PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞的毒性作用

秦喆，侯海燕，徐忠偉，張利文，韓斌，吳思雨，陳亞瓊

·論著·

PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞的毒性作用

秦喆，侯海燕，徐忠偉，張利文，韓斌，吳思雨，陳亞瓊

目的：探討大氣中的PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞的毒性作用。方法：采用0，30，60，120和200 μg/mL 5個濃度的PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞染毒24 h，以0 μg/mL濃度為對照組，其余濃度為不同劑量PM2.5染毒組，通過CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒測定細(xì)胞存活率；激光全息細(xì)胞分析及成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞3D形態(tài)及動態(tài)監(jiān)測24 h內(nèi)各組細(xì)胞數(shù)量變化；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞生長周期；彗星試驗檢測細(xì)胞DNA損傷水平；活性氧簇（ROS）檢測試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果：60，120和200 μg/mL濃度組細(xì)胞存活率及增殖能力低于對照組（P＜0.05或P＜0.01）；PM2.5可使HTR8-SVneo細(xì)胞的生長周期阻滯在G2/M期（P＜0.05或P＜0.01）；不同濃度PM2.5染毒組彗尾DNA百分比均高于對照組（P＜0.01），且呈劑量依賴性。各濃度染毒組細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生均高于對照組（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞有一定毒性作用，造成DNA的損傷，阻礙細(xì)胞生長周期，這種毒性作用可能與氧自由基的產(chǎn)生增多有關(guān)。

空氣污染物；滋養(yǎng)細(xì)胞；細(xì)胞毒性

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：449-453）

PM2.5（particulate matter 2.5）是空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm的大氣固態(tài)與液態(tài)顆粒物質(zhì)的總稱，粒徑小，比表面積大，彌散距離遠(yuǎn)，可攜帶多種有毒物質(zhì)進(jìn)入人體肺泡沉積，并穿過肺泡氣血屏障進(jìn)入血液。PM2.5與多種疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān)，危害人類健康，成為目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。許多學(xué)者通過體內(nèi)、體外實驗聚焦于PM2.5對呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)的損傷作用及其相關(guān)機(jī)制，其對生殖系統(tǒng)的影響卻大多集中于流行病學(xué)調(diào)查層面。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5與不良妊娠結(jié)局有關(guān)，如造成胚胎停育、胎盤早剝、低出生體質(zhì)量兒等[1-4]，其具體機(jī)制卻鮮有提及。HTR8-SVneo細(xì)胞是永生化的人類早孕胎盤絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞，HTR8-SVneo細(xì)胞的正常增殖與分化是胎盤形成及發(fā)揮生理功能的重要保證，由于其無限傳代的特性常被用于藥物或毒物與妊娠關(guān)系的研究。本文以HTR8-SVneo細(xì)胞為研究對象，探討PM2.5對其細(xì)胞毒性作用，以探討PM2.5致不良妊娠結(jié)局的具體機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細(xì)胞人絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8-SVneo細(xì)胞系由加拿大Graham教授惠贈。

1.1.2試劑與儀器①試劑：胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Hyclone公司），CCK-8（Cell Counting Kit-8）檢測試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），流式細(xì)胞周期試劑盒（美國Biolegend公司），活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。②儀器：TH-1000C型空氣采樣器（天虹儀器有限責(zé)任公司，武漢），CO2恒溫三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司），超凈工作臺（新加坡藝思高科技有限公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），激光全息細(xì)胞分析及成像系統(tǒng)（瑞典Phiab公司），高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司），全波長酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）。

