降膽固醇乳酸菌的篩選、鑒定及與中藥協(xié)同作用的研究

董 浩，王紅麗，王 莘

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118)

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降膽固醇乳酸菌的篩選、鑒定及與中藥協(xié)同作用的研究

董 浩，王紅麗，王 莘

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118)

為了獲取高效降膽固醇菌種，研究中藥與乳酸菌是否具有協(xié)同降膽固醇的作用，采用以酸菜汁為實(shí)驗(yàn)材料，利用碳酸鈣平板透明圈法以及傳統(tǒng)食品泡菜中降膽固醇乳酸菌的篩選方法篩選出降膽固醇的乳酸菌。然后鑒定高效降膽固醇菌株的種屬。用該菌株與五味子水煎液的混合物灌胃小鼠。結(jié)果顯示：所分離的乳酸菌大都有一定的降膽固醇能力，其中有1株菌對培養(yǎng)基中膽固醇的降解率為86.96%，經(jīng)鑒定為鼠李糖乳桿菌。該菌與中藥五味子水煎液的混合物能顯著降低高血脂小鼠血漿中的TC、TG、LDL-C水平，且無明顯的毒副作用。因此得出結(jié)論：篩選出1株高效降膽固醇乳酸菌，該乳酸菌與五味子水煎液的混合物有顯著的降膽固醇作用。

中藥；降膽固醇；乳酸菌

目前我國約有1.6億人患有血脂異常[1]。通常來說，血脂主要是由甘油三酯及膽固醇組成[2]。國外大量研究表明，乳酸菌能夠減少膽固醇含量[3-5]。通過多年對乳酸菌降膽固醇的研究，已有許多能夠降膽固醇的菌種被人們發(fā)現(xiàn)，并應(yīng)用于生活中。也有專家學(xué)者研究了中藥降膽固醇的效果。本實(shí)驗(yàn)著重比較研究乳酸菌、中藥及二者協(xié)同降高血脂癥小鼠膽固醇效果。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用的酸菜汁樣品由超市購買。普通級昆明小鼠(雄性)70只，4周齡，體質(zhì)量(18±3)g。

1.2 培養(yǎng)基

MRS固體、液體培養(yǎng)基[6]；MRS-碳酸鈣培養(yǎng)基[7]；MRS膽固醇培養(yǎng)基[8]。

1.3 試劑

牛膽鹽，北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠；膽固醇，北京愛普華美生物科技有限公司；血清總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒 南京建成生物工程有限公司；硫酸鐵銨、無水乙醇等均為分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50 SⅡ高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DH5000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱，中國天津市泰斯特儀器有限公司；TGL-16C型臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠制造；Spectrophotometer可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司制造。

2 方法

2.1 降膽固醇乳酸菌的篩選

降膽固醇乳酸菌的篩選方法參見文獻(xiàn)[9]。選取菌落為乳白色、濕潤、圓形的菌株在平板上反復(fù)劃線分離、純化，得純菌株后于甘油管中-20℃保存[9-10]，留做后續(xù)研究。將保留的各菌株平板劃線培養(yǎng)110h30min,選取其中具有明顯溶鈣圈的菌落，利用數(shù)顯千分尺測量菌落直徑及透明圈直徑。

2.2 膽固醇降解率的測定

膽固醇降解率的測定采用鐵礬顯色法，具體操作詳見文獻(xiàn)[9,11-14]。

2.3 高效降膽固醇乳酸菌的鑒定

通過常規(guī)細(xì)菌鑒定方法鑒定膽固醇降解率最高的菌株的種屬。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以GeneBank中相似度超過99%的序列做對比，運(yùn)用MEGA5.10軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹。

2.5 乳桿菌及中藥體內(nèi)降膽固醇實(shí)驗(yàn)

2.5.1 灌胃液的制備

灌胃菌液的制備參見參考文獻(xiàn)[15]。沉淀的菌體用0.9%的生理鹽水懸浮，將菌液稀釋至所需濃度(高劑量2×1010CFU/mL,中等劑量2×108CFU/mL，低劑量2×106CFU/mL)。

本實(shí)驗(yàn)之所以選用五味子是比較了10味應(yīng)用最多的單味中藥體外膽固醇降解率才選定膽固醇降解率最高的五味子來灌胃小鼠。中藥五味子灌胃液的制備：40g中藥→450mL自來水浸泡1h→大火煮開→改文火煮25min→4層紗布過濾→依此方法進(jìn)行2次→將兩次所得混合。

