毛竹阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶的基因克隆、原核表達(dá)及純化

屈亞平，張智俊，王超莉，王 蕾，吳林軍

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

毛竹阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶的基因克隆、原核表達(dá)及純化

屈亞平，張智俊，王超莉，王 蕾，吳林軍

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

毛竹Phyllostachys edulis阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶（PeKdsD）是2-酮-3-脫氧辛糖酸（KDO）生物合成途徑的第1個關(guān)鍵酶。采用逆轉(zhuǎn)錄實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）克隆得到毛竹KdsD基因。該基因cDNA全長1 038 bp，編碼346個氨基酸；對不同物種來源的KdsD氨基酸序列進(jìn)行比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明：毛竹的KdsD與玉米Zea mays等植物來源的KdsD有很高的序列一致性，而與微生物來源的KdsD序列一致性較低。毛竹不同組織實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）結(jié)果表明：PeKdsD基因在葉中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織。在大腸埃希菌Escherichia coli原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得了KdsD的可溶性高表達(dá)蛋白，將大量表達(dá)的重組蛋白經(jīng)過Ni-NTA親和層析和分子篩層析（SEC）進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)KdsD在溶液（30 mmol·L－1三羥甲基氨基甲烷 pH 8.0,200 mmol·L－1氯化鈉）中以多種聚體的形式存在；酶學(xué)性質(zhì)測定的結(jié)果表明：毛竹KdsD酶最適pH值為pH 8.5，最適作用溫度為37℃。此結(jié)果為后期研究植物KdsD蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。圖7參17

林木育種學(xué)；毛竹；阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶；基因克??；原核表達(dá)；蛋白純化

果膠類多糖廣泛分布于高等植物的根、莖、葉、果實等的細(xì)胞初生壁和細(xì)胞間隙，對細(xì)胞組織起著軟化和黏合作用，同時還是抵御病原體微生物入侵的天然屏障［1］。2-酮-3-脫氧辛糖酸（KDO）是果膠類多糖鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅱ（RhamnogalacturonansⅡ，RG-Ⅱ）成分中很少見的八碳糖［2］，在進(jìn)化過程中非常保守，對花粉管的伸長和生長具有一定的作用［3－4］。KDO合成過程中涉及到5種酶［5］，其中阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶（D-arabinose 5-phosphate isomerase，KdsD）是KDO生物合成過程中的第1個關(guān)鍵酶，可以催化核酮糖-5-磷酸（D-ribulose 5-phosphate，Ru5P）的異構(gòu)化，以產(chǎn)生在KDO生物合成途徑中的第1個中間產(chǎn)物D-阿拉伯糖-5-磷酸（D-arabinose 5-phosphate，A5P）。KDO最初是在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)的，它連接O-特異側(cè)鏈與類脂A共同嵌入細(xì)胞壁外膜上［6］。細(xì)胞壁中KDO合成的阻斷會導(dǎo)致類脂A物質(zhì)的累積和細(xì)胞生長停滯［7］。研究發(fā)現(xiàn)，KDO生物合成途徑也存在于藻類植物與高等植物中［2,8］。大腸埃希菌Escherichia coli中的KdsD晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，它是一個同源四聚體［9－11］。每個KdsD亞基包含2個不同的結(jié)構(gòu)域：N-末端糖異構(gòu)酶（SIS）結(jié)構(gòu)域，主要參與磷糖異構(gòu)化作用，以及1對未知功能的胱硫醚-β-合酶（CBS）結(jié)構(gòu)域。通過定點突變確定了大腸埃希菌的Lys59，His88和His193對應(yīng)于綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa的Lys56，His85和His190［12－14］分別是其活性重要的保守殘基。目前，植物中KdsD的研究很少，其晶體結(jié)構(gòu)也尚不清楚，植物來源的KdsD酶功能及催化作用機(jī)制、酶的催化特性等科學(xué)問題仍需要更加深入研究。毛竹Phyllostachys edulis是中國廣泛分布的一種經(jīng)濟(jì)價值很高的植物，在林業(yè)生產(chǎn)中的地位至關(guān)重要。本研究擬克隆毛竹KdsD基因，分析它在不同組織的表達(dá)特異性，進(jìn)行生物信息學(xué)分析和原核表達(dá)，經(jīng)過Ni-NTA親和層析和分子篩層析（SEC）純化獲得高純度的蛋白，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，為后續(xù)KdsD晶體學(xué)結(jié)構(gòu)和植物KdsD基因功能的研究打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

