黃芩抑菌效力生物檢定法的研究

高 琳 傅 強(qiáng) 黃 萍 饒雅琨 司馬磊

西安交通大學(xué)藥學(xué)院(西安 710061)

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黃芩抑菌效力生物檢定法的研究

高 琳 傅 強(qiáng) 黃 萍△饒雅琨△司馬磊△

西安交通大學(xué)藥學(xué)院(西安 710061)

目的：探討管碟法用于測定黃芩抑菌效力的可行性。方法：以慶大霉素為工作參照物、抑菌圈直徑(D)為反應(yīng)值，按三劑量法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)黃芩樣品的抑菌效力進(jìn)行測定。結(jié)果：慶大霉素的質(zhì)量濃度在2.10～10.00μg/ml范圍內(nèi)、黃芩樣品溶液的質(zhì)量濃度在3.21×10﹣2g/ml～1.53×10﹣1g/ml范圍內(nèi)，其相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值與抑菌圈D呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0.9962，0.9953)。三劑量法實(shí)驗(yàn)劑間變異分析及可靠性測驗(yàn)結(jié)果表明回歸非常顯著，偏離平行、二次曲線、反二次曲線均不顯著，組內(nèi)(碟間)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；可信限為2.36%。根據(jù)慶大霉素效價(jià)值計(jì)算，黃芩藥材的效價(jià)為52 U/mg。結(jié)論：管碟法能用于黃芩抑菌效力的檢測，可作為黃芩品質(zhì)評(píng)價(jià)的一種新方法。

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)黃芩有較廣的抗菌譜，在試管內(nèi)對(duì)痢疾桿菌、白喉?xiàng)U菌、綠膿桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌以及腦膜炎球菌等均有抑制作用，煎劑作喉頭噴霧，對(duì)腦膜炎帶菌者亦有效，即使對(duì)青霉素等抗菌素已產(chǎn)生抗藥性的金黃色葡萄球菌，對(duì)黃芩仍屬敏感。在2015版《中國藥典》一部主要通過測定黃芩苷的含量對(duì)黃芩的品質(zhì)進(jìn)行控制和評(píng)價(jià)。同樣，對(duì)黃芩抗菌作用研究的報(bào)道中，大多數(shù)研究者對(duì)黃芩中的有效單體黃芩苷進(jìn)行了研究，證明了黃芩苷在體外對(duì)多種臨床常見病原菌具有抗菌活性。但另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃芩中的千紙層素-A和黃芩素對(duì)大腸桿菌也有一定的抑菌作用[1]，說明千紙層素-A和黃芩素也是黃芩抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一?？梢钥吹?，黃芩是一個(gè)復(fù)雜的體系，化學(xué)成分不完全明確，其抗菌作用是多組分共同作用結(jié)果，所以采用傳統(tǒng)的西藥質(zhì)量控制模式即單一成分的定性與定量控制其質(zhì)量[2]是不適當(dāng)，不準(zhǔn)確的。本研究嘗試從“效”入手，以抗菌效力類比抗生素，采用生物檢定法，綜合考慮各組分的影響，對(duì)黃芩的抑菌效力進(jìn)行測定[3]，以期為黃芩的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供新的思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器 BT25S型電子天平；GHP-9160型生化培養(yǎng)箱；LDZX-50KBS型立式滅菌器；牛津杯(7.8mm)；WGZ-2XJ型細(xì)菌濁度計(jì)；ZY-300IV 型微生物自動(dòng)測量儀；安捷倫1200型高效液相色譜儀。

1.2 試 藥 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品(630U/mg，批號(hào)：130326-201015；黃芩苷對(duì)照品(含量：93.3%，批號(hào)：110715-201318)；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：1301232)；抗生素微生物檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)(批號(hào)：140722)；實(shí)驗(yàn)用菌：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]，枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63 501]，大腸桿菌[CMCC(B)44 103]，藤黃微球菌[CMCC(B)28 001]，短小芽孢桿菌[CMCC(B)63 202](均購于中國食品藥品檢定研究院)；滅菌水，三蒸水(自制)；磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，磷酸；乙醇(分析級(jí))；甲醇(色譜級(jí))；黃芩藥材(購于西安怡康大藥房、北京同仁堂、藻露堂大藥房經(jīng)西安市食品藥品檢驗(yàn)所雷成康主任藥師鑒定)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 稱取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品31.75mg，置于1000ml量瓶內(nèi)，加滅菌水溶解并稀釋制成20.00μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品原液，備用。