中藥與乳酸菌復(fù)合液所采用的配比是通過比較1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2:1這幾個配比下的膽固醇降解率才選定中藥與乳酸菌的配比為3∶2。

每次每只灌胃0.4mL。

2.5.2 高脂飼料的制備

高脂飼料含基礎(chǔ)飼料88.8%、豬油10%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%[16]。先按比例稱取膽固醇、膽鹽并將二者充分混勻，再與稱取的豬油攪拌均勻。稱取相應(yīng)比例的基礎(chǔ)飼料，把前三者的混合物與基礎(chǔ)飼料一起攪拌，使其均勻的分布在基礎(chǔ)飼料的表面[17]。

2.5.3 動物分組及實(shí)驗(yàn)方案

普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后,隨機(jī)分為7組,每組10只，連續(xù)飼喂不同的飼料4周(具體的分組及飼喂方式見表1)。在實(shí)驗(yàn)的第0、2、4周分別割尾采血(采血前禁食12h，不禁水)，離心分離血漿。每天保證充足的食物和飲水，更換墊料，自由飲水，按照表1中方案，每天上午固定時間對小鼠進(jìn)行灌胃，并保持飼養(yǎng)房的通風(fēng)、透光和清潔衛(wèi)生[18]。第28天采血后，昆明小鼠斷頸處死，解剖后分別取心、肝、脾、腎稱重[19]。

表1 實(shí)驗(yàn)分組情況

2.5.4 檢測指標(biāo)及方法

按照試劑盒說明書的要求測定血漿中TC、TG、HDL-C及LDL-C的含量。

2.5.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，處理后用x±s表示，采用Duncan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P>0.05表示無顯著性差異，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示差異非常顯著[20]。

3 結(jié)果和分析

3.1 降膽固醇乳酸菌的透明圈大小

選取了菌落為乳白色、濕潤、圓形的83株菌株進(jìn)行后續(xù)研究。其中71株菌株的溶鈣圈尤其明顯。部分菌株的菌落直徑與透明圈直徑之由小到大排列，如表2所示。

表2 菌株的透明圈

3.2 膽固醇的降解率

實(shí)驗(yàn)菌株在膽固醇培養(yǎng)基中大都有一定的降解膽固醇的效用(所測試的83株乳酸菌中有79株在培養(yǎng)基中具有脫除膽固醇的能力)但是，各菌株在膽固醇培養(yǎng)基中膽固醇降解率差別較大，脫除率從1.35%～86.96%不等。其中降膽固醇效果最好的菌株為H4，其膽固醇降解率達(dá)到86.96%。部分菌株在膽固醇培養(yǎng)基中的膽固醇降解率由高到低排列，如表3所示。

表3 菌株的膽固醇降解率

3.3 鑒定結(jié)果

經(jīng)鑒定H4菌株為鼠李糖乳桿菌。圖1所示為菌株H4的掃描電鏡圖。

圖1 菌株H4的掃描電鏡圖

3.4 H4的系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株H4的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。

圖2 菌株H4基因進(jìn)化樹

3.5 小鼠高脂模型的建立結(jié)果

飼喂普通飼料小鼠與飼喂高脂飼料小鼠血脂變化如表4。

表4 飼喂普通飼料小鼠與飼喂高脂飼料小鼠血脂變化(x±s,n=10)

由表4可見，普通組小鼠血漿TC、TG、HDL-C及LDL-C的濃度一直保持穩(wěn)定(P>0.05)。高脂組在飼喂高脂飼料14d后，血漿TC、TG、HDL-C濃度與普通組相比差異不顯著(P>0.05)，但LDL-C濃度與普通組相比差異極其顯著(P<0.01)，高脂組在飼喂高脂飼料28d后，血漿HDL-C濃度與普通組相比差異不顯著(P>0.05)，但TC、TG、HDL-C 濃度與普通組相比明顯升高，兩者差異極其顯著(P<0.01)，表明造模成功。

3.6 菌株H4對高脂血癥小鼠血脂的影響

整個實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠毛色光潔，食欲正常，未出現(xiàn)異常體征，未發(fā)生自然死亡[21]。

表5 H4對小鼠血脂的影響(x±s,n=10)

