懸浮物對褐牙鲆肌肉抗氧化酶活性及相關基因表達的影響*

肖廣俠，徐文遠，賈 磊*，鄭德斌，張 博，馬 超

(1.天津渤海水產(chǎn)研究所, 天津 300457;2.臨沂出入境檢驗檢疫局，山東 臨沂 276034)

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懸浮物對褐牙鲆肌肉抗氧化酶活性及相關基因表達的影響*

肖廣俠1，徐文遠2，賈 磊1*，鄭德斌1，張 博1，馬 超1

(1.天津渤海水產(chǎn)研究所, 天津 300457;2.臨沂出入境檢驗檢疫局，山東 臨沂 276034)

為探究褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)幼魚在懸浮物脅迫下的耐受機制，以兩種規(guī)格褐牙鲆為實驗材料，在懸浮物質量濃度為5 000，10 000 mg/L脅迫下，研究了褐牙鲆肌肉中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽轉移酶(GST)、過氧化氫酶(CAT) 酶活力及SOD2、GST、CAT的mRNA轉錄水平的變化情況。實驗結果顯示：T-SOD酶活力具有一定的變化趨勢，B幼魚T-SOD酶活力呈現(xiàn)先升高、再降低、再升高的趨勢，SOD2基因相對表達量在第48小時達到峰值(P<0.05)，兩種幼魚T-SOD基因相對表達變化趨勢在第72小時和第96小時相反；CAT酶活力呈現(xiàn)先升高、再降低的趨勢，A幼魚及5 000 mg/L實驗組B幼魚CAT基因相對表達與CAT酶活力變化趨勢一致；B幼魚GST酶活力實驗組低于對照組(P<0.05)，GST基因相對表達量在第24小時和第48小時實驗組高于對照組(P<0.05)、在第72小時和第96小時實驗組與對照組無顯著差異。研究結果表明：懸浮物對褐牙鲆抗氧化酶活力及相關基因的表達具有一定的影響；不同體長規(guī)格的褐牙鲆抗氧化酶活力及相關基因的表達存在差異；T-SOD酶活力、GST酶活力與相關基因表達量變化趨勢不一致，CAT酶活力與相關基因表達量變化趨勢一致。本研究可為揭示褐牙鲆應對懸浮物脅迫的耐受機制及褐牙鲆耐懸浮物品種選育提供基礎數(shù)據(jù)。

褐牙鲆；懸浮物；抗氧化系統(tǒng)酶；基因表達

褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)、牙鲆科(Paralichthyidae)、牙鲆屬(Paralichthys)，屬于肉食性底棲魚類，具有變態(tài)發(fā)育過程。褐牙鲆主要分布于中國黃渤海及朝鮮、日本沿岸水域，是我國重要的海水增養(yǎng)殖魚類[1]。近幾年來，人工增殖放流恢復海洋中的生物資源的措施日益受到重視，僅2014年在天津渤海灣海區(qū)放流的中國對蝦達到14億尾，褐牙鲆達到147.2萬尾。渤海由于寬陸岸淺海的特性及其特殊地理位置，再加上陸地眾多河流匯入，使其成為中國懸浮物質量最高的海域[2]；另外，隨著我國海洋經(jīng)濟的發(fā)展，港口碼頭建設及填海造地等海洋工程越來越多，在建設施工過程中產(chǎn)生大量水體底泥懸浮，導致海域懸浮物濃度大幅度升高，改變了水體的物理、化學環(huán)境[3]。將人工培育的水產(chǎn)苗種直接投放到海域中，能否適應海域自然水域環(huán)境，尤其褐牙鲆機體對懸浮物脅迫的耐受機制，在這方面尚無報道。