1.2方法

1.2.1PM2.5懸濁液的配置中國環(huán)境科學(xué)院提供儀器和技術(shù)支持，利用玻璃纖維濾膜，使用TH-1000C型空氣采樣器采集2015年11月天津醫(yī)科大學(xué)周圍大氣中的PM2.5顆粒物，吸氣流量約為1.2 m3/min，一次連續(xù)采樣24 h。將吸附有PM2.5的石英濾膜剪成1 cm×1 cm的方塊，置于250 mL的廣口玻璃瓶中，加入100 mL超純水，將盛有剪好的濾膜和超純水的廣口瓶置于超聲波清洗儀中，4℃恒溫，超聲清洗60 min后用8層紗布過濾，將濾液4℃，12 000 r/min，30 min離心棄上清，沉淀真空冷凍干燥24 h，凍干后PM2.5呈灰黑色絮狀物，紫外線照射0.5 h后用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）配置成20 mg/mL的染毒母液。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)HTR8-SVneo細(xì)胞用含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），1%谷氨酰胺，1%丙酮酸鈉，1%青-鏈霉素，1%4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640培養(yǎng)基，37℃，10%O2，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測常規(guī)培養(yǎng)消化細(xì)胞，以3×103/孔密度接種細(xì)胞于96孔板中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，1 500 r/min，5 min離心，棄上清，實驗組每孔加入不同濃度染毒溶液（10，20，40，60，80，100，120，160和200 μg/mL PM2.5）培養(yǎng)24 h，實驗設(shè)立陰性對照組（含有培養(yǎng)基加細(xì)胞，無PM2.5染毒液）和空白對照組（僅有培養(yǎng)基），每孔加入20 μL CCK-8，孵育3 h后，酶標(biāo)儀讀取A450吸光度值。存活率=（實驗組－空白對照）/（陰性對照－空白對照）×100%。

1.2.4全息細(xì)胞儀觀察細(xì)胞3D形態(tài)及動態(tài)監(jiān)測HTR8-SVneo細(xì)胞數(shù)的變化常規(guī)培養(yǎng)消化細(xì)胞，以2×105/孔密度接種細(xì)胞于六孔板常規(guī)培養(yǎng)24 h后，每孔加入不同濃度染毒溶液（0，30，60，120和200 μg/mL PM2.5）后，用激光全息細(xì)胞分析及成像系統(tǒng)每隔20 min進(jìn)行一次細(xì)胞計數(shù)，監(jiān)測24 h內(nèi)的細(xì)胞增殖情況。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞周期的影響常規(guī)培養(yǎng)消化細(xì)胞，以105/孔密度接種細(xì)胞于六孔板常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集各孔細(xì)胞至1.5 mL環(huán)氧樹脂（Epoxy epoxide，EP）管中，吸凈管中PBS后逐滴加入預(yù)先配制好的預(yù)冷的75%乙醇，滴加的同時輕柔震蕩，-20℃固定。PBS洗固定后的細(xì)胞2次，各管加入500 μL含0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X 100），100 μg/mL核糖核酸酶A、50 μg/mL碘化丙啶的PBS，避光孵育0.5 h后上機(jī)。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.6單細(xì)胞凝膠電泳實驗（彗星實驗）檢測PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞的DNA損傷作用常規(guī)消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。取100 μL于45℃水浴中保溫的0.5%正常熔點瓊脂糖，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠，蓋玻片推勻，不能有氣泡，4℃凝固5～8 min。水平取下蓋片，取100 μL于37℃水浴中保溫的1%低熔點瓊脂糖與100 μL細(xì)胞懸液（約400個細(xì)胞）混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4℃凝固5～8 min。將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，在4℃下裂解1～3 h。取出膠板，用雙蒸水浸沒漂洗后放入電泳槽中，浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋30 min～1 h。玻片水平放置陽極端附近，4℃電泳20～25 min（25 V，300 mA）?？稍陔娪静壑車颖鶋K以保持低溫。電泳結(jié)束后將膠板浸泡于中和液中，每次10min，中和3次，每次要更換中和液。最后晾干。取出膠板，碘化丙啶（5 mg/mL）染色，暗處染色5～10 min。蒸餾水漂洗2次，每次5 min。稍晾干，濾紙吸去多余水分，盡快在熒光顯微鏡下觀察，利用彗星分析軟件（CometAssaySoftwareProject，CASP）分析圖像。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.7HTR8-SVneo細(xì)胞氧化指標(biāo)的檢測各組細(xì)胞ROS含量的檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋熒光探針2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFHDA），使終濃度為10 μmol/L。收集消化后的細(xì)胞，懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為106個/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用熒光酶標(biāo)儀檢測。實驗獨立重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞3D形態(tài)HTR8-SVneo細(xì)胞正常形態(tài)為梭形，且輪廓清晰。隨著PM2.5染毒劑量的增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，輪廓逐漸模糊。見圖1（見封三）。

2.2CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測結(jié)果不同濃度染毒組的細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=21.74，P＜0.05）；與對照組（0 μg/mL）相比，120 μg/mL和200 μg/mL PM2.5染毒組的細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2。

