應(yīng)用cDNA-SRAP標(biāo)記比較蘋(píng)果梨與延光梨果皮性狀的表達(dá)差異

崔百會(huì)，金炳奎，楊 洋，曹后男，宗成文

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

?

應(yīng)用cDNA-SRAP標(biāo)記比較蘋(píng)果梨與延光梨果皮性狀的表達(dá)差異

崔百會(huì)，金炳奎，楊 洋，曹后男，宗成文*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

以蘋(píng)果梨和延光梨果皮為試材，對(duì)盛花后7 周的蘋(píng)果梨和延光梨果皮cDNA進(jìn)行SRAP-PCR檢測(cè)，找出2個(gè)梨品種(系)在轉(zhuǎn)錄水平的差異，共擴(kuò)增出444條可被應(yīng)用的條帶。2個(gè)品種間的相似性極高，僅檢測(cè)到2個(gè)差異片段，多態(tài)性為0.45%。其中，ME7-EM5引物組合擴(kuò)增出的差異條帶是因?yàn)楹塑账嵝蛄邪瑑?nèi)含子序列，為模板中存在的少量DNA擴(kuò)增；ME4-EM3引物組合擴(kuò)增出的差異條帶經(jīng)回收測(cè)序，于Blast上比對(duì)得知其為植物凝集素基因，經(jīng)半定量RT-PCR驗(yàn)證多態(tài)性消失，判斷差異條帶可能是由于蘋(píng)果梨與延光梨引物結(jié)合位點(diǎn)存在差異而致。

蘋(píng)果梨；延光梨；芽變；cDNA-SRAP

蘋(píng)果梨引自朝鮮，為經(jīng)過(guò)繁殖和栽培發(fā)展起來(lái)的一個(gè)品種[1]，是我國(guó)東北地區(qū)最受歡迎的水果之一[2]。延光梨[3]是蘋(píng)果梨的一種果皮褐色型的芽變。果實(shí)的外形和色澤均是影響其商品價(jià)值的重要指標(biāo)，也是果樹(shù)育種中很重要的部分。關(guān)于果實(shí)色澤方面的研究已有諸多報(bào)道[4]。長(zhǎng)期以來(lái)，由于雄性不育等原因，蘋(píng)果梨雜交育種比較困難。相對(duì)于雜交育種，果樹(shù)芽變選種周期短、育種進(jìn)程快，是果樹(shù)創(chuàng)新育種的重要途徑[5]?，F(xiàn)今，已有許多果樹(shù)的芽變經(jīng)選種成為優(yōu)良的栽培品種，如柑橘[6]、桃[7]、甜橙[8]、蘋(píng)果[9]、櫻桃[10]等。

芽變的發(fā)生使得突變體與原品種之間形成差異，導(dǎo)致植株表型的改變。大多數(shù)木本果樹(shù)童期較長(zhǎng)，重要性狀的芽變對(duì)于果樹(shù)變異性狀發(fā)生機(jī)制的研究非常重要。分子標(biāo)記技術(shù)是研究植物突變機(jī)理的有效方法[11-12]，克服了AFLP[13]技術(shù)復(fù)雜，RAPD[14]重復(fù)性差，成本昂貴的缺點(diǎn)，SRAP標(biāo)記技術(shù)[15]以其操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高、可靠性好、成本低等一系列優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。本研究應(yīng)用cDNA-SRAP標(biāo)記技術(shù)探索蘋(píng)果梨芽變機(jī)制，探索蘋(píng)果梨與延光梨在分子水平的差異。為蘋(píng)果梨褐色芽變機(jī)理提供理論依據(jù)，為蘋(píng)果梨的創(chuàng)新育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所需蘋(píng)果梨和延光梨的果實(shí)均采自延邊大學(xué)蘋(píng)果梨實(shí)驗(yàn)基地，差異表達(dá)分析選取盛花后7周的果皮為材料，此時(shí)期為延光梨果皮褐變的關(guān)鍵時(shí)期[3]。