抗氧化系統(tǒng)酶是生物體內(nèi)應對不利環(huán)境條件的重要物質，在生物處于不適宜的生存條件下，抗氧化系統(tǒng)各種酶的活力會發(fā)生變化，來應對外界的環(huán)境脅迫，這對環(huán)境污染有一定的生物指示作用[4]。目前針對影響褐牙鲆抗氧化系統(tǒng)酶活力的研究集中于重金屬及環(huán)境因子，王凡等[5-6]研究表明SOD，CAT，GSH-PX 活性變化可以反映牙鲆在銅污染下的傷害程度，3種酶活性均表現(xiàn)為低濃度誘導、高濃度抑制；Huang等[7]和Cao等[8]分別研究了重金屬汞(Hg)及鎘(Cr)對牙鲆的抗氧化系統(tǒng)酶活力的影響及重金屬在體內(nèi)的富集情況；王茂林等[9]研究揭示了過高濃度鈣(Ca)、鎂(Mg)對褐牙鲆幼魚肝臟的SOD和CAT活性產(chǎn)生一定抑制作用；柳意樊[10]研究了不同升溫模式下，褐牙鲆和雜交鲆SOD，CAT，GSH，LZM和PK相對活力的變化情況;黃偉[11]研究了Hg，Pb，Zn對褐牙鲆仔稚魚SOD，CAT，MDA及GSH的活性的影響;Lou等[12]認為高水溫對褐牙鲆幼魚肝臟中SOD及CAT酶活性產(chǎn)生顯著影響，褐牙鲆幼魚肝臟中SOD及CAT酶活力與幼魚生長相關性顯著。徐冬冬等[13]研究表明褐牙鲆肝臟中SOD及CAT活力隨脅迫溫度升高而降低。在懸浮物對漁業(yè)生物抗氧化酶影響方面，目前也出現(xiàn)較多報道。張雪等[14]研究發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔鰓絲SOD活力對懸浮物脅迫的反應更迅速;楊國軍等[15]研究發(fā)現(xiàn)四角蛤蜊鰓絲抗氧化酶活力會對懸浮物脅迫快速更靈敏;蔣玫等[16]研究了底泥浸出液對脊尾白蝦抗氧化酶相關基因mRNA 轉錄水平表達在一定時間內(nèi)有一定的誘導作用；王廣軍等[17]的研究表明底泥懸浮物質量濃度對雜色鮑的生理生化存在一定影響。但是對懸浮物對褐牙鲆抗氧化系統(tǒng)影響方面的研究尚無報道。

針對以上情況，本實驗以兩種規(guī)格褐牙鲆幼魚為實驗材料，研究其在不同懸浮物質量濃度下體內(nèi)總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽S轉移酶(GST)、過氧化氫酶(CAT) 酶活力及SOD2，GST，CAT的mRNA轉錄水平表達變化情況，分析了褐牙鲆幼魚底泥懸浮物的耐受免疫調(diào)節(jié)機制，以期為褐牙鲆的抗逆品種選育及增殖放流提供理論依據(jù)，為進一步評估海洋工程對放流生物的損害情況提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗魚

實驗選用的褐牙鲆幼魚取自于天津市興盛水產(chǎn)有限公司，共分兩種規(guī)格：A幼魚體長(4.21±0.41) cm，B幼魚體長(14.53±1.58) cm。本研究挑選體質健康、大小均勻的個體用于實驗，兩種幼魚分別使用60條。

1.1.2 實驗用水

實驗用水為高鹽鹵水兌淡水，經(jīng)過沉淀、砂濾、次氯酸鈉(NaClO)消毒、篩絹過濾等處理。水溫：(22±1) ℃；鹽度：25～28；pH：8.0～8.2；OD：5.8～7.5 mg/L；NH4-N：0.012～0.248 mg/L；NO2-N：0.005～0.011 mg/L；NO3-N：0.287～0.363 mg/L；PO4-P：0.012～0.025 mg/L。