圖2　各組HTR8-SVneo細(xì)胞存活率比較

2.324h內(nèi)細(xì)胞增殖情況各組細(xì)胞增殖力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=108.8，P＜0.01），其中與對照組（0 μg/mL）相比，30 μg/mL PM2.5染毒組細(xì)胞增殖能力變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），隨著染毒濃度的增加，60、120和200 μg/mL PM2.5染毒組的細(xì)胞增殖能力逐漸減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。見圖3（見封三）。

2.4PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞周期的影響隨著PM2.5濃度增加，G2/M期細(xì)胞數(shù)逐漸增多，各組G2/ M期細(xì)胞數(shù)分別為（20.84±2.61）個、（49.10±6.14）個、（53.72±6.72）個、（61.37±7.67）個和（61.96±7.75）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.42，P＜0.01）。與對照組（0 μg/mL）相比，不同濃度PM2.5染毒組的G2/M期細(xì)胞數(shù)均升高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖4（見封三）。

2.5PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞DNA的損傷作用不同濃度組的細(xì)胞彗尾DNA百分比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=156.5，P＜0.01），其中60，120和200 μg/mL PM2.5染毒組的細(xì)胞彗尾DNA百分比大于對照組，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖5（見封三）。

2.6HTR8-SVneo細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測定不同濃度組細(xì)胞內(nèi)ROS含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 39.87，P＜0.01）。60，120和200 μg/mL PM2.5染毒組細(xì)胞內(nèi)ROS含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖6。

圖6　PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

3　討論

滋養(yǎng)細(xì)胞來源于胚胎外胚層，是構(gòu)成胎盤的主要細(xì)胞，在妊娠早期適度侵入子宮蛻膜和血管，促進(jìn)胎盤著床及子宮螺旋動脈的重塑，確保胚胎正常植入以及胎兒足夠的血液供應(yīng)。因此，滋養(yǎng)細(xì)胞正常的增殖能力與生物學(xué)功能是妊娠成功的先決條件。以HTR8-SVneo細(xì)胞為研究對象，探討PM2.5對滋養(yǎng)細(xì)胞的毒性作用對于了解PM2.5致不良妊娠結(jié)局的具體機(jī)制具有重大意義。

3.1PM2.5降低HTR8-SVneo細(xì)胞的增殖能力

HTR8-SVneo是永生化的人絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞，具有和原代滋養(yǎng)細(xì)胞相同的生物性狀。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞增殖均有一定影響，CCK-8細(xì)胞毒性檢測與激光全息細(xì)胞分析及成像系統(tǒng)均顯示PM2.5影響細(xì)胞的正常增殖且存在劑量依賴效應(yīng)。研究已證實PM2.5對細(xì)胞增殖的抑制作用，例如，人類肺成纖維細(xì)胞經(jīng)100～200 μg/mL的PM2.5染毒24 h后存活率降為81%～91%[5]。烹調(diào)油煙中的細(xì)顆粒物PM2.5對胎鼠AECⅡ細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈時間-反應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)關(guān)系，其中200 μg/mL PM2.5造成AECⅡ細(xì)胞存活率約為50%[6]。本研究通過全息細(xì)胞儀觀察染毒24 h后各組細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，隨著染毒濃度增加，細(xì)胞輪廓逐漸模糊，說明HTR8-SVneo細(xì)胞經(jīng)PM2.5染毒后細(xì)胞膜完整性受損，與同類研究結(jié)果類似[7]。