毛竹采自浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，取半年生毛竹實生苗新鮮的根、莖、葉分裝于凍存管中，于液氮中速凍，放－80℃冰箱備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 取毛竹新鮮的根、莖、葉在液氮中迅速研磨成粉末，用Trizol法［15］提取總RNA，用脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）消除DNA污染。分別以毛竹約1.0 μg的根、莖、葉RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.2.2 PeKdsD基因克隆 通過美國生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫獲得擬南芥Arabidopsis thaliana的KdsD基因序列，檢索毛竹數(shù)據(jù)庫，得到一條同源序列。根據(jù)該基因的開放讀碼框（ORF）設(shè)計引物。上游BamH I酶切位點引物5′-CGGGATCCATGGGCTCGCTCCCCGTGCCCT-3′；下游HindⅢ酶切位點引物5′-CCAAGCTTTTATAATCCAGCAGAGACCAAT-3′（酶切位點用下劃線顯示）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析后經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收，獲得的目的DNA片段插入經(jīng)同樣酶切后的pE-SUMO表達(dá)載體，得到1個N-末端含有6個His親和標(biāo)簽的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和單酶切驗證。

1.2.3 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析 根據(jù)毛竹KdsD基因的保守序列設(shè)計qRT-PCR引物（正向引物：GTGTTGGATTCTGGATGGTTC；反向引物：CAGCCGTAGTGGTGAATGAGTAAC）。內(nèi)參Actin（正向引物：CGACATTGGCTCGCTCTTC；反向引物：CGGCAGAGGTGAGGGAGAT），使用熒光定量PCR儀對PeKdsD基因在根、莖、葉不同組織的表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.2.4 PeKdsD的原核表達(dá) 將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株E.coli（Ril）中，挑取單克隆，接入2 mL溶菌肉湯（LB）培養(yǎng)基（A+）37℃培養(yǎng)，當(dāng)菌體吸光度D（600）達(dá)到0.5～0.8時，加入終濃度為0.4 mmol·L－1的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)，分別在37℃搖床上誘導(dǎo)3 h，在20℃搖床上過夜誘導(dǎo)，最后收集菌體，超聲破碎，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 PeKdsD的純化 在確定的最佳溫度表達(dá)條件下，將菌株接種于1.0 L LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。加入誘導(dǎo)劑后，菌液在20℃，220 r·min－1條件下過夜培養(yǎng)。離心收集菌體，將裂解液［1.0 mol·L－1氯化鈉，30.0 mmol·L－1三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl），體積分?jǐn)?shù)為5%的甘油］加入到收集的菌體中，超聲破碎細(xì)胞后，20 000 r·min－1，4℃條件下離心45 min，將上清轉(zhuǎn)移至鎳柱，置于搖床緩慢結(jié)合1 h，后分別用低濃度咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，用高濃度咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。將目的蛋白收集在10 kDa濃縮柱中離心進(jìn)行濃縮，至體積為500.0 μL左右。使用分子篩層析柱SuperoseTM12 10/300 GL上樣，根據(jù)蛋白的出峰順序收集蛋白，用SDS-PAGE膠檢測蛋白的純度，將較高純度的蛋白收集濃縮，置于－80℃保存。

1.2.6 酶活性測定 酶活力測定采用半胱氨酸-咔唑法［16-17］。25.0 μL的酶用100.0 mmol·L－1Tris-HCl，pH 8.5配制，37℃保溫3 min，加入25.0 μL 2.0 mmol·L－1阿拉伯糖-5-磷酸（A5P），37℃反應(yīng)5 min，加入50.0 μL 12.5 mol·L－1硫酸終止反應(yīng)，采用半胱氨酸-咔唑法顯色，測定D（540）nm吸光度。酶活力單位（1 U＝16.67 nkat）定義為:以A5P為底物，每分鐘催化產(chǎn)生1.0 μmol的核酮糖-5-磷酸（Ru5P）所需的酶量。所有酶活測定結(jié)果均為3次重復(fù)平行試驗數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.7 最適pH值和最適溫度對酶活性的影響［17］最適pH值的測定，將樣品KdsD稀釋在100.0 mmol· L－1不同pH值緩沖液中，MES緩沖液從pH 6.0～6.5，Tris-HCl緩沖液從pH 7.0～9.0。37℃反應(yīng)5 min，測定酶活。最適溫度則是在測定的最適pH值下，將反應(yīng)溫度控制在25～65℃，隔10℃進(jìn)行酶促反應(yīng)，然后測定酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PeKdsD基因克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

PeKdsD基因經(jīng)PCR擴(kuò)增重組后測序，得到1條開放讀碼框（ORF）為1 038 bp的目的片段。該基因編碼346個氨基酸（圖1）。將PCR產(chǎn)物與pE-SUMO表達(dá)載體連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α，挑取陽性菌落進(jìn)行菌檢測出，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體。