1.1.3 實驗底泥

實驗用懸浮物泥樣采自天津大神堂海域(117°55′18″E，39°09′01″N；位于漢沽淺海生態(tài)系統(tǒng)海洋特別保護區(qū)，在整個保護區(qū)內(nèi)具有代表性)的底泥表層，實驗室內(nèi)通風晾干，然后放于烘箱中(80 ℃)烘干至恒重，冷卻后研磨處理，用100目篩絹過篩，放置于干燥器中低溫保存。實驗所用沉積物中各成分含量檢測參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》[18]進行，分析結果見表1。其主要成分含量均符合《海洋沉積物質量標準》[19]第一類要求，不會對受試生物產(chǎn)生毒害作用。

表1 實驗底泥主要成分含量(mg/kg)Table 1 Contents of major components in the bottom sediment used for the experiments(mg/kg)

1.2 實驗方法

1.2.1 懸浮物溶液的配置方法

將烘干泥樣與海水按需濃度配置懸浮物溶液，實驗前充分攪拌，使底泥充分溶解為懸浮物。

1.2.2 懸浮物粒徑的測量

懸浮物粒徑使用維納2008D激光粒度儀測量，底泥粒徑X80=12.70 μm，粒徑X<5 μm所占的比例為29.98%，具體粒度特征見表2。

表2 實驗用底泥粒徑特征Table 2 Grain size characteristics of the bottom sediment used in the experiments

1.2.3 實驗設計

實驗參照國家標準《水質·物質對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》[20]進行，褐牙鲆幼魚暫養(yǎng)24 h后開始實驗，懸浮物溶液濃度設置為5 000和10 000 mg/L，每個質量濃度均設置5個平行組，另外設置相應的對照組(不加泥樣)，懸浮物濃度認為0 mg/L。實驗容器為15 L透明整理箱，每個整理箱加入各質量濃度懸浮物溶液10 L，放入實驗魚4尾，整個實驗過程不投餌。采用氣石均勻充氣及人工定時攪拌等方法，使底泥始終處于懸浮狀態(tài)。實驗期間不換水。懸浮物脅迫24，48，72，96 h后分別從每個實驗組隨機挑選3尾幼魚取樣。

1.2.4 樣品處理

剪取褐牙鲆幼魚背部肌肉，按照1∶10(W/V)加入預冷PBS緩沖溶液(pH=6.4)放置冰上以玻璃勻漿器勻漿，離心(4 ℃，800 g, 10 min)取上清液置-80 ℃冰箱保存用于3種抗氧化酶活性的測定，另-80 ℃冰箱保存肌肉樣本用于抗氧化酶相關基因表達的測定。

1.2.5 抗氧化酶活性的測定

T-SOD，GST，CAT酶活力測定均根據(jù)試劑盒說明書進行(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。其中37 ℃時，每分鐘每毫克組織蛋白使反應體系的吸光度(OD)值增加0.01 L/θ·cm時，定義為1個總抗氧化能力(T-SOD)單位；每毫克組織蛋白質，每分鐘扣除非酶反應的作用，使反應體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個GST酶活力單位；每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為1個CAT活力單位[21]。所有指標吸光值均使用UV-7504單光束紫外可見分光光度計測定。

1.3 抗氧化酶基因的表達

1.3.1 引物設計

根據(jù)褐牙鲆SOD2,CAT,GST的cDNA序列，以Primer 5.0設計Real-time PCR 擴增特異性引物，選擇基因穩(wěn)定表達及片段大小適合的β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列詳見表3。引物合成和cDNA 序列測定委托上海生工生物工程有限公司完成。

表3 Real-time PCR 擴增的特異性引物Table 3 Specific primers used for the real-time PCR amplification

1.3.2 總RNA提取cDNA第一鏈的合成

將保存于-80 ℃冰箱的樣品取出后于冰上融化，并按照TRizol試劑說明書提取總RNA，RNA 沉淀用DEPC水溶解，用核酸定量儀(Thermo Scientific)測定260和280 nm處的吸收值，檢測RNA的產(chǎn)量和純度，并使用1%瓊脂糖凝膠進行RNA非變性電泳檢測RNA 的完整性。取等量(2 μg)的RNA，按照All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(GeneCopoeiaCat.No.AORT-0050)說明書反轉錄各組織的總RNA，合成cDNA 第一鏈。

