed fungicides with higher synergistic interaction. The result showed that the mixtures of pyraclostrobin and cyprodinil had synergistic effect at the ratio of 7∶3， 6∶4， 5∶5， 3∶7， 2∶8 and 1∶9， of which the mixture at the ratio of 6∶4 had the best synergistic effect with co-toxicity coefficient （CTC） being 880.96. The results of the Horsfall method showed that the mixtures of pyraclostrobin and copper abietateon exhibited no antagonistic effect but synergistic interaction except the mixture at the ratio of 8∶2 which showed additive effect. Among these mixed fungicides， the fungicide mixed at the ratio of 3∶7 had the CTC value of 430.30 and showed significant synergistic interaction in controlling the disease. Therefore， the optimal synergistic proportions of the mixtures of pyraclostrobin with cyprodinil or copper abietateon against B. theobroma Pat were 6∶4 or 3∶7.

Keywords Pyraclostrobin ； Cyprodinil ； Copper abietate； Botryodiplodia theobroma ； Co-toxicity

由可可球二孢菌（Botryodiplodia theobromae Pat）引起的杧果蒂腐病是一種嚴(yán)重威脅杧果貯藏期果品的重要病害[1]。該病害具有潛伏侵染的特性，在果實(shí)成熟期才呈現(xiàn)發(fā)病癥狀，使其防治困難[2]。近年來(lái)，吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin）作為防治芒果蒂腐病害推薦用藥之一，良好的防效使得該藥的使用次數(shù)和使用量不斷增加。然而，吡唑醚菌酯屬于呼吸抑制劑，作用靶標(biāo)單一，被殺菌抗性行動(dòng)委員會(huì)歸類為具有高抗藥風(fēng)險(xiǎn)的藥劑[3]。嘧菌環(huán)胺是（Cyprodinil）新一代嘧啶胺類內(nèi)吸性殺菌劑，主要作用機(jī)理為抑制真菌水解酶分泌和蛋氨酸的生物合成，與三唑類、嗎啉類、甲氧基丙烯酸酯類等多類已知?dú)⒕鷦o(wú)交互性抗性[4]。松脂酸銅（Copper abietate）是一種廣譜保護(hù)性有機(jī)銅殺菌劑，主要以釋放銅離子抑制病原菌的蛋白質(zhì)合成及酶活性，屬于多作用位點(diǎn)殺菌劑，尚無(wú)抗藥性產(chǎn)生[5]。殺菌劑的合理復(fù)配既可有效延緩抗藥性產(chǎn)生，還可提高防效，擴(kuò)大防治譜，降低成本[6]。為此，本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺、松脂酸銅復(fù)配對(duì)杧果蒂腐病菌的聯(lián)合毒力研究，旨在尋找吡唑醚菌酯2種混劑的最佳增效配比，為防治杧果蒂腐病新型混劑的研發(fā)提供理論依據(jù)，并將有利于延長(zhǎng)吡唑醚菌酯、嘧菌環(huán)胺等內(nèi)吸性殺菌劑的使用壽命，提高松脂酸銅對(duì)病害的防效。