圖1 毛竹PeKdsD基因開放讀碼框區(qū)及預(yù)測的氨基酸序列Figure 1 ORF of PeKdsD gene and the corresponding amino acid sequence

2.2 PeKdsD氨基酸序列比較與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過blast在線軟件分析，結(jié)果顯示，PeKdsD含有2個不同的結(jié)構(gòu)域：SIS結(jié)構(gòu)域和CBS結(jié)構(gòu)域，大腸埃希菌序列中關(guān)鍵的催化殘基Lys59，His88和His193在毛竹中是完全保守的。PeKdsD編碼的氨基酸序列與玉米Zea mays，高粱Sorghum bicolor和水稻Oryza sativa具有較高的一致性，均為91.00%，與楊樹Populus trichocarpa和擬南芥的一致性分別為69.00%和66.38%，而與大腸埃希菌和脆弱擬桿菌

Bacteroides fragilis的一致性分別只有29.21%和31.12%（圖2）。采用MEGA6軟件構(gòu)建不同物種KdsD氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果表明：毛竹與玉米位置較近，位于同一個分支上；與楊樹、水稻位于同一大分支上，與擬南芥和脆弱擬桿菌分支較遠(yuǎn)。

圖2 不同物種KdsD氨基酸多序列比對Figure 2 Sequence multiple alignment of KdsD from different species

圖3 不同物種KdsD氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Molecular phylogenetic tree of KdsD from different species

2.3 PeKdsD在不同組織中的表達(dá)分析

PeKdsD不同組織qRT-PCR結(jié)果顯示：PeKdsD在毛竹的根、莖、葉中均有表達(dá)，但在表達(dá)量上存在較大的差異，在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于根與莖（圖4）。

2.4 PeKdsD重組蛋白的純化及表達(dá)檢測

將PeKdsD重組載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株E.coli（Ril）感受態(tài)細(xì)胞，使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)及可溶性情況（圖5A）。對比發(fā)現(xiàn)表達(dá)菌株Ril在20℃培養(yǎng)溫度下表達(dá)量相對較高，故在后續(xù)試驗中確定重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度為20℃。

2.5 PeKdsD蛋白Ni-NTA純化與分子篩層析

圖4 PeKdsD在毛竹不同組織中的表達(dá)分析Figure 4 Relative expression of PeKdsD in the root,shoot and leaf of Phyllostachys edulis

將收集的菌體超聲破碎離心后，上清加入Ni-NTA柱，冰上結(jié)合后，采用咪唑梯度洗脫蛋白，SDSPAGE檢測（圖5B）。結(jié)果顯示：條帶出現(xiàn)的位置與目的蛋白大小一致，目的蛋白被成功地純化出來。將

目的蛋白進(jìn)一步經(jīng)SuperoseTM12 10/300 GL分子篩層析后，出現(xiàn)2個明顯的吸收峰。對比小牛血清BSA出峰位置（二聚體C峰對應(yīng)分子量為132.86 kDa，單聚體D峰對應(yīng)分子為66.43 kDa），A峰對應(yīng)是KdsD多聚體，B峰對應(yīng)的是KdsD單體（圖6），說明KdsD蛋白在溶液中存在多種聚體形式。2步純化Ni-NTA結(jié)合SEC可分離純化得到不同狀態(tài)的高純度KdsD蛋白，可滿足今后酶學(xué)特性的研究和蛋白晶體生長的要求。

圖5 PeKdsD在表達(dá)菌株E.coli（Ril）中的表達(dá)（A）和PeKdsD的Ni-NTA親和層析純化的SDS-PAGE檢測（B）Figure 5 Prokaryotic expression of PeKdsD in Escherichia coli（Ril）cell （A）and SDS-PAGE analysis from Ni-NTA affinity chromatography of PeKdsD（B）

2.6 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)

酶活性測定結(jié)果表明：純化的KdsD酶最適溫度為37℃，在35～45℃范圍內(nèi)酶活力較高，45℃以上酶活力急劇下降，而在25℃時仍保持在60%以上（圖7A）；不同的pH值條件也會影響酶的活性，最適作用pH值為pH 8.5，此時活性較高，過酸或過堿環(huán)境都會對酶活性有較大的抑制作用（圖7B）。

3 討論

圖6 PeKdsD分子篩層析圖Figure 6 Purification ofPeKdsD by size exclusion chomatography

圖7 溫度（A）和pH值（B）對酶活性的影響Figure 7 Effect of temperature and pH value on activity of enzyme