3.2PM2.5使HTR8-SVneo細(xì)胞周期發(fā)生阻滯一個完整的細(xì)胞周期包括4個階段，分別為G1期、S期、G2期和M期，G1期是從有絲分裂到DNA復(fù)制前的一段時期，主要是RNA和蛋白質(zhì)的合成，為S期細(xì)胞質(zhì)和DNA的合成與復(fù)制做準(zhǔn)備。S期為DNA合成期，在此期除了合成DNA外，同時還要合成組蛋白。G2期DNA合成結(jié)束，M期即細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。細(xì)胞停留在G1或G2期過久則說明發(fā)生了阻滯，細(xì)胞周期阻滯受到一系列分子機(jī)制的調(diào)控，使得細(xì)胞DNA在S期復(fù)制或M期分裂時免受損害，避免錯誤的遺傳信息進(jìn)入子代細(xì)胞，保持細(xì)胞遺傳特性的穩(wěn)定性。細(xì)胞周期阻滯是細(xì)胞對外界刺激的一種保護(hù)效應(yīng)，G1期阻滯可以提供充足的時間誘導(dǎo)受損DNA的修復(fù)。細(xì)胞經(jīng)過G2/M這一調(diào)控點即進(jìn)入有絲分裂階段，G2/M期則確保細(xì)胞精準(zhǔn)地完成有絲分裂過程。若一些損傷的DNA未經(jīng)修復(fù)直接進(jìn)入下一個細(xì)胞周期階段，這種損傷將會導(dǎo)致遺傳的不穩(wěn)定性[8]。研究表明，PM2.5可影響多種細(xì)胞的生長周期。Deng等[9]用源于沙塵暴的PM2.5以及正常來源PM2.5處理人類肺纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)G2/M期細(xì)胞數(shù)顯著增多。另有研究發(fā)現(xiàn)PM2.5在抑制原發(fā)性胎兒肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞ACEⅡ增殖的同時使ACEⅡ細(xì)胞生長周期阻滯在sub-G1與G1期，并且由細(xì)胞周期蛋白/細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin/CDK）復(fù)合物嚴(yán)格調(diào)控，驗證了PM2.5對細(xì)胞增殖的抑制作用與細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)的猜想[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著PM2.5染毒劑量的增加，G2/M期細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，PM2.5可以影響多種細(xì)胞的有絲分裂周期，例如PM2.5通過氧化應(yīng)激ROS增多激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路，造成大鼠胚胎細(xì)胞G1/S期阻滯[10]。Longhin等[11]發(fā)現(xiàn)PM2.5激活了P53-Chk2通路造成BEAS-2B細(xì)胞G2/M期阻滯。Abbas等[12]發(fā)現(xiàn)PM2.5通過TP53-RB通路造成L132細(xì)胞G2期阻滯。由此可見，PM2.5對細(xì)胞周期的影響依賴于細(xì)胞種類的不同，并且涉及不同的通路，筆者認(rèn)為PM2.5對細(xì)胞增殖能力的抑制作用與其對細(xì)胞周期進(jìn)程的影響關(guān)系密切，PM2.5使HTR8-SVneo細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，而具體分子機(jī)制有待探討。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)殺蟲劑苯菌靈降低HTR8-SVneo細(xì)胞在G0/G1期的比例，使細(xì)胞停留在G2/M期，因為苯菌靈可以結(jié)合紡錘體微管蛋白破壞其裝配，在有絲分裂期間影響細(xì)胞周期進(jìn)程[13]，因此筆者推測，PM2.5可能同樣影響HTR8-SVneo細(xì)胞內(nèi)紡錘體的裝配從而改變細(xì)胞生長進(jìn)程。

3.3PM2.5通過氧化應(yīng)激造成HTR8-SVneo細(xì)胞DNA損傷已知PM2.5誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激是其細(xì)胞毒性的主要分子機(jī)制[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，多環(huán)芳烴類污染物苯并芘（BaP）可以刺激HTR8-SVneo細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，而BaP又是PM2.5的組成成分[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，HTR8-SVneo細(xì)胞經(jīng)不同濃度PM2.5染毒后ROS產(chǎn)生量亦增多，驗證了本課題組對PM2.5誘發(fā)HTR8-SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激的猜想。既往研究表明，PM2.5誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員，以及缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、核因子κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子的激活關(guān)系密切，同時ROS作為一個信號分子開啟Nrf-2防御機(jī)制，通過磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路的激活抵御氧化應(yīng)激[14]。有研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞A549經(jīng)PM2.5染毒后，在G2/M期產(chǎn)生的ROS最多，考慮為G2/M期的細(xì)胞中線粒體含量高所致[16-17]。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為PM2.5造成HTR8-SVneo細(xì)胞產(chǎn)生ROS增多與其造成細(xì)胞G2/M期阻滯有關(guān)，但是否涉及其他通路有待進(jìn)一步研究。