由表5可知，經(jīng)過28天灌胃后，與高脂組相比，H4高劑量組，中劑量組及復(fù)配組的血漿TC、TG以及LDL-C含量存在極其顯著的差別。但各組對血漿HDL-C的作用不明顯(P>0.05)。對比表7中各組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)復(fù)配組對小鼠降膽固醇作用比中藥及乳酸菌單獨(dú)作用效果都要好。

3.8 對高脂血癥小鼠臟器指數(shù)的影響

小鼠肝、心、脾及腎與體質(zhì)量的百分比如表6所示。

表6 小鼠的臟器指數(shù)(x±s,n=10)

由表6可見，各組間肝臟和體質(zhì)量比未有顯著性差異(P>0.05)，這表明實(shí)驗(yàn)期間小鼠灌胃H4及中藥等未見明顯的毒副作用。

4 結(jié)論與討論

本研究對酸菜汁中降解膽固醇的菌株進(jìn)行了比較研究，得出了一些較為明確的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)酸菜汁中分離的乳酸菌都有一定的降膽固醇能力。其中一菌株H4降膽固醇效果優(yōu)良，是非常具有開發(fā)潛力的微生物資源，可以成為工業(yè)菌種馴化的材料。比在菠菜[22]中篩選到的降膽固醇乳酸菌的降解率(4.82%)要高，比在漿水[23]中篩選到的降膽固醇乳酸菌的降解率(92.28%)略低。通過對比表2和表3中菌株可知：透明圈明顯的菌株(有膽鹽水解酶的菌株)不一定具有降膽固醇的能力或者具有膽固醇降解率但卻不能很好的去除膽固醇；相反，有降解膽固醇能力的菌株不一定有膽鹽水解酶。用H4灌胃昆明小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H4能顯著降低血清TC、TG和LDL-C的濃度，而各組間血清HDL-C的含量差異不顯著，說明HDL-C值不易受外界因素的影響而發(fā)生變化。對比表5中H4高、中、低劑量組數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，菌株H4具有降低體內(nèi)膽固醇的作用，且作用效果與其濃度相關(guān)。對比表6中各組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)復(fù)配組對小鼠降膽固醇作用比中藥及乳酸菌各自單獨(dú)作用效果都要好。

綜上所述，乳桿菌H4與中藥五味子具有良好的協(xié)同降膽固醇功效，而且安全可靠，在開發(fā)降血清膽固醇功能性制品方面具有廣闊的市場前景。

[1] 郭雯, 張維君. 血脂異常的治療目標(biāo)[J]. 中國醫(yī)藥, 2012(7)：1476-1478.

[2] 李慧, 景賢, 鄧曉蘭, 等. 調(diào)脂藥物的作用靶點(diǎn)[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2013(1)：101-108.

[3] Liong MT, Shah NP. Effects of a Lactobacillus casei Synbiotic on Serum Lipoprotein, Intestinal Microflora and Organic Acids in Rats[J]. Journal of Dairy Science, 2006(89)：1390-1399.

[4] Jeun J, Kim S, Cho S-Y,etal. Hypocholesterolemic effects of Lactobacillus plantarum KCTC3928 by increased bile acid excretion in C57BL-6 mice[J]. Nutrition, 2010(26)：321-330.

[5] Wang Y, Xu N, Xi A,etal. Effects of Lactobacillus plantarum MA2 isolated from Tibet kefir on lipid metabolism and intestinal microflora of rats fed on high-cholesterol diet[J]. Applied microbiology and biotechnology， 2009(84)：341-347.

[6] 周德慶. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 北京： 高等教育出版社， 2006： 374.

[7] 丁苗, 劉洋, 葛平珍, 等. 發(fā)酵酸肉中降膽固醇乳酸菌的篩選、鑒定及降膽固醇作用[J]. 食品科學(xué)， 2014(19)：203-207.

[8] 凌代文. 乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[J]. 微生物學(xué)通報, 1999(1): 23.

[9] 章秀梅, 劉昭明, 黃翠姬, 等. 酸菜汁中乳酸菌的分離鑒定及其體外降膽固醇能力研究[J]. 中國調(diào)味品， 2011(11)：30-34.

[10] 王夫杰, 魯緋, 渠巖, 等. 腐乳中乳酸菌的分離與鑒定[J]. 中國調(diào)味品, 2010(7)：98-101.