1.3.3 Real-time PCR 擴增

采用Real-time PCR(SYBR Green)2-△△Ct相對定量方法，按照Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒說明書進行操作，反應體系如下：SYBR?Premix Ex Super Mix (2×) 10.0 μL，F(xiàn)orward primer(10 μmol/L) 2.0 μL，Reverse primer(10 μmol/L) 2.0 μL,PCR板每個孔分別加入：DNA 1.0 μL，ddH2O 5.0 μL,反應總體積共20 μL。將樣品在PCR 管內(nèi)混勻后分裝入96孔PCR板(Axygen)中，瞬時離心后放入ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀中進行PCR 擴增，反應程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)；熔解曲線條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s。反應完成后，用ABI 7500 system軟件分析結果。

1.3.4 Comparative Delta-delta Ct相對定量

由標準曲線可知，目的基因與內(nèi)參擴增效率基本一致，均在95%以上，符合Comparative Delta-delta Ct 相對定量計算要求，Comparative Delta-delta Ct相對定量參考Livak和Schmittgen的方法[22]，目的基因的表達量定義為待測樣品與對照組中目的基因的表達差異倍數(shù)(Fold change)，計算公式為

1.4 實驗數(shù)據(jù)的處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用軟件SPSS 22.0 進行，所得數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(x±SD)表示，使用單因素方差分析ANOVA進行顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 懸浮物脅迫對褐牙鲆幼魚T-SOD 酶及基因表達的影響

懸浮物對褐牙鲆幼魚肌肉T-SOD酶活力的影響見圖1。實驗結果表明：懸浮物對褐牙鲆A幼魚在第72和第96小時時T-SOD酶活力具有誘導作用，5 000和10 000 mg/L A幼魚T-SOD酶活力分別在第96小時和第24小時達到峰值(P<0.05)；在懸浮物脅迫下，B幼魚T-SOD酶活力呈現(xiàn)先升高、再降低、再升高的趨勢，并且在第96小時時達到峰值(P<0.05)；懸浮物對兩種幼魚T-SOD酶活力在第72小時影響趨勢相反，在第96小時誘導趨勢一致。

圖1 褐牙鲆幼魚體內(nèi)T-SOD活性隨懸浮物脅迫時間的變化Fig.1 Changes of the T-SOD activity in the body of P. olivaceus with the time of SS stress

懸浮物對褐牙鲆幼魚肌肉內(nèi)SOD2基因相對表達的影響見圖2，在5 000 mg/L實驗組，A幼魚SOD2基因相對表達在24～96 h具有升高的趨勢(P<0.05)，B幼魚SOD2基因相對表達在24～96 h呈現(xiàn)先降低、再升高、再降低的趨勢；在10 000 mg/L實驗組，A幼魚SOD2基因相對表達在48～96 h呈現(xiàn)升高趨勢(P<0.05)，B幼魚SOD2基因相對表達在48～96 h呈現(xiàn)先升高、再降低的趨勢。兩種幼魚T-SOD基因相對表達都在第48小時達到峰值(P<0.05)。A幼魚T-SOD酶活力與基因表達量在第72小時和第96小時實驗組都呈現(xiàn)增高趨勢(P<0.05)，B幼魚T-SOD酶活力與基因表達量在第48小時和第96小時變化趨勢相反，在第72小時誘導趨勢一致。

圖2 褐牙鲆幼魚體內(nèi)SOD2基因相對表達量隨懸浮物脅迫時間的變化Fig.2 Changes of the relative gene expression of T-SOD in the body of P. olivaceus with the time of SS stress