2.2 供試品溶液的制備 取黃芩藥材100g，粉碎成細(xì)粉，加體積分?jǐn)?shù)55%乙醇1000ml，加熱回流3次，每次2h，合并濾液，減壓干燥，將提取物用滅菌水稀釋至含生藥1g/ml，備用。

2.3 測定菌株的選擇及菌懸液的制備 取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、短小芽孢桿菌5種標(biāo)準(zhǔn)菌株，制成濃度為1×108CFU/ml的菌懸液。采用2倍稀釋法測定黃芩提取液對(duì)5種細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)[3],分別為9.77×10-4，1.25×10-1，1.95×10-3，1.56×10-2和1.56×10-2g/ml。選取最敏感的金黃色葡萄球菌做為試驗(yàn)菌種。取金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，畫線接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，于37℃培養(yǎng)22 h，置于4℃冰箱保存。挑選第3代細(xì)菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用無菌水將菌苔洗下，制成懸液，使用細(xì)菌濁度計(jì)調(diào)節(jié)濁度為2.0麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，備用。

2.4 雙碟的制備 取雙碟，分別注入加熱融化的抗生素微生物檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)20ml作為底層，使培養(yǎng)基在碟內(nèi)均勻攤布，放置在水平面上待凝固。將制備好的菌懸液按1%的比例加入冷卻至56℃培養(yǎng)基中搖勻，作為上層菌液，每個(gè)碟中加入5ml，使均勻攤布。冷卻后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中以等距均勻安置牛津杯，分別滴加供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用陶瓦圓蓋覆蓋，37℃培養(yǎng)適宜時(shí)間后，取出用微生物自動(dòng)測量儀測量抑菌圈直徑。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌效價(jià)檢測方法學(xué)考察 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：將標(biāo)準(zhǔn)品原液按照1∶0.8的劑間距用磷酸鹽緩沖液(pH7.8)稀釋至2.10，2.62，3.28，4.10，5.12，6.40，8.00和10.00μg/ml的待測溶液，備用。劑量反應(yīng)關(guān)系考察：取制備好的雙碟，在每一雙碟中以等距離均勻安置牛津杯4個(gè)，用陶瓦圓蓋覆蓋備用。取上述待測溶液各0.3ml加樣，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，取出，用微生物自動(dòng)測量儀測量各樣品抑菌圈直徑D值。精密度試驗(yàn)：取標(biāo)準(zhǔn)品原液，稀釋至5.12μg/ml，按上述條件重復(fù)測定5次，精密測量各抑菌圈直徑D值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.46%，具有較好的精密度。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取標(biāo)準(zhǔn)品原液，稀釋至5.12μg/ml，分別在0、1、4、8和24h，按上述條件測定，精密測量各抑菌圈直徑D值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.37%，標(biāo)準(zhǔn)品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 供試品的抑菌效價(jià)檢測方法學(xué)考察 供試品溶液的制備：按2倍稀釋法用磷酸鹽緩沖液(pH7.8)將供試品原液稀釋。中心濃度的選擇：將供試品稀釋制成質(zhì)量濃度為1.00、5.00×10-1、2.50×10-1、1.25×10-1、6.25×10-2、3.12×10-2、1.56×10-2、7.80×10-3和3.90×10-3g/ml的溶液，取準(zhǔn)備好的雙碟27只，分為9組，每組3只。每組各碟內(nèi)各9只牛津杯分別滴滿各質(zhì)量濃度供試品溶液，在規(guī)定的溫度和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)16h，用微生物自動(dòng)測量儀測定抑菌圈大小，取平均值。線性關(guān)系：取供試品原液，按照1∶0.8的劑間距用磷酸鹽緩沖液(pH7.8)稀釋成1.53×10-1、1.22×10-1、9.80×10-2、7.84×10-2、6.27×10-2、5.02×10-2、4.01×10-2和3.21×10-2g/ml的待測溶液，備用。取制備好的雙碟，在每一雙碟中以等距離均勻安置牛津杯4個(gè)，用陶瓦圓蓋覆蓋備用。取上述待測溶液各0.3ml加樣，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，取出，用微生物自動(dòng)測量儀測量各樣品抑菌圈直徑D值。

