三氯乙烯藥疹樣皮炎患者血清miRNAs差異表達(dá)譜分析

鄭 劍，藍(lán) 濤，劉 威，鄧榮霞，李培茂，張艷芳，劉建軍，*

（1.湖 南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.深 圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 518055；3.深圳市職業(yè)病防治院，廣東 深圳 518001）

三氯乙烯藥疹樣皮炎患者血清miRNAs差異表達(dá)譜分析

鄭 劍1，2，藍(lán) 濤2，劉 威2，鄧榮霞2，李培茂3，張艷芳3，劉建軍1，2，*

（1.湖 南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.深 圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 518055；3.深圳市職業(yè)病防治院，廣東 深圳 518001）

約為20～24個(gè)核苷酸，通過(guò)與其靶基因結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，以往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miRNA調(diào)控人體內(nèi)1/3的基因表達(dá)，許多疾病的發(fā)生發(fā)展與miRNA密切相關(guān)[2]。大量研究表明miRNA可作為新的分子標(biāo)志物，但有關(guān)OMLDT的miRNA研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用基因芯片技術(shù)，篩選OMLDT與TCE接觸者血清之間的差異表達(dá)miRNA，為進(jìn)一步驗(yàn)證OMLDT生物標(biāo)志物和闡明miRNA在OMLDT發(fā)生和發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2009年1月1日—2014年12月30日入住深圳市職業(yè)病防治院的OMLDT病例34例，對(duì)照組34例。病例組入選標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照國(guó)家診斷標(biāo)準(zhǔn)《職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》[3]執(zhí)行。對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)為明確的TCE接觸史，體檢合格，均排除艾滋病、心血管、肝臟、腎臟及糖尿病等疾病。年齡、性別、居住環(huán)境等與病例組相匹配。miRNA芯片篩查選取其中5位OMLDT患者和5位對(duì)照人群的血清。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)驗(yàn)證采用34位OMLDT患者和34位對(duì)照人群的血清。

1.2 血清收集

干燥真空管采集全血(6mL)，室溫下放置20～30min，4℃、2 000 g離心10min，收集血清，于-80℃保存待用。

1.3 總RNA抽提和質(zhì)量檢測(cè)

根據(jù)miRNeasy Serum/Plasma Kit(德國(guó)Qiagen公司)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，提取血清中總RNA，使用NanoDrop 2000c測(cè)定RNA的純度和濃度。

嚴(yán)肅黨內(nèi)政治生活是加強(qiáng)黨的自身建設(shè)的基礎(chǔ)性工作，要把我們黨建設(shè)成為始終走在時(shí)代前列、人民衷心擁護(hù)、勇于自我革命、經(jīng)得起各種風(fēng)浪考驗(yàn)、朝氣蓬勃的馬克思主義執(zhí)政黨，就必須把嚴(yán)肅黨內(nèi)政治生活這一基礎(chǔ)性工作做好。習(xí)近平同志站在保持黨的馬克思主義政黨性質(zhì)、更好擔(dān)負(fù)歷史使命、全面加強(qiáng)自身建設(shè)和形成良好黨內(nèi)政治生態(tài)的戰(zhàn)略高度，對(duì)嚴(yán)肅黨內(nèi)政治生活的應(yīng)有作用給予充分肯定。

1.4 熒光探針的制備、標(biāo)記和芯片雜交

采用miRCURY LNATMARRAY Power標(biāo)記試劑盒(丹麥Exiqon公司)，用標(biāo)記酶將Hy3TM熒光基團(tuán)標(biāo)記miRNA，得到雜交探針，在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用MAUI雜交儀將標(biāo)記好的探針和miRCURY LNATM芯片雜交。

1.5 qPCR驗(yàn)證

按照miScriptⅡRT Kit試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為16℃、30min，42℃、40min，85℃、5min。按照miScript SYBR Green Kit(德國(guó)Qiagen公司)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s，40個(gè)PCR循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。以miR-93-5p為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

表1 引物序列表

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片熒光強(qiáng)度，使用GenePix Pro V6.0軟件將所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信息，通過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行差異基因表達(dá)的分析。使用軟件MeV 4.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.7 靶基因預(yù)測(cè)

使用miRWalk 2.0(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/ zmf/mirwalk2/index.html)對(duì)篩選出具有顯著差異的miRNAs進(jìn)行miRNA靶基因的預(yù)測(cè)，并將預(yù)測(cè)結(jié)果與miRanda、miRDB、RNA22、Target Scan軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，找出幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中這些miRNA共同的靶基因。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)組男性22名，女性12名，對(duì)照組男性21名，女性13名，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.63，P= 0.80)；實(shí)驗(yàn)組平均年齡(26.74±9.61)歲，對(duì)照組平均年齡(26.29±6.11)歲，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 0.226，P= 0.82)。