[11] 于長青, 張麗娜. 發(fā)酵肉制品中降膽固醇乳酸菌的分離及鑒定[J]. 食品科技, 2007(8)：45-48.

[12] 張宏立, 邢春艷, 王淑娟. 高效降解膽固醇乳酸菌的選育及其應(yīng)用效果研究[J]. 中國乳業(yè)，2008(5)：44-45.

[13] 劉麗莉, 董鐵有, 楊協(xié)立. 6種乳酸菌降解膽固醇的體外試驗(yàn)[J]. 河南科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)， 2005(6)：85-88.

[14] 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會. GB/T5009.128-2003中國標(biāo)準(zhǔn)書號[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2004.

[15] 嚴(yán)玉婷, 潘道東. 發(fā)酵乳桿菌SM-7的篩選及對小鼠降膽固醇作用[J]. 食品科學(xué)， 2010(9)：224-228.

[16] 韓靜, 余俊達(dá), 潘秋, 等. 四種高脂飼料誘發(fā)胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010(4)：64-66.

[17] 李穎. 復(fù)合菌種發(fā)酵生產(chǎn)低膽固醇鵝肉香腸的研究[D]. 大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 2011.

[18] 于志會, 張雪, 李盛鈺, 等. 植物乳桿菌C88發(fā)酵乳對高脂血癥小鼠降膽固醇的作用[J]. 中國乳品工業(yè)， 2013(8)：17-19.

[19] 謝麗麗, 趙靈穎, 胡庭俊. 中獸藥復(fù)方“連藤”的抗炎作用及安全性評價[J]. 畜牧與飼料科學(xué)，2011(11)：56-58.

[20] 王應(yīng)米. 心肌梗死合并束支阻滯的心內(nèi)科診斷[J]. 大家健康(學(xué)術(shù)版)，2014(22)：75-76.

[21] 胡夢林, 王毅, 馬杰, 等. 擴(kuò)展青霉脂肪酶預(yù)防高血脂作用研究[J]∥增強(qiáng)自主創(chuàng)新能力 促進(jìn)吉林經(jīng)濟(jì)發(fā)展：啟明杯·吉林省第四屆科學(xué)技術(shù)學(xué)術(shù)年會.長春，2006：3.

[22] 劉長建, 姜波, 安曉雯, 等. 菠菜中降膽固醇乳酸菌的篩選及鑒定[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報，2010(6)：937-940.

[23] 李雪萍, 李建宏, 李敏權(quán), 等. 漿水中降膽固醇乳酸菌的篩選及其功能特性[J]. 微生物學(xué)報， 2015(8)：1001-1009.

責(zé)任編輯：程艷艷

Study on Screening and Identification of Cholesterol-reducing Lactic Acid Bacteria and Its Synergistic Effect with Traditional Chinese Medicine

DONG Hao, WANG Hongli, WANG Xin

(School of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

In order to get efficient cholesterol-reducing strains and study whether traditional Chinese medicine and lactic acid bacteria have synergistic effects on cholesterol reduction, in this paper, by taking sauerkraut juice as an experimental material, the cholesterol-reducing lactic acid bacteria is screened with the method of calcium carbonate clarity circle on plate and the method of screening lactic acid bacteria from traditional pickles. The species of the efficient cholesterol-reducing strains is identified. The mixture of this strain and schisandra fruit decoction is used to feed mice. The results show that almost all lactic acid bacteria isolated have certain cholesterol-reducing effects, the cholesterol degradation rate of one of them is 86.96%, which is identified as Lactobacillus rhamnosus. The mixture of this strain and schisandra fruit decoction can significantly reduce the levels of TC, TG and LDL-C in plasma of mice with hyperlipidemia. So we come to a conclusion that one of efficient cholesterol-reducing lactic acid bacteria is screened, the mixture of this strain and schisandra fruit decoction has significant effects on cholesterol reduction.

traditional Chinese medicine; cholesterol-reducing; lactic acid bacteria

2016-06-18

長春市科技局項目(2012223)

董浩(1979-)，男，吉林公主嶺人，副教授，博士，主要從事動物病毒學(xué)方向的研究；王紅麗(1986-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事微生物資源開發(fā)與利用方面研究。

Q93.331

A

1009-3907(2016)10-0053-06