吡唑醚菌酯是巴斯夫公司開(kāi)發(fā)的一種高效、廣譜、低毒的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，具有保護(hù)、治療和葉片滲透?jìng)鲗?dǎo)作用，并對(duì)作物具有保健增產(chǎn)作用[7]。然而，吡唑醚菌酯作用位點(diǎn)單一，抗藥風(fēng)險(xiǎn)性高。Avenot等[8]從加利福尼亞州地區(qū)曾經(jīng)使用過(guò)吡唑醚菌酯的開(kāi)心果果園中，分離獲得59株開(kāi)心果晚疫病菌發(fā)現(xiàn)，其中56株對(duì)吡唑醚菌酯表現(xiàn)出抗藥性，EC50值在53 μg/mL以上。同樣，F(xiàn)ernández-Ortuno等[9]，發(fā)現(xiàn)分離于南北卡羅來(lái)納州草莓上的218株草莓灰霉病菌對(duì)吡唑醚菌酯抗藥性菌株達(dá)到了66.7%。目前，與其他不同作用機(jī)理的殺菌劑復(fù)配成為國(guó)內(nèi)外對(duì)吡唑醚菌酯研發(fā)的重點(diǎn)，巴斯夫公司近年先后推出多款吡唑醚菌酯復(fù)配產(chǎn)品，與其配伍的殺菌劑主要包括，氟環(huán)唑、代森聯(lián)、啶酰菌胺、滅菌丹、烯酰嗎啉、丁苯嗎啉、氟環(huán)唑+醚菌酯等[7]。吉沐祥等[10]開(kāi)展了吡唑醚菌酯與枯草芽孢桿菌對(duì)草莓枯萎病的增效配方篩選及混劑使用技術(shù)研究，結(jié)果顯示，20%吡唑醚菌酯與200億cfu/g枯草芽孢桿菌以1∶1配比增效作用最高，推薦灌根濃度為1 000～2 000倍液。趙建江等[11]明確了吡唑醚菌酯與啶酰菌胺混配對(duì)灰葡萄孢以質(zhì)量比為1∶2時(shí)，增效最明顯，在240～300 g a.i./hm2對(duì)番茄灰霉病具有良好的防治效果。陳娟芳等[12]篩選出吡唑醚菌酯與甲基硫菌靈以質(zhì)量比為1∶8時(shí)，對(duì)辣椒炭疽病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有增效作用。

當(dāng)前，防控杧果蒂腐病危害仍主要依賴于化學(xué)防治，常規(guī)用藥如多菌靈、烯唑醇和嘧菌酯等高效、靶標(biāo)單一的殺菌劑。由于長(zhǎng)期重復(fù)使用，致使該病原菌已對(duì)其產(chǎn)生不同程度的抗藥性[13]，尤其以苯并咪唑類殺菌劑更為突出。為了持續(xù)、有效地防控該病害發(fā)生及危害，采用殺菌劑間復(fù)配或者輪用的措施很有必要，實(shí)施前提則是豐富防治該病害藥劑庫(kù)[14]。胡美嬌和師超等[2，15]在對(duì)該病防治藥劑篩選中，均推薦吡唑醚菌酯作為防治該病害首選藥劑之一。臺(tái)灣馬米果嫁接苗梢枯病是同杧果蒂腐病原菌Botryodiplodia theobromae Pat（=Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Griff. & Maubl）引起的，Tovar-Pedraza等[16]對(duì)該病害藥劑篩選研究中發(fā)現(xiàn)，12種殺菌劑中以咯菌腈與嘧菌環(huán)胺混劑62.5%賽普護(hù)汰寧的毒力最高， EC50為0.004 3 μg/mL，吡唑醚菌酯與啶酰菌胺混劑次之，平均EC50為0.014 μg/mL。同樣，62.5%賽普護(hù)汰寧對(duì)由該種病原菌引起的木瓜蒂腐病亦具有較強(qiáng)的抑菌效果[17]。目前，鮮有吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺、吡唑醚菌酯與松脂酸銅2種復(fù)配制劑及其對(duì)杧果蒂腐病菌聯(lián)合毒力的研究報(bào)道。為此本研究開(kāi)展篩選吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺、吡唑醚菌酯與松脂酸2種復(fù)配的增效比例，確定增效較高的組合，測(cè)定這些組合對(duì)杧果蒂腐病菌的聯(lián)合毒力，最終確定吡唑醚菌酯2種混劑的最佳復(fù)配比例。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

杧果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobroma Pat）由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所采后病理及保鮮實(shí)驗(yàn)室提供，斜面低溫保存，轉(zhuǎn)接至平板培養(yǎng)2 d備用。

1.1.2 藥劑

98%吡唑醚菌酯原藥，購(gòu)自山東濰坊雙星農(nóng)藥有限公司；98%嘧菌環(huán)胺原藥，購(gòu)自瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司。上述2種藥劑分別用丙酮配制為1.00×104 μg/mL母液，備用。23%松脂酸銅乳油，由山東禾宜生物科技有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉18 g、蒸餾水1 L。