氧化應(yīng)激造成的DNA損傷包括8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的形成和DNA鏈斷裂。彗星實驗是一種通過檢測DNA鏈損傷來判別遺傳毒性的技術(shù)，當(dāng)各種內(nèi)源性和外源性DNA損傷因子誘發(fā)細(xì)胞DNA鏈斷裂時，在堿性電解質(zhì)的作用下，DNA發(fā)生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來。由于這些DNA的分子質(zhì)量小且堿變性為單鏈，所以在電泳過程中帶負(fù)電荷的DNA會離開核DNA向正極遷移形成“彗星”狀圖像，而未受損傷的DNA部分保持球形。DNA受損越嚴(yán)重，產(chǎn)生的斷鏈和斷片越多，長度也越大，在相同的電泳條件下遷移的DNA量就愈多，遷移的距離就愈長。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著PM2.5濃度的增加，彗尾DNA含量增多，即證實了PM2.5對HTR8-SVneo細(xì)胞DNA的損傷作用，與許多同類研究結(jié)果類似[18-20]。因此可以確定的是，PM2.5誘導(dǎo)HTR8-SVneo細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激后進(jìn)一步損傷細(xì)胞DNA造成遺傳毒性。

綜上所述，PM2.5可以影響HTR8-SVneo細(xì)胞的生長周期從而抑制其增殖過程，同時誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激造成DNA的損傷。PM2.5對于HTR8-SVneo細(xì)胞的毒性作用可能是其造成不良妊娠結(jié)局的潛在機(jī)制。

[1]Sun X，Luo X，Zhao C，et al.The associations between birth weight and exposure to fine particulate matter(PM2.5)and its chemical constituents during pregnancy:A meta-analysis[J].Environ Pollut，2016，211：38-47.

[2]Arroyo V，Díaz J，Carmona R，et al.Impact of air pollution and temperature on adverse birth outcomes:Madrid,2001-2009[J]. Environ Pollut，2016，218：1154-1161.

[3]Pereira G，Evans KA，Rich DQ，et al.Fine Particulates,Preterm Birth,and Membrane Rupture in Rochester,NY[J].Epidemiology，2016，27（1）：66-73.

[4]Yang L，Wang Y，Lin Z，et al.Mitochondrial OGG1 protects against PM2.5-induced oxidative DNA damage in BEAS-2B cells[J].Exp Mol Pathol，2015，99（2）：365-373.

[5]賈玉巧，趙曉紅，郭新彪，等.大氣顆粒物PM10和PM2.5對人肺成纖維細(xì)胞及其炎性因子分泌的影響[J].環(huán)境與健康雜志，2011，28（3）：206-208.

[6]汪磊，王勇，操基玉，等.烹調(diào)油煙中細(xì)顆粒物對胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的遺傳毒性[J].中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2012，35（3）：210-212.

[7]王偉，程碩，談明光，等.上海市吳淞地區(qū)大氣PM2.5兩種提取成分的細(xì)胞毒性研究[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2005，22（4）：299-302.

[8]Liu Y，Chen YY，Cao JY，et al.Oxidative stress,apoptosis,and cell cycle arrest are induced in primary fetal alveolar type II epithelial cells exposed to fine particulate matter from cooking oil fumes[J]. Environ Sci Pollut Res Int，2015，22（13）：9728-9741.

[9]Deng F，Guo X，Liu H，et al.Effects of dust storm PM2.5 on cell proliferation and cell cycle in human lung fibroblasts[J].Toxicol In Vitro，2007，21（4）：632-638.

[10]Yuan X，Wang Y，Li L，et al.PM2.5 induces embryonic growth retardation:Potential involvement of ROS-MAPKs-apoptosis and G0/G1 arrest pathways[J].Environ Toxicol，2015 Oct 15.[Epub ahead of print]

[11]Longhin E，Holme JA，Gutzkow KB，et al.Cell cycle alterations inducedbyurbanPM2.5inbronchialepithelialcells: characterization of the process and possible mechanisms involved [J].Part Fibre Toxicol，2013，10：63.

[12]Abbas I，Verdin A，Escande F，et al.In vitro short-term exposure to air pollution PM2.5-0.3 induced cell cycle alterations and genetic instability in a human lung cell coculture model[J].Environ Res，2016，147：146-158.

[13]Zhou J，Xiong K，Yang Y，et al.Deleterious effects of benomyl and carbendazim on human placental trophoblast cells[J].Reprod Toxicol，2015，51：64-71.

[14]Deng X，Rui W，Zhang F，et al.PM2.5 induces Nrf2-mediated defense mechanisms against oxidative stress by activating PIK3/ AKT signaling pathway in human lung alveolar epithelial A549 cells[J].Cell Biol Toxicol，2013，29（3）：143-157.