2.2 病例組miRNA差異表達(dá)及聚類(lèi)圖

在5位OMLDT患者(病例組)和5位對(duì)照人群(對(duì)照組)血清樣本中，提取出的總RNA D(280)/D(260)比值均在1.8～2.0之間，RNA質(zhì)量較好，能滿(mǎn)足miRNA芯片檢測(cè)要求。與對(duì)照組相比，病例組血清中共有69個(gè)差異表達(dá)miRNAs，其中高表達(dá)39個(gè)，低表達(dá)30個(gè)。應(yīng)用聚類(lèi)分析方法，將差異表達(dá)的69個(gè)miRNA芯片數(shù)據(jù)導(dǎo)入MeV 4.0軟件，得到聚類(lèi)圖(圖1)。應(yīng)用MiRanda分析軟件，搜索與OMLDT的信息，選擇與OMLDT有關(guān)的miR-199b-5p進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖1 差異表達(dá)miRNA的聚類(lèi)圖

2.3 qPCR驗(yàn)證結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2)，miR-199b-5p在OMLDT中高表達(dá)(P<0.05)。

圖2 qPCR檢測(cè)miR-199b-5p的相對(duì)表達(dá)

2.4 差異表達(dá)miRNAs的火山圖

火山圖將不同組之間差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行圖形化的展示，X軸表示miRNAs表達(dá)倍數(shù)的變化(log2轉(zhuǎn)換)，Y軸表示對(duì)應(yīng)的P值(-lg轉(zhuǎn)換)，如圖3。紅色表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且差異倍數(shù)>2倍。通過(guò)分析，共有22個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNAs。

圖3 差異表達(dá)miRNAs的火山圖

2.5 靶基因預(yù)測(cè)

通過(guò)miRWalk 2.0對(duì)篩選出來(lái)差異顯著的22個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并將預(yù)測(cè)結(jié)果與其他軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，只有miR-409-3p和miR-485-3p在 5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中都預(yù)測(cè)到了共同的靶基因，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-409-3p的靶基因是APOBEC2、CTNND1、CNTN4、ABCA13、SPRED1、GAB1、VPS41、COMMD9、 ITGB3、TAL1、MRP63、MOBKL1A、

ZNF614、MAP4K3。miR-485-3p的靶基因是GABRA4、MEOX2、NFYB、UBA6、LOC400120、GNAI1。

3 討 論

三氯乙烯是一種常見(jiàn)的有機(jī)溶劑和環(huán)境污染物。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外因職業(yè)接觸而引起的TCE中毒事件屢見(jiàn)報(bào)道，其中以職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎居多。該疾病發(fā)病迅速，缺乏特效治療藥物，具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚，嚴(yán)重危害廣大工人的健康，已成為社會(huì)高度關(guān)注的職業(yè)衛(wèi)生和公共衛(wèi)生問(wèn)題[4]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，一類(lèi)被稱(chēng)為微小RNA(microRNA，miRNA)的非編碼小RNA在疾病發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用。miRNA能夠與血液中蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，穩(wěn)定的存在于外周血中，疾病狀態(tài)下miRNA的異常表達(dá)，提示miRNA能夠作為疾病無(wú)創(chuàng)診斷的潛在生物標(biāo)志物[5]。

本研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)，建立OMLDT和三氯乙烯接觸者之間血清miRNA差異表達(dá)譜，qPCR驗(yàn)證miR-199b在OMLDT中高表達(dá)，以往的研究表明，miR-199b與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)：miR-199b在宮頸癌組織中高表達(dá)[6]，miR-199b通過(guò)靶蛋白DDR1抑制乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[7]。miR-199b在TCE處理的細(xì)胞中差異表達(dá)[8]，OMLDT是人群通過(guò)接觸TCE引起的過(guò)敏性反應(yīng)，miR-199b可能通過(guò)細(xì)胞凋亡、增殖在OMLDT發(fā)生和發(fā)展中起作用。對(duì)差異倍數(shù)2倍以上的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，miR-489、miR-409在5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中都預(yù)測(cè)到了相同的靶基因，miR-489和miR-409 可能通過(guò)調(diào)控這些靶基因在OMLDT的發(fā)生、發(fā)展中起作用，為將來(lái)進(jìn)一步研究miRNA在三氯乙烯誘導(dǎo)的藥疹樣皮炎中的機(jī)制指明了方向。其中Spred1是我們預(yù)測(cè)差異表達(dá)miR-409的靶基因，Spred1與Ras結(jié)合后，能夠抑制胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的活化，從而下調(diào) Ras-ERK-MAPK信號(hào)通路，MAPK通路在肝臟免疫損傷、肝臟損傷與修復(fù)中起著重要作用[9]，miR-409可能靶向調(diào)節(jié)Spred1的表達(dá)，通過(guò)下調(diào)MAPK信號(hào)通路，造成三氯乙烯藥疹樣皮炎患者的肝損傷。