1.2 方法

1.2.1 殺菌劑單劑室內(nèi)毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[18]。在預(yù)試的基礎(chǔ)上，將吡唑醚菌酯和嘧菌環(huán)胺母液用0.1%吐溫-80無(wú)菌水2倍梯度稀釋，在含藥PSA平板中濃度設(shè)置為20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 μg/mL，而松脂酸銅乳油則用無(wú)菌水配制成2 000、1 000、500、250、125 μg/mL的含藥PSA平板。在活化2 d的杧果蒂腐病菌菌落邊緣制取直徑為4.0 mm的菌塊，轉(zhuǎn)接于含藥平板中，各處理重復(fù)3次，以不加藥劑的平板為對(duì)照，于28℃培養(yǎng)48 h，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，按照下列公式計(jì)算菌絲抑制率，并采用EXCEL數(shù)據(jù)處理，通過(guò)抑制率的機(jī)率值和藥劑濃度對(duì)數(shù)之間的線性回歸分析，求得藥劑的EC50和EC90值。

1.2.2 復(fù)配殺菌劑增效比例篩選

根據(jù)Horsfall[19]法設(shè)計(jì)復(fù)配比例，生物測(cè)定同1.2.1。將吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺2種單劑分別以0.1%吐溫-80無(wú)菌水溶液配制劑量濃度與其EC50相同或相近的藥液，藥液以體積比10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 、9∶1、0∶10等11種比例復(fù)配處理供試菌，以不加藥劑的處理為對(duì)照，重復(fù)3次；吡唑醚菌酯與松脂酸銅復(fù)配方法同上，并計(jì)算各復(fù)配藥劑的抑制率及毒性比率TR（實(shí)際抑制率/理論抑制率）。當(dāng)TR值大于1為增效作用；等于1為相加作用；若小于1為拮抗作用。

1.2.3 復(fù)配藥劑共毒系數(shù)測(cè)定

復(fù)配藥劑選取毒性比率較高的3個(gè)配比藥劑，設(shè)置5個(gè)濃度梯度，重復(fù)3次，以不加藥劑為空白對(duì)照，生物活性測(cè)定同1.2.1，計(jì)算復(fù)配藥劑的EC50。根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果，采用孫云沛法計(jì)算復(fù)配藥劑共毒系數(shù)（CTC），以CTC值大小評(píng)價(jià)復(fù)配藥劑的增效作用，并確定最佳藥劑復(fù)配配比。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[20]：CTC≥200，為顯著增效作用；120≤CTC<200，為略微增效作用；80

式中，A、B藥劑為復(fù)配的單劑；A%和B%分別為A、B單劑在混合藥劑中的含量；標(biāo)準(zhǔn)藥劑以其中一種單劑進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種殺菌劑對(duì)杧果蒂腐病菌室內(nèi)毒力

結(jié)果顯示：吡唑醚菌酯和嘧菌環(huán)胺2種單劑對(duì)杧果蒂腐病菌菌絲生長(zhǎng)均具有良好的抑制活性，其EC50值分別為2.59和6.37 μg/mL；而松脂酸銅對(duì)其抑菌效果較差，其EC50值為565.67 μg/mL；吡唑醚菌酯和嘧菌環(huán)胺抑菌活性明顯高于松脂酸銅，如表1所示。

2.2 復(fù)配殺菌劑毒性比率測(cè)定結(jié)果

基于各單劑EC50值，吡唑醚菌酯、嘧菌環(huán)胺和松脂酸銅分別配制成2.60、6.50和500.00 μg/mL等3種單劑藥液。經(jīng)Horsfall法篩選結(jié)果表明，吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺復(fù)配以體積比為4∶6時(shí)，呈現(xiàn)相加作用，而以配比為7∶3、6∶4、5∶5、3∶7、2∶8和1∶9時(shí)，TR值均大于1，表現(xiàn)為增效作用，其中6∶4毒性比率最高，其次為2∶8和7∶3，如圖1所示。吡唑醚菌酯與松脂酸銅組合除配比8∶2表現(xiàn)為相加作用外，其他配比均有不同程度的增效作用，其中以配比3∶7增效最明顯，其次為4∶6和1∶9，如圖2所示。