2.2 懸浮物脅迫對褐牙鲆CAT酶及基因表達的影響

懸浮物對褐牙鲆幼魚肌肉內(nèi)CAT酶活力的影響見圖3，實驗結果表明：懸浮物脅迫下，兩種規(guī)格的幼魚體內(nèi)CAT酶活力均呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢，在第24小時和第48小時實驗組幼魚CAT酶活力高于對照組(P<0.05)，在第72小時和第96小時實驗組幼魚CAT酶活力低于對照組(P<0.05)，5 000和10 000 mg/L實驗組對兩種規(guī)格幼魚CAT酶活力在各時間點的誘導或者抑制趨勢一致。

圖3 褐牙鲆幼魚體內(nèi)CAT活性隨懸浮物脅迫時間的變化Fig.3 Changes of the CAT activity in the body of P. olivaceus with the time of SS stress

懸浮物對褐牙鲆幼魚肌肉內(nèi)CAT基因相對表達的影響見圖4，在懸浮物脅迫下，A幼魚及5 000 mg/L實驗組B幼魚CAT基因表達量在24～96 h呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，并且第24小時和第48小時實驗組高于對照組(P<0.05)，第72小時和第96小時實驗組低于對照組，CAT基因相對表達量在第24小時達到峰值(P<0.05)。10 000 mg/L實驗組B幼魚第72小時和第96小時CAT基因相對表達量實驗組低于對照組(P<0.05)，這與CAT酶活力的變化趨勢相同。

圖4 褐牙鲆幼魚體內(nèi)CAT基因相對表達量隨懸浮物脅迫時間的變化Fig.4 Changes of the relative gene expression of CAT in the body of P. olivaceus with the time of SS stress

2.3 懸浮物脅迫對褐牙鲆GST酶及相關基因表達的影響

懸浮物對褐牙鲆幼魚肌肉內(nèi)GST酶活力的影響見圖5，實驗結果表明：懸浮物對A幼魚在第24小時、B幼魚在第24小時和第72小時肌肉內(nèi)CAT酶活力呈現(xiàn)抑制趨勢，10 000 mg/L實驗組A幼魚在第72小時和第96小時GST酶活力高于對照組(P<0.05)，5 000 mg/L實驗組A幼魚在第48小時和第96小時GST酶活力與對照組無顯著差異。

圖5 褐牙鲆幼魚體內(nèi)GST活性隨懸浮物脅迫時間的變化Fig.5 Changes of the GST activity in the body of P. olivaceus with the time of SS stress

懸浮物對褐牙鲆幼魚肌肉內(nèi)GST基因相對表達的影響見圖6，在第24小時和第48小時懸浮物實驗組對褐牙鲆A，B幼魚GST基因相對表達誘導效果明顯，實驗組均高于對照組(P<0.05)，并且GST基因相對表達在第24小時達到峰值(P<0.05)；在第72小時和第96小時實驗組與對照組差異不顯著，實驗組在第24小時和第48小時GST基因相對表達量明顯高于第72小時和第96小時GST基因相對表達量；懸浮物對B幼魚GST酶活力與相對基因表達量在第24小時和第48小時影響趨勢相反。

圖6 褐牙鲆幼魚體內(nèi)GST基因相對表達量隨懸浮物脅迫時間的變化Fig.6 Changes of the relative gene expression of GST in the body of P. olivaceus with the time of SS stress

3 討 論

在外界環(huán)境因子的脅迫下，生物體會產(chǎn)生一種會對細胞和基因結構造成損壞的活性氧分子，主要是超氧陰離子(O2-)、羥自由基(·OH)和H2O2[23]。低濃度的活性氧對生物體具有一定的積極作用[24]，但是濃度過高的活性氧會對生物體產(chǎn)生損傷[25]。生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)能清除過量的活性氧，保護體內(nèi)各組織免受活性氧的損傷[26]，抗氧化系統(tǒng)主要包括酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑，目前針對生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)主要集中于抗氧化系統(tǒng)酶活力方面的研究。