本研究針對(duì)OMLDT，篩選了69個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，預(yù)測(cè)了其中差異表達(dá)miR-409和miR-485的靶基因，尤其是miR-199b經(jīng)qPCR驗(yàn)證后，可作為OMLDT潛在的分子標(biāo)志物，為進(jìn)一步研究OMLDT 患者血清中miRNAs標(biāo)志物提供了理論基礎(chǔ)，具有十分重要的意義。

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Differentially expressedmiRNA profile in workers with trichloroethylene-inducedmedicamentosa-like dermatitis

ZHENG Jian1，2，LAN Tao2，LIU Wei2，DENG Rongxia2，LI Peimao3，ZHANG Yanfang3，LIU Jianjun1，2，*
(1.Departmentof Preventivemedicine,medicine School ofhunan Normal University, Changsha 410013,hunan; 2.Shenzhen Center for Disease Control & Prevention, Shenzhen 518055, Guangdong; 3.Shenzhen Prevention and Treatment Center foroccupational Disease, Shenzhen 518001, Guangdong, China)

目的： 分析三氯乙烯藥疹樣皮炎(OMLDT)患者和三氯乙烯接觸者血清microRNA(miRNA)表達(dá)譜的差異。方法：分別采集5名三氯乙烯藥疹樣皮炎患者和5名接觸者血液，分離血清，抽提總RNA進(jìn)行Hy3熒光標(biāo)記，然后濃縮標(biāo)記的樣品，運(yùn)用miRCURY LNA芯片進(jìn)行miRNA芯片雜交，雜交后進(jìn)行圖像掃描，所得數(shù)據(jù)使用GenePix Pro V6.0軟件進(jìn)行miRNA差異表達(dá)分析并采用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)差異較大的miRNA用miRWalk 2.0進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并與其他預(yù)測(cè)軟件結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：OMLDT患者與三氯乙烯接觸者比較，共有69個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中低表達(dá)30個(gè)，高表達(dá)39個(gè)(包含miR-199b)。qPCR驗(yàn)證亦顯示miR-199b在OMLDT中高表達(dá)。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR409-3p和miR485-3p在5個(gè)預(yù)測(cè)軟件均預(yù)測(cè)到了共同的靶基因。結(jié)論：三氯乙烯藥疹樣皮炎患者血清miRNAs表達(dá)譜發(fā)生了顯著改變，miR-199b可能是OMLDT潛在的易感生物標(biāo)志物。

miRNA；三氯乙烯藥疹樣皮炎；靶基因預(yù)測(cè)；生物標(biāo)志物

OBJECTIVE:To profilemicroRNAs expression among workers with trichloroethylene (TCE)-inducedmedicamentosa-like dermatitis (OMLDT).METHODS：Serum samples from 5 patients with OMLDtand with TCE contacts were collected.The total RNA was extracted then labeled withhy3 fluorescent.MicroRNAs werehybridized withmiRCURY LNA chips and images were acquired using the GenePix 4000B scanner，qPCRmethod was used to verify the results ofmiRNAmicroarray.The results were further analyzed by prediction softwares.RESULTS：A total of 69microRNAs were differentially expressed betweenoMLDtand TCE contacts.Among themicroRNAs，39 were upregulated and 30 were down-regulated.Increase ofmiR-199b-5p was verified using qPCR.Target prediction results showed that the same target genes ofmiR-409-3p andmiR-485-3phad been predicted in all forecasting software.CONCLUSION：The study showed that expressionofmicroRNA in serum of workers with OMLDT was significantly altered，andmiR-199bmight serve as a candidate biomarker foroMLDT.

miRNA；occupationalmedicamentosa-like dermatitisinduced by trichloroethylene；target gene prediction；biomarkers

R394.6

A

1004-616X(2016)06-0468-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.011

2016-07-12；

2016-11-01

國(guó)家自然科學(xué)基金(81273126)；深圳市基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ 20150402102135497)；深圳市學(xué)科布局項(xiàng)目(JCYJ201604281423 16603)

作者信息： 鄭 劍，E-mail：653242262@qq.cm。*通訊作者，劉建軍，