酶促反應(yīng)分子馬達(dá)的研究進(jìn)展

秦為為+孫樂樂+彭天歡+徐艷+高延靜+王文鋒+李迪

摘 要 傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為酶促反應(yīng)并不會影響酶本身的擴(kuò)散運(yùn)動。最近的研究表明，在酶促反應(yīng)過程中，酶分子的擴(kuò)散系數(shù)會增大，而且其增大強(qiáng)度具有底物依賴性，即隨著底物濃度的增加而增大。酶促反應(yīng)分子馬達(dá)，是利用酶促反應(yīng)過程中產(chǎn)生的能量驅(qū)動納米或微米級物體的運(yùn)動。盡管在幾種不同的酶體系中的研究已經(jīng)證實(shí)了酶在催化過程中的底物依賴性，但是造成酶擴(kuò)散增強(qiáng)的原因至今仍不清楚。本文從酶促反應(yīng)過程中酶自身擴(kuò)散系數(shù)的變化、酶自身擴(kuò)散系數(shù)變化的可能機(jī)理及其應(yīng)用等3個方面，對酶在催化過程中的底物依賴性以及酶促分子馬達(dá)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞 酶促反應(yīng)； 擴(kuò)散系數(shù)； 趨化性； 自驅(qū)動； 納米馬達(dá)； 綜述

20160318收稿；20160418接受

本文系國家自然科學(xué)基金（Nos.21227804，21373260，31371015），中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會項目（No.2013174），口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項目（No.SKLOD2015OF05）資助

Email： lidi@sinap.ac.cn

1 引 言

眾所周知， 液體中的分子不停地做無規(guī)則的布朗運(yùn)動。對于有催化活性的酶分子而言，在無底物存在時，在溶液中的運(yùn)動模式為布朗運(yùn)動；在底物存在時，酶可以催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，并釋放出能量。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所釋放的能量不會對酶分子本身造成干擾[1]。然而最近的研究表明，在催化反應(yīng)過程中，大多數(shù)酶的擴(kuò)散系數(shù)會增大，而且增大程度與底物濃度呈正相關(guān)，即酶分子可以利用酶促反應(yīng)過程中底物轉(zhuǎn)化時釋放的能量驅(qū)動酶分子自身的運(yùn)動。

馬達(dá)是指可以將某種形式的能量轉(zhuǎn)化成機(jī)械能，用于做功的一類機(jī)器[2]。實(shí)際上，生物體內(nèi)也包含多種多樣的馬達(dá)，如肌球蛋白、動力蛋白和驅(qū)動蛋白，都是胞漿內(nèi)的分子馬達(dá)，通過消耗能量分子（ATP）為馬達(dá)在特定軌道（如微管）上的運(yùn)動提供能量?；诿傅纳锺R達(dá)在細(xì)胞內(nèi)高效而精確地行使著特殊的功能[3～6]，如DNA的合成和囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)等。在更高層次上，生物體系中的馬達(dá)可以使細(xì)胞有方向性地朝著特定的化學(xué)物質(zhì)或光運(yùn)動[7，8]。在上述情況中，這些生物馬達(dá)的運(yùn)動都是利用了酶促反應(yīng)過程中底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所釋放的能量。酶是生物體內(nèi)進(jìn)行各種各樣化學(xué)反應(yīng)的催化劑。鑒于酶分子的多樣性、高效性，以及酶分子可以利用酶促反應(yīng)過程中底物轉(zhuǎn)化所釋放的能量進(jìn)行自我驅(qū)動，因此可利用酶分子設(shè)計構(gòu)建馬達(dá)，這將會極大地擴(kuò)展和豐富驅(qū)動納米或微米馬達(dá)的方式[9]，為設(shè)計新型的化學(xué)刺激響應(yīng)的自動藥物輸送系統(tǒng)開辟新型且多樣化的途徑。本文將圍繞酶促反應(yīng)過程中酶擴(kuò)散系數(shù)的增強(qiáng)及其在分子馬達(dá)構(gòu)建等方面的研究與應(yīng)用進(jìn)行評述。