2.7 黃芩藥材抑菌效價(jià)檢測 精密量取供試品原液，按1∶0.8的劑間距，用磷酸鹽緩沖液(pH7.8)稀釋成質(zhì)量濃度為7.84×10-2、6.27×10-2和5.02×10-2g/ml的溶液，作為供試品溶液，另精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液用磷酸鹽緩沖液(pH7.8)稀釋成質(zhì)量濃度為4.10、5.12、6.40μg/ml的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取制備好的雙碟6個(gè)，在6個(gè)牛津杯中分別滴加供試品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于37℃培養(yǎng)16h，用微生物自動(dòng)分析測量儀測量抑菌圈直徑，按《中國藥典》2015年版四部(通則1201 抗生素微生物檢定法)中量平行反應(yīng)測定法項(xiàng)下進(jìn)行劑間分析、可靠性測驗(yàn)、效價(jià)及可信限計(jì)算。

2.8 HPLC法測定黃芩藥材中黃芩苷的含量 按《中國藥典》2015年版四部(通則0512)項(xiàng)下的高效液相色譜法測定[3]。色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：色譜柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)；流速：1.0ml/min；檢測波長為280nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10μl。記錄色譜圖，見圖1。色譜圖中理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算均不低于2500。

3 結(jié) 果

3.1 劑量反應(yīng)關(guān)系考察結(jié)果 以抑菌圈直徑D(mm)為橫坐標(biāo)X，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度C(μg/ml)為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸，結(jié)果回歸方程為：Y=0.5398X-4.7995，r=0.9962。以抑菌圈直徑D(mm)為縱坐標(biāo)Y，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度C(μg/ml)為橫坐標(biāo)X，線性回歸，結(jié)果回歸方程為：Y=1.8387X+8.9643，r=0.9962。結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為2.10μg/ml～10.00μg/ml范圍內(nèi)，慶大霉素溶液濃度與抑菌圈直徑D有較好的量效關(guān)系。結(jié)果見表1。

3.2 中心濃度的選擇結(jié)果 測量抑菌圈直徑，質(zhì)量濃度為 6.25×10-2g/ml的黃芩溶液產(chǎn)生的抑菌圈直徑為17.83mm，大小合適，故選擇6.25×10-2g/ml為中心濃度。

表1 慶大霉素對(duì)金黃色葡萄球菌作用產(chǎn)生的抑菌圈直徑D(mm)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以抑菌圈直徑D(mm)為橫坐標(biāo)X，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度C(g/ml)為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸，結(jié)果回歸方程為y=0.0086x-0.0884，r=0.9953。結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為3.21×10﹣2g/ml～1.53×10﹣1g/ml范圍內(nèi)，黃芩溶液質(zhì)量濃度與抑菌圈直徑D有較好的量效關(guān)系。結(jié)果見表2。

表2 供試品溶液對(duì)金黃色葡萄球菌作用產(chǎn)生的抑菌圈直徑D(mm)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4 黃芩藥材抑菌效價(jià)檢測結(jié)果 黃芩藥材抑菌效價(jià)檢測，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品間抑菌圈直徑D(mm)比較(P>0.05),回歸非常顯著(P<0.01)，偏離平行不顯著(P>0.05)，二次曲線和反二次曲線均不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)結(jié)果可靠。碟間抑菌圈直徑D(mm)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，試驗(yàn)誤差較小。r=0.9922，可信限為2.36%。根據(jù)慶大霉素效價(jià)值計(jì)算，黃芩藥材的效價(jià)為52 U/g。不同來源黃芩藥材測定結(jié)果為：怡康大藥房黃芩52 U/g；北京同仁堂黃芩46 U/g；藻露堂大藥房黃芩58 U/g。結(jié)果見表3。