3.1 懸浮物對褐牙鲆總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力及基因相對表達的影響

SOD是機體內(nèi)唯一以O2為底物的酶，能催化超氧化物陰離子自由基(O·2-)發(fā)生歧化反應，及時清除生物體內(nèi)的O·2-自由基，避免·OH的產(chǎn)生，在清除生物體內(nèi)有害物質時發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明，生物體的SOD酶活性與脅迫因子的強弱有關，大致表現(xiàn)為：輕度脅迫，SOD酶活力升高；重度脅迫，SOD酶活力下降[27-29]。本研究中5 000和10 000 mg/L試驗組中A幼魚在72和96 h時T-SOD酶活力變化趨勢一致，原因可能是與褐牙鲆屬于底棲魚類、對懸浮物的耐受力較強有關，懸浮物濃度并未達到對褐牙鲆T-SOD酶活力產(chǎn)生重度脅迫的作用。在懸浮物脅迫下，B幼魚T-SOD酶活力呈現(xiàn)先升高、再降低、再升高的趨勢，并且在96 h達到峰值(P<0.05)，推測原因是：在0～24 h，懸浮物脅迫可能刺激幼魚體內(nèi)產(chǎn)生較多的活性氧離子，為減少活性氧離子對機體的損害，魚體內(nèi)大量合成T-SOD酶，造成T-SOD酶活力升高，在24～72 h，魚體短暫適應了懸浮物脅迫的環(huán)境，體內(nèi)T-SOD酶合成減弱，當脅迫時間到達96 h，超過了幼魚的耐受時間，又重新誘導了體內(nèi)T-SOD酶的合成，直至T-SOD酶活力在96 h達到峰值，這與張雪等[14]對懸浮脅迫對菲律賓蛤仔對SOD影響的研究結果基本一致。

T-SOD酶活性及基因表達在受到懸浮物脅迫后，在開始的24 h或者48 h內(nèi)存在一定增加的傾向，這與Stebbing[30]提出的“毒物興奮效應”表現(xiàn)類似。但是脅迫時間過長，如B幼魚T-SOD酶活力在48和72 h及SOD2的mRNA相對表達量在72和96 h實驗組低于對照組，表明長時間懸浮物脅迫可能對褐牙鲆T-SOD酶活力及SOD2的mRNA 相對表達產(chǎn)生抑制作用。A幼魚在懸浮物脅迫下，T-SOD酶活力與SOD2的mRNA 相對表達量在72和96 h誘導一致，這與A幼魚T-SOD酶活力及SOD2的mRNA相對表達量變化趨勢相反，原因推測是與不同體長規(guī)格的褐牙鲆對懸浮物耐受力不同，體長較小的A幼魚為消除體內(nèi)過多的活性氧分子，在72和96 h T-SOD酶活力較高，而體長較大的B幼魚由于體內(nèi)較強的懸浮物耐受能力，不需要誘導過多的T-SOD酶活力表達，便可以減少活性氧分子對機體的損害。

3.2 懸浮物對褐牙鲆過氧化氫酶(CAT)活力及基因相對表達的影響

生物體在脅迫因子的影響下，機體產(chǎn)生過多的H2O2，H2O2可產(chǎn)生活性極高的羥自由基(·OH)，對生物體產(chǎn)生損傷[23]，為減輕污染因子對機體傷害，生物體可調(diào)節(jié)抗氧化水平來清除機體中羥自由基和活性氧[31-33]。CAT是一種含鐵的抗氧化酶，廣泛存在于生物體各種組織[32]，能清除體內(nèi)過多H2O2，通過Haber-Weiss反應[31]阻斷羥自由基(·OH)的產(chǎn)生，保持機體正常的生理功能。外源環(huán)境脅迫因子會造成細胞膜損傷，導致細胞膜透性增加，由于Haber-Weiss反應使CAT活性下降，而細胞內(nèi)H2O2的水平不會產(chǎn)生大幅度變化[33]。