[15]章艷燕，侯海燕，陳曉，等.五味子乙素對苯并芘致HTR8-SVneo細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2015，34（3）：181-183.

[16]Vattanasit U，Navasumrit P，Khadka MB，et al.Oxidative DNA damage and inflammatory responses in cultured human cells and in humans exposed to traffic-related particles[J].Int J Hyg Environ Health，2014，217（1）：23-33.

[17]Yamamori T，Yasui H，Yamazumi M，et al.Ionizing radiation inducesmitochondrialreactiveoxygenspeciesproduction accompanied by upregulation of mitochondrial electron transport chain function and mitochondrial content under control of the cell cycle checkpoint[J].Free Radic Biol Med，2012，53（2）：260-270.

[18]Gao ZX，Song XL，Li SS，et al.Assessment of DNA Damage and Cell Senescence in Corneal Epithelial Cells Exposed to Airborne Particulate Matter(PM2.5)Collected in Guangzhou,China[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2016，57（7）：3093-3102.

[19]Bocchi C，Bazzini C，F(xiàn)ontana F，et al.Characterization of urban aerosol:seasonal variation of mutagenicity and genotoxicity of PM2.5,PM1 and semi-volatile organic compounds[J].Mutat Res，2016，809：16-23.

[20]YangL，WangWC，LungSC，etal.Polycyclicaromatic hydrocarbons are associated with increased risk of chronic obstructive pulmonary disease during haze events in China[J].Sci Total Environ，2017,574:1649-1658.

[本文編輯秦娟]

Cytotoxicity of PM2.5 on HTR8-SVneo Cells

QIN Zhe,HOU Hai-yan，XU Zhong-wei，ZHANG Li-wen，HAN Bin，WU Si-yu,CHEN Ya-qiong.
Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（QIN Zhe，HOU Hai-yan，WU Siyu，CHEN Ya-qiong）；Central Laboratory，Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（QIN Zhe,XU Zhong-wei）；Peking Union Medical College Hospital，China Academy of Sciences，Beijing 100730，China（HOU Hai-yan）；School of Public Health，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China（ZHANG Li-wen）；State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment，Chinese Research Academy of Environmental Sciences，Beijing 100012，China（HAN Bin）

CHEN Ya-qiong，E-mail:chenyq82@hotmail.com

Objective:To investigate the cytotoxicity of atmospheric PM2.5 on HTR8-SVneo cells. Methods:The in vitro cultured HTR8-SVneo cells were exposed to PM2.5 at the concentrations of 0,30,60,120 and 200 μg/mL for 24 h.The cells treated with 0 μg/mL PM 2.5 were used as the control group.The cell survival rate was analyzed by the CCK-8 cell proliferation and cytotoxicity test kits.The 3D morphology was observed by the Laser holographic cell analysis and imaging system.The change in the number of cells was also dynamically monitored.The cell cycle was detected by flow cytometry.The level of DNA damage was detected by comet assay. The level of intracellular reactive oxygen species（ROS）was measured by the ROS kits.Results:The survival rate and proliferation ability in three groups treated with 60,120 and 200 μg/mL PM2.5 were significantly lower than those in the control group（P＜0.05 or P＜0.01）.PM2.5 treatment made the growth cycle arrest in G2/M phase（P＜0.05 or P＜0.01）.The percentage of tail DNA in the PM2.5 exposure groups was higher than that in the control group（P＜0.01）,with a dose-dependent manner.The level of ROS in the PM2.5 exposed groups was higher than that in the control group（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusions:PM2.5 has a certain cytotoxicity on HTR8-SVneo cells via the DNA damage and the cell cycle arrest which is related to the increased oxygen free radicals.

Air pollutants；Trophoblast cell；Cytotoxicity

國家自然科學(xué)基金（81402691）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃重點項目（15JCZDJC36000）

300162天津，中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（秦喆，侯海燕，吳思雨，陳亞瓊）；中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院中心實驗室（秦喆，徐忠偉）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院（侯海燕）；天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（張利文）；環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險評估國家重點實驗室，中國環(huán)境科學(xué)研究院（韓斌）

陳亞瓊，E-mail：chenyq82@hotmail.com

（2016-09-10）