1.2 試劑及引物

rTaq酶(5 U/μL)等生化試劑均購(gòu)自寶生物(大連)有限公司；引物由南京基天生物技術(shù)有限公司合成，序列信息如表1所示。

表1 SRAP引物序列信息

Table 1 Total sequences of SRAP primers

1.3 RNA的提取與cDNA-SRAP擴(kuò)增

以蘋(píng)果梨與延光梨不同發(fā)育時(shí)期的果皮為材料，經(jīng)改良的CTAB法[16]提取2個(gè)樣品的總RNA，以O(shè)ligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，利用Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA第1鏈。對(duì)盛花后7周的蘋(píng)果梨與延光梨果皮cDNA 的Actin基因進(jìn)行擴(kuò)增比較，調(diào)節(jié)模板 cDNA 的體積，使Actin基因的表達(dá)量相同，保證蘋(píng)果梨與延光梨的初始模板用量一致。應(yīng)用表1中14個(gè)上游引物與11個(gè)下游引物兩兩組合得到的154對(duì)引物組合對(duì)2者進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 45 s ,50 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s ，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1.4 差異片段的克隆與測(cè)序

PCR擴(kuò)增后用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)并找出差異條帶。按Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0說(shuō)明書(shū)方法，進(jìn)行目的片段的回收；將回收的片段與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，藍(lán)白斑和菌液PCR篩選帶有目的片段的克隆，送Invitrogen(上海)公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：

護(hù)士應(yīng)營(yíng)造一個(gè)溫馨、舒適的病房環(huán)境，避免接種兒童對(duì)陌生環(huán)境的緊張和恐懼感；同時(shí)注意保持接種室的干凈、清潔，定期消毒，避免發(fā)生交叉感染；接種室內(nèi)的溫度、濕度、光線等都應(yīng)控制良好，避免過(guò)冷或過(guò)熱，導(dǎo)致兒童不舒適；在接種室墻壁上張貼一些卡通漫畫(huà)，播放一些動(dòng)畫(huà)片等，有利于提高親切感和兒童預(yù)防接種的依從性[3] 。

應(yīng)用上述引物對(duì)盛花期后的7個(gè)不同時(shí)期對(duì)蘋(píng)果梨與延光梨進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果梨與延光梨總RNA提取

蘋(píng)果梨與延光梨果皮的總RNA電泳檢測(cè)如圖1所示，所提取的RNA無(wú)其它雜質(zhì)殘留，質(zhì)量可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 蘋(píng)果梨(P1,P2)與延光梨(Y1,Y2)總RNA

2.2 蘋(píng)果梨與延光梨果皮cDNA-SRAP擴(kuò)增分析

對(duì)盛花后7周的蘋(píng)果梨與延光梨的果皮進(jìn)行cDNA-SRAP的擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。

圖2 蘋(píng)果梨與延光梨cDNA-SRAP擴(kuò)增

Fig.2 cDNA-SRAP amplification of Pingguoli and Yanguangli

M：Marker；a-b：MEa-EMb，為1對(duì)引物組合。每對(duì)引物組合對(duì)應(yīng)的2條泳道左側(cè)為蘋(píng)果梨，右側(cè)為延光梨。

續(xù)圖2 蘋(píng)果梨與延光梨cDNA-SRAP擴(kuò)增

Continue to fig.2 cDNA-SRAP amplification of Pingguoli and Yanguangli

應(yīng)用154對(duì)引物對(duì)蘋(píng)果梨和延光梨進(jìn)行擴(kuò)增，其中，有3對(duì)引物組合(ME6-EM2、ME6-EM11、ME9-EM11)沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，剩余的151對(duì)引物均擴(kuò)增出條帶。統(tǒng)計(jì)各組引物擴(kuò)增所產(chǎn)生的帶數(shù)，除2對(duì)引物組合(ME4-EM3、ME7-EM5)擴(kuò)增出差異條帶，其余149對(duì)引物組合均擴(kuò)增出相同的條帶。每對(duì)引物組合擴(kuò)增出的條帶數(shù)為2～6條，2個(gè)樣本均擴(kuò)增出443條條帶，品種間的差異條帶為2條，多態(tài)性為0.45%。

經(jīng)測(cè)序分析，ME7-EM5擴(kuò)增出差異條帶是因?yàn)?條核苷酸序列包含內(nèi)含子序列，為模板中存在的少量DNA擴(kuò)增；對(duì)ME4-EM3擴(kuò)增出的差異片段進(jìn)行序列分析及多序列比對(duì)，并做進(jìn)一步分析。