自2010年大腸埃希菌的KdsD結(jié)構(gòu)公布后，又陸續(xù)有其他

微生物的KdsD結(jié)構(gòu)報道。2014年CHIU等［14］解析出了脆弱擬桿菌API（bfAPI）的晶體結(jié)構(gòu)，為四聚體。但是植物來源的KdsD相關(guān)研究甚少，其結(jié)構(gòu)和功能至今仍未被解析。本研究首次成功克隆到了毛竹KdsD基因，該基因具有一個完整的開放閱讀框（ORF），編碼346個氨基酸。生物信息學(xué)分析預(yù)測其含有2個不同的結(jié)構(gòu)域：N-末端糖異構(gòu)酶（SIS）結(jié)構(gòu)域和胱硫醚-β-合酶（CBS）結(jié)構(gòu)域。盡管大腸埃希菌序列中關(guān)鍵的催化殘基Lys59，His88和His193在毛竹中是完全保守的，但是毛竹KdsD蛋白序列與大腸埃希菌KdsD蛋白序列相似度不足30%，因此，推測植物KdsD與微生物中的KdsD蛋白空間結(jié)構(gòu)和功能可能存在一定的差異。為進(jìn)一步了解植物KdsD和微生物KdsD結(jié)構(gòu)上的差異，還需進(jìn)一步純化獲得高純度的蛋白，進(jìn)行蛋白結(jié)晶，通過X射線等方面的研究進(jìn)一步分析驗證結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。實時定量PCR在根、莖、葉中均檢測到有表達(dá)，尤其在葉中表達(dá)量比其他組織高約5～8倍，表現(xiàn)出明顯的組織特異性現(xiàn)象。Ni-NTA純化顯示所得的目的蛋白大小與預(yù)測的蛋白分子量相一致，成功純化出了PeKdsD蛋白。進(jìn)一步的SEC純化結(jié)果表明：毛竹KdsD在30 mmol·L-1Tris-HCI pH 8.0，200 mmol·L-1氯化鈉溶液條件，以多聚體混合的形式存在，SEC中KdsD的多聚體究竟是幾聚體還需分析超速離心（AUC）等實驗做進(jìn)一步的分析驗證。酶學(xué)性質(zhì)初步測定結(jié)果表明：PeKdsD的最適溫度為37℃，最適pH值為pH 8.5。最適pH值與預(yù)測的pH值有所偏差，故后期試驗采用pH 8.5為宜。當(dāng)然，要揭示毛竹KdsD酶功能及催化作用機(jī)制，還有待于后續(xù)晶體結(jié)構(gòu)與功能等方面的進(jìn)一步深入研究。

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Gene cloning,expression,and purification of the arabinose-5-phosphate isomerase from Phyllostachys edulis

QU Yaping,ZHANG Zhijun,WANG Chaoli,WANG Lei,WU Linjun
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Phyllostachys edulis arabinose-5-phosphate isomerase （PeKdsD）is the first key enzyme in the biosynthesis of 3-deoxy-D-manno-octulosonate（KDO）.The full length cDNA of the KdsD gene（1 038 bp with 346 amino acids）was cloned using reverse transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR）followed by protein Basic Local Alignment Search Tool （BLAST）and phylogenetic tree analysis of the amino acid sequence.Then a qRT-PCR analysis of diverse tissues in Ph.edulis was conducted,and a mass of soluble KdsD protein was obtained through a prokaryotic expression system in Escherichia coli.The recombinant protein was further purified through Ni-NTA affinity and size exclusion chromatography （SEC）in a buffer of 30 mmol·L－1Tris-HCl pH 8.5,200 mmol·L－1NaCl to determine enzymatic properties.Results of the amino acid sequence among different species indicated that the PeKdsD isomerase had a high sequence similarity with KdsD in Zea mays but was low in microorganisms.The qRT-PCR analysis of diverse tissues in Ph.edulis revealed that PeKdsD had its highest expression level in the leaf.SEC results showed that the recombinant KdsD protein existed as protein polymers,and for enzymatic properties of PeKdsD the optimum reaction temperature was 37℃with a pH of 8.5.This work provides a basis for determining the structure and function of plant KdsD.［Ch,7 fig.17 ref.］

forest tree breeding;Phyllostachys edulis;arabinose-5-phosphate isomerase（PeKdsD）;gene

S722

A

2095-0756（2016）06-0928-07

2015-11-03；

2015-12-09

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（Y14C160039）

屈亞平，從事生物技術(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail:1173714002@qq.com。通信作者：張智俊，副教授，博士，從事生物技術(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail:397942805@qq.com

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.002

cloning;prokaryotic expression;protein purification