3.5 HPLC法測定黃芩藥材中黃芩苷的含量 不同來源黃芩藥材中黃芩苷含量測定結(jié)果為：怡康大藥房黃芩12.7%；北京同仁堂黃芩13.1%；藻露堂大藥房黃芩12.3%，黃芩苷含量的高低與抑菌效價(jià)并無直接關(guān)系。

表3 黃芩藥材效價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 討 論

對(duì)比本文中管碟法與HPLC法的結(jié)果，可以看出，黃芩苷含量的高低與黃芩藥材抗菌效力的強(qiáng)弱并無直接關(guān)系，更加說明以往只研究黃芩中黃芩苷這一單一組分的體外抗菌活性是不全面的，用黃芩苷的含量來代表黃芩的抗菌效力乃至黃芩的質(zhì)量是不科學(xué)、不可行的。本實(shí)驗(yàn)可以更直觀的反映出黃芩藥材的抑菌能力，也更加符合中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中以效入手的理念。已有報(bào)道[4]以枯草芽孢桿菌作為目標(biāo)菌建立黃芩炮制品的生物檢定法，本文選擇了金黃色葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)菌種，金葡菌和枯草芽孢桿菌都是生物檢定法中的常用菌種，從微生物形態(tài)上講，金葡為球菌，枯草為產(chǎn)芽孢桿菌，區(qū)分了桿菌、球菌、芽孢的不同細(xì)菌形態(tài)受到黃芩中抑菌成分的影響。另外金葡菌是醫(yī)院內(nèi)感染最主要的感染源，且對(duì)于其抗生素耐藥性的報(bào)道越來越多，具有抗菌效力的中藥未來會(huì)成為治療耐藥金葡菌感染的新途徑，所以選擇金葡菌作為目標(biāo)菌，更直觀，結(jié)果更具有參考價(jià)值。本次試驗(yàn)的關(guān)鍵之一在于標(biāo)準(zhǔn)品的選擇。本文中標(biāo)準(zhǔn)品系指用于生物檢定、抗生素或生物藥品中含量或效價(jià)測定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以效價(jià)單位(U)表示[5]。已有報(bào)道[6]以對(duì)照藥材作為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)照藥材的優(yōu)點(diǎn)在于與供試品在組成和成分上最為接近，但對(duì)照藥材的主要用途是用來鑒定藥材的真?zhèn)?，不同批次之間各差異較大，只能用于定性不能用于定量，所以該方法缺乏可靠性且不可推廣。在生物檢定法中，要求供試品與標(biāo)準(zhǔn)品具有同質(zhì)性。由于中藥成分復(fù)雜，所以要找到化學(xué)性質(zhì)，成分，比例完全相同的參照物是非常困難的，雖然從化學(xué)成分上來說，抗生素與中藥材是不相同的，但從抗菌效力來說，它們是具有廣義同質(zhì)性的，即具有相同的抗菌效力。已有報(bào)道以縮宮素作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)益母草藥材進(jìn)行生物檢定?？股貥?biāo)準(zhǔn)品的優(yōu)勢在于具有明確的生物效價(jià)，可以成為一個(gè)衡量標(biāo)準(zhǔn)和中介標(biāo)準(zhǔn)，既可把中藥材的抗菌能力與抗生素等效比較，又可溝通不同藥材的比較。所以本文選擇慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品作為試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)黃芩藥材抗菌效力進(jìn)行評(píng)價(jià)以期為中藥的生物檢定提供新的思路。

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(收稿2016-07-17；修回2016-09-03)

△西安市食品藥品檢驗(yàn)所(西安 710054)

黃芩 檢測 細(xì)菌

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.12.049