2.3 差異片段的序列分析

將ME4-EM3擴(kuò)增出的差異條帶進(jìn)行測(cè)序后，根據(jù)測(cè)序序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)盛花期后的7個(gè)不同時(shí)期對(duì)蘋(píng)果梨與延光梨進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。經(jīng)Blast[17]比對(duì)并通過(guò)CluctalX 1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，應(yīng)用Gene Doc軟件輸出比對(duì)結(jié)果。

ME4-EM3擴(kuò)增出的差異基因長(zhǎng)936 bp，編碼311個(gè)氨基酸(圖3)。

圖3 差異基因序列及所編碼的氨基酸序列

多序列比對(duì)結(jié)果如圖4所示，此基因的氨基酸序列與梅花(Prunusmume，XP_008226191)、蘋(píng)果(Malusdomestica，XP_008383184)、大豆(Glycinemax，XP_006597996)、綠豆(Vignaradiatavar.radiata，XP_014492351)的凝集素基因同源性分別為74%、69%、40%和39%。據(jù)此基本可以判定此基因片段可能為植物凝集素基因，梁峰等[18]人研究表明，此基因與植物防御系統(tǒng)有很大的相關(guān)性。

圖4 蘋(píng)果梨植物凝集素基因其他植物的氨基酸序列對(duì)比

根據(jù)測(cè)序得到的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物并對(duì)蘋(píng)果梨和延光梨各個(gè)時(shí)期果皮進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在蘋(píng)果梨與延光梨果皮中均可擴(kuò)增出條帶(圖5)，其原因可能是用ME4-EM3這對(duì)引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，引物結(jié)合位點(diǎn)突變而產(chǎn)生多態(tài)性，根據(jù)測(cè)序結(jié)果重新設(shè)計(jì)引物時(shí)，由于位點(diǎn)發(fā)生變化而導(dǎo)致多態(tài)性消失。

1.盛花后2周；2.盛花后4周；3.盛花后6周；4. 盛花后8周；5.盛花后10周；6.盛花后12周；7.采收前1周

3 討論與結(jié)論

王月志等[19]對(duì)梨已育成的芽變品種(品系)進(jìn)行整理分析得出，果實(shí)皮色芽變由木栓等合成途徑中的基因變異引起；曾繼吾等[20]對(duì)“春甜橘”及其突變體的果皮差異分析推測(cè)，可能是由參與類(lèi)黃酮生物合成過(guò)程的基因的差異表達(dá)導(dǎo)致的二者表型差異；張俊苗等[21]對(duì)紅富士蘋(píng)果芽變的一些生物學(xué)性狀進(jìn)行分析,得出其芽變是在果品、果型等綜合性方面均優(yōu)良的變異材料。

本試驗(yàn)擬探索蘋(píng)果梨褐色芽變品種——延光梨的變異機(jī)理及其果皮褐色性狀的形成機(jī)制。利用cDNA-SRAP標(biāo)記技術(shù)篩選出2個(gè)品種間存在的差異基因片段，測(cè)序分析后得知其為植物凝集素基因[22]。根據(jù)測(cè)序結(jié)果重新設(shè)計(jì)引物利用半定量RT-PCR檢測(cè)后多態(tài)性消失，判定延光梨與蘋(píng)果梨的引物結(jié)合位點(diǎn)可能不同，從而擴(kuò)增出差異片段。而二者間不同的引物結(jié)合位點(diǎn)是否是導(dǎo)致果皮結(jié)構(gòu)甚至功能間差異的根本原因，需進(jìn)一步深入研究。

[1] 王雪，曲柏宏，鹿艷新，等.蘋(píng)果梨果皮花色素苷合成相關(guān)基因PyANS的克隆與表達(dá)分析[J].北方園藝，2016(05):108-112.

[2] Ma J N,Wang S L,Zhang K,et al.Chemical components and antioxidant activity of the peels of commercial apple-shaped pear (fruit ofPyruspyrifoliacv.pingguoli)[J].Journal of Food Science,2012,77(10):1097-1102.

[3] 金炳奎. ‘蘋(píng)果梨’褐色突變體果皮性狀形成機(jī)理的研究[D].延吉：延邊大學(xué)， 2013.

[4] 孫百靈，王旭，曲柏宏.蘋(píng)果梨果實(shí)著色相關(guān)PAL基因片段克隆及表達(dá)分析[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2012,34(01):1-5.

[5] 伊凱，閆忠業(yè)，劉志，等.蘋(píng)果芽變選種鑒定及應(yīng)用研究[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2006,23(05):745-749.