A幼魚CAT酶活力及基因相對表達量變化趨勢一致，都呈現(xiàn)先誘導、再抑制趨勢，這表明CAT酶活力與基因相對表達存在較為明顯的正相關關系。另外，懸浮物對CAT酶活力的影響可能存在一定的時間效應關系，所以在48 h以前CAT酶活力及A魚CAT基因相對表達被誘導(P<0.05)，在48～96 h時CAT酶活力及A魚CAT基因相對表達被抑制(P<0.05)，這與Stebbing[30]提出的“毒物興奮效應”表現(xiàn)類似，也與蔣玫等[16]在底泥浸出液對脊尾白蝦CAT酶活力及基因表達研究、楊國軍等[15]在懸浮物對四角蛤蜊鰓CAT酶活力的研究結果一致。短時間脅迫會誘導褐牙鲆幼魚體內(nèi)的CAT酶活力，產(chǎn)生較多的CAT酶，來減輕懸浮物脅迫對機體的傷害，清除體內(nèi)由于懸浮物脅迫產(chǎn)生的過多活性氧。當脅迫時間超過一定的限度，可能是褐牙鲆適應了脅迫環(huán)境，也可能是過長時間脅迫超過了褐牙鲆的耐受限度，造成了褐牙鲆CAT酶活力及基因相對表達量的下降。懸浮物脅迫下，兩種規(guī)格的褐牙鲆CAT酶活力及基因表達相對量誘導或者抑制時間相一致，這表明，褐牙鲆肌肉內(nèi)CAT的mRNA相對表達量與蛋白酶活性一致。

3.3 懸浮物對褐牙鲆谷胱甘肽轉移酶(GST)活力及基因相對表達的影響

作為生物體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分之一，GST參與生物機體的解毒代謝和抗氧化等過程，在生物體對各類來源的有毒物質的降解過程中均起著重要作用。GST的主要作用機制是催化谷胱甘肽(GSH)的巰基與一些內(nèi)源性有毒物質(過氧化物)和外源性有毒物質(醌類化合物、α,β-不飽和羰基化合物)進行軛合反應，消除這些物質的毒性，保護機體內(nèi)蛋白質免受有毒物質的損傷，從而達到維持機體正常生理環(huán)境的目的[34-35]。在本文研究中，懸浮物對A幼魚24 h、B幼魚24～72 h肌肉內(nèi)CAT酶活力呈現(xiàn)抑制趨勢，這與王凡等[5]的較高濃度Cu2+對牙鲆GSH-PX的活性產(chǎn)生抑制研究結果相一致，原因可能是當脅迫因子的濃度高于一定程度時，生物體內(nèi)GST酶未能及時清除體內(nèi)產(chǎn)生的有害物質，導致生物體細胞結構受到破壞，細胞中酶活性又逐漸下降[28]。A幼魚在48 h以后GST酶活力趨勢不明顯，這可能與不同體長大小的魚GST酶活力對懸浮物耐受力不同有關，一般來講，魚體越大，對外界脅迫因子的耐受力越強，B規(guī)格魚體內(nèi)GST酶活力下降，說明一部分GST酶可能進行降解因懸浮物脅迫機體內(nèi)產(chǎn)生的有毒物質，保護體內(nèi)一些蛋白質免受損傷，以達到保護機體維持正常的生命代謝活動。

褐牙鲆GST基因相對表達量在24～48 h內(nèi)呈現(xiàn)明顯的誘導效應，但在72～96 h與對照組無顯著差異，表明在24～48 h懸浮物脅迫誘導了GSTmRNA的相對表達，但是此階段內(nèi)幼魚GST酶活力并未呈現(xiàn)增加的趨勢，褐牙鲆GST酶活力與mRNA相對表達量不一致，推測原因如下：第一、mRNA表達水平與蛋白水平不一定完全一致，可能有時間上的差異；第二、蛋白質檢測方法的不同，在具體的酶活力測定實驗中受到的干擾也有可能造成結果的差異；第三、mRNA的表達與蛋白的表達水平的線性關系只有0.4～0.5左右，影響蛋白質半衰期的因素(mRNA 轉錄后的調(diào)控、各種翻譯后的修飾)較多，這些因素都可能造成蛋白質水平與mRNA表達水平的不一致[36]。