2.3 復(fù)配殺菌劑的聯(lián)合毒力

如表2所示，吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺以7∶3、6∶4和2∶8三種配比復(fù)配時(shí)，以6∶4共毒系數(shù)最高，CTC達(dá)到880.96，增效顯著，其對(duì)杧果蒂腐病菌毒力最強(qiáng)，EC50為0.47 μg/mL，而以7∶3配比復(fù)配時(shí)， CTC值為138.29，介于120與200，表現(xiàn)為略微增效；吡唑醚菌酯與松脂酸銅按1∶9、3∶7和4∶6三種配比復(fù)配時(shí)，共毒系數(shù)均大于200，表現(xiàn)為顯著增效作用，增效順序?yàn)?∶7>4∶6>1∶9，結(jié)果驗(yàn)證了Horsfall法篩選結(jié)果。這說(shuō)明，松脂酸銅藥劑添加少量吡唑嘧菌酯，可明顯提高抑菌毒力。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺對(duì)杧果蒂腐病菌室內(nèi)毒力最佳增效配比為6∶4，聯(lián)合毒力優(yōu)于2種單劑。吡唑醚菌酯與松脂酸銅復(fù)配對(duì)杧果蒂腐病菌毒力主要表現(xiàn)為增效作用，增效最顯著的配比為3∶7，少量吡唑醚菌酯可明顯提高松脂酸銅對(duì)杧果蒂腐病菌抑菌活性。

3.2 討論

保護(hù)性殺菌劑能夠阻止病菌的侵入，減輕病害的傳播流行，但是對(duì)已侵入植物體內(nèi)為害的病害，防治效果甚微，內(nèi)吸性殺菌劑雖然能較好地控制病害流行為害，但病原菌對(duì)其抗藥性問(wèn)題不容忽視[21]。殺菌劑復(fù)配既可提高防效，減少成本，也可拓寬殺菌譜，延緩抗性，是解決上述問(wèn)題的重要有效途徑。

目前，大多數(shù)吡唑醚菌酯混劑研究是利用與其他作用位點(diǎn)不同的殺菌劑混合增強(qiáng)了藥劑對(duì)病原菌生長(zhǎng)干擾性而呈現(xiàn)增效作用。吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑混合使用呈現(xiàn)不同程度增效作用，質(zhì)量比為1∶2混劑對(duì)馬鈴薯早疫病菌毒力增效、防效顯著高于單劑防效，同時(shí)提高馬鈴薯產(chǎn)量，并對(duì)祁山藥炭疽病菌同樣具有增效作用[22-23]。王凱則選擇了氰霜唑與吡唑醚菌酯復(fù)配，篩選出二者以4∶1復(fù)配對(duì)馬鈴薯晚疫病菌增效最顯著[24]。本實(shí)驗(yàn)篩選了吡唑醚菌酯與嘧菌環(huán)胺復(fù)配增效比例，以6∶4復(fù)配時(shí)對(duì)杧果蒂腐病菌增效作用最高。

內(nèi)吸治療性殺菌劑與保護(hù)性殺菌劑合理復(fù)配，二者相得益彰，既延緩作用位點(diǎn)單一的內(nèi)吸性殺菌抗藥性，又提高了保護(hù)性殺菌防治效果。目前這一類混劑在我國(guó)登記的復(fù)配殺菌劑中較為常見(jiàn)，如60%吡唑·代森聯(lián)WDG、50%唑醚·丙森鋅WDG、18%咪鮮·松脂銅EC、75%多·錳鋅WP、64%苯甲·錳鋅WP等等。本研究中，吡唑醚菌酯與松脂酸銅復(fù)配增效作用明顯，二者以3∶7復(fù)配時(shí)，增效最顯著。結(jié)果顯示，加入少量吡唑醚菌酯可提高松脂酸銅毒力作用，這種現(xiàn)象類似與小檗堿加入微量多菌靈即可增強(qiáng)其對(duì)桃褐腐病的抑制活性，其原因還有待進(jìn)一步探究。本研究只在室內(nèi)篩選藥劑增效復(fù)配組合，其田間防治效果是否與室內(nèi)毒力一致，對(duì)作物安全性以及增效作用機(jī)理等問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。

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