[6] Bowman K D,Gmitter F G,Moore G A,et al,Citrus-fruit sector chimeras as a genetic resource for cultivar improvement[J].Journal of the American Society for Horticultural Science,1991,116:888-893.

[7] 陸愛(ài)華，聶云，柯賢良，等.油桃極早熟新品種金山早紅[J].中國(guó)果樹(shù)，2001(05):1-2.

[8] 程昌鳳，劉昌文，程昌文，等. 汁用甜橙新品種“渝紅橙”[J].園藝學(xué)報(bào)，2009,36(01):148.

[9] 劉勇.國(guó)光蘋(píng)果芽變選種及其生物學(xué)特性研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[10] 張福興，孫慶田，劉美英，等.甜櫻桃新品種砂蜜豆的選育[J].中國(guó)果樹(shù)，2008(05):10-11.

[11] 李文濱，趙雪.2009年大豆分子標(biāo)記及輔助選擇育種研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,41(01):139-148.

[12] 趙丹,張憲紅,裴崎君,等.分子標(biāo)記在楊樹(shù)育種上的應(yīng)用[J].長(zhǎng)春大學(xué)學(xué)報(bào),2007,17(03):84-87.

[13] 李傳友，鄭洪剛，翁曼麗，等.光敏核不育水稻等位突變系的AFLP分析[J].生物工程學(xué)報(bào)，2000,16(01):95-99.

[14] 孫寧，孫建設(shè)，李增裕.蘋(píng)果砧木耐鹽突變體的篩選鑒定及RAPD分析[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,27(05):37-40.

[15] 李亞利，于鐵峰，羅愛(ài)玉，等.SRAP分子標(biāo)記在茄果類(lèi)蔬菜航天誘變育種中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015,31(28):60-64.

[16] 鞏艷明.梨極矮化突變體S基因型鑒定與DELLA蛋白編碼基因的克隆[D].延吉：延邊大學(xué)，2011.

[17] 高穎，李夢(mèng)竹，馮紫洲，等.蓖麻PAL基因片段的克隆與序列分析[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2013,28(02),179-182.

[18] 梁峰，常團(tuán)結(jié).植物凝集素的研究進(jìn)展[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版)，2002,48(02):232-238.

[19] 王月志，戴美松，張樹(shù)軍，等.我國(guó)梨芽變育成品種分析及芽變性狀變異機(jī)制研究進(jìn)展[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2012,29(04):676-682.

[20] 曾繼吾，鄧貴明，高長(zhǎng)玉，等.“春甜橘”及其突變體果皮差異相關(guān)蛋白質(zhì)組分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015,48(24):4965-4978.

[21] 張俊苗，鄧代君，史進(jìn)，等.短枝條紅型紅富士蘋(píng)果芽變的生物學(xué)特性研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016,53(02):240-247.

[22] 于敏，袁萍萍，章瑩瑩.植物凝集素的部分生物學(xué)作用分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002,30(01):155-156.

Analysis of gene expression difference of peel characters between Pingguoli and Yanguangli by cDNA-SRAP markerss

CUI Baihui, JIN Bingkui, YANG Yang, CAO Hounan，ZONG Chengwen*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Make the peel of Pingguoli and Yanguangli at 7 weeks after full bloom as materials, the difference between the two pear cultivar’s (lines) was determined by using cDNA-SRAP technology at the level of transcription. As the result, 444 bands were amplified from cDNAs of the peels of Pingguoli and Yanguangli with only 2 different bands. The two cultivars were highly related with low polymorphism of 0.45%. The 2 polymorphic bands were amplified with primer combinations of ME7-EM5 and ME4-EM3. The polymorphic bands amplified with ME7-EM5 primer combination resulted from the introns involved, whereas the polymorphic band amplified with ME4-EM3 primer combination was a partial fragment of Lectin gene revealed by blast.

Pingguoli; Yanguangli; bud sport; cDNA-SRAP

2016-04-20 基金資助:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460504)；吉林省科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(20120251)

崔百會(huì)(1990—)，女，吉林四平人，在讀碩士，研究方向?yàn)楣麡?shù)生物技術(shù)。宗成文為通信作者，

E-mail:zongchengwen@aliyun.com

1004-7999(2016)03-0192-07

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.002

S661.2

A