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Received: December 10, 2015

Effects of Suspended Substances on Antioxidant Enzyme Activities in Muscle ofParalichthysolivaceusand Related Gene Expressions

XIAO Guang-xia1, XU Wen-yuan2, JIA Lei1, ZHENG De-bin1, ZHANG Bo1, MA Chao1

(1.BohaiFisheriesResearchInstituteofTianjin, Tianjin 300457, China; 2.LinyiEntry-ExitInspectingandQuarantineBureau, Linyi 276034, China)

In order to study the tolerance mechanism of juvenile ofParalichthysolivaceusisunder the stress of suspended substances (SS), two sizes ofP.olivaceusare chosen as the experimental material and the activities of total superoxide dismutase (T-SOD), catalase (CAT), glutathions S-transferase (GST) in the muscle ofP.olivaceusand the changes in mRNA transcription levels of SOD2, CAT and GST are studied under the conditions of suspended substance concentrations of 5 000 mg/L and 10 000 mg/L. The experimental results show that the enzyme activity of T-SOD has a certain changing tendency: in the B size of juvenile the enzyme activity of T-SOD shows a trend of first increased-then decreased and then increased again and the relative gene expression of T-SOD reaches to the peak value (P<0.05) in 48 h. The relative gene expressions of T-SOD in the two sizes of juveniles show an opposite changing tendency in 72 h and 96 h. The enzyme activity of CAT tends to increase first and then to decrease and the relative gene expressions of CAT in the A size of juvenile and the B size of juvenile tested under the condition of 5 000 mg/L are consistent in their changing tendency with the CAT enzyme activity. The enzyme activity of GST in the B size of juvenile is lower in the experimental groups than that in the control group (P<0.05). The relative gene expression of GST is higher in the 24 h and 48 h experimental groups than that in the control group (P<0.05), but shows no significant difference in the 72 h and 96 h experimental groups and the control group. All these results indicate that the SS has a certain effect on the antioxidant enzyme activities and gene expressions ofP.olivaceusand different size ofP.olivaceusvaries in the antioxidant enzyme activity and gene expression. The enzyme activities of T-SOD and GST differ in their changing trends from the relative gene expression, whereas the changing trend of the CAT enzyme activity is consistent with that of the relative gene expression. This study may provide basic data not only for studying the tolerance mechanism ofParalichthysolivaceusisunder the SS stress, but also for breeding theP.olivaceusspecies which can be tolerant of suspended substances.

Paralichthysolivaceus; suspended substances(SS); antioxidant system enzyme; gene expression

2015-12-10

天津市水產(chǎn)局青年科技創(chuàng)新項目——懸浮物脅迫對褐牙鲆存活、抗氧化系統(tǒng)酶活力及基因表達的研究(J2014-02)；天津市農(nóng)委農(nóng)業(yè)科技合作項目——海水新品種的引進及示范(201304070)；國家鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術體系項目——天津綜合試驗站建設(CARS-05-z01)；天津市科技計劃項目——海珍品高效養(yǎng)殖技術集成與應用(15zxbfnc00100)；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉化項目——鲆鰈類高效生態(tài)養(yǎng)殖技術的集成與示范(2014GB2A100531)

肖廣俠(1984-)，男，工程師，碩士，主要從事水產(chǎn)動物遺傳育種及增殖放流評估方面研究. E-mail:gxxiao@163.com

*通訊作者：賈 磊(1983-)，男，高級工程師，碩士，主要從事苗種培育及生態(tài)養(yǎng)殖方面研究. E-mail: tianjinbohaisuo@163.com

Q945.78

A

1671-6647(2016)04-0542-11

10.3969/j.issn.1671-6647.2016.04.010