2 酶促反應(yīng)過程中酶自身的擴(kuò)散行為

2.1 酶促反應(yīng)對酶分子自身擴(kuò)散系數(shù)的影響

最近的研究表明，酶促反應(yīng)過程中酶的擴(kuò)散系數(shù)會隨底物濃度的增加而增大。2009年，Yu等[10]通過實(shí)驗(yàn)證明，由DNA模板和相應(yīng)的RNA聚合酶組成的復(fù)合物，在底物NTPs存在時擴(kuò)散變快，而且該復(fù)合物有朝著底物NTPs濃度高的方向運(yùn)動的趨勢，這是一種類似于細(xì)胞趨化性的行為（如圖1所示）。

隨后，賓夕法尼亞州立大學(xué)的Muddana等首次使用熒光相關(guān)光譜儀（FCS）在單分子水平上測到了酶促反應(yīng)引起的脲酶擴(kuò)散增強(qiáng)的行為（圖2），并用布朗動力學(xué)模擬計算了擴(kuò)散系數(shù)達(dá)到相應(yīng)增強(qiáng)程度所需的力（約12 pN）[11]。Muddana等對酶促反應(yīng)引起的擴(kuò)散系數(shù)增強(qiáng)機(jī)理給出了幾種可能的解釋。2015年，加州大學(xué)伯克利分校的Bustamante研究組對文獻(xiàn)[11]報道的酶的擴(kuò)散增強(qiáng)行為進(jìn)行了更加嚴(yán)密的論證與排除實(shí)驗(yàn)。他們的研究發(fā)現(xiàn)，酶促反應(yīng)過程中酶擴(kuò)散系數(shù)的增強(qiáng)與反應(yīng)熱相關(guān)。即僅有催化放熱反應(yīng)的酶才會表現(xiàn)出擴(kuò)散系數(shù)增大，且擴(kuò)散系數(shù)的增大與反應(yīng)速率呈線性關(guān)系（圖 3）[1]。酶促反應(yīng)中酶分子擴(kuò)散系數(shù)增強(qiáng)，表明酶分子可以利用底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物過程中所釋放的能量進(jìn)行自我驅(qū)動，所以需要重新考慮酶促反應(yīng)可能對酶分子所產(chǎn)生的影響，這對更加深入地理解酶分子在催化過程中的一些行為具有極其重要的意義。

2.2 酶促反應(yīng)過程中酶分子自身擴(kuò)散增強(qiáng)的機(jī)理

最近的一系列研究成果表明，酶促反應(yīng)中酶擴(kuò)散系數(shù)的增強(qiáng)具有底物依賴性，但對于這種酶促反應(yīng)引起的酶擴(kuò)散系數(shù)增強(qiáng)的機(jī)理仍不清楚。2010年，Muddana等提出了幾種可能的機(jī)理來解釋脲酶在催化尿素分解過程中酶擴(kuò)散增強(qiáng)的底物依賴性[11]。第一種導(dǎo)致脲酶擴(kuò)散增強(qiáng)的可能機(jī)理是：酶促反應(yīng)過程中產(chǎn)生的帶電產(chǎn)物在酶分子的周圍產(chǎn)生的不對稱的電場，引起了帶電的酶分子擴(kuò)散的增強(qiáng)。具體而言，即脲酶在磷酸鹽緩沖液中催化尿素分解的產(chǎn)物NH+4比HCO 4離子的擴(kuò)散系數(shù)大，所以當(dāng)尿素分子被水解后，這些產(chǎn)物離子被釋放在酶分子的表面，由于NH+4的快速擴(kuò)散而產(chǎn)生了一個局域電場，這個電場可以在極短時間內(nèi)對酶施加pN數(shù)量級的電泳力，直至離子從雙電層擴(kuò)散離開。但是要測量如此短時間內(nèi)的力是非常困難的，所以作者用布朗動力學(xué)模擬對單個底物轉(zhuǎn)換時所產(chǎn)生的力進(jìn)行了估算（圖4）。第二種可能的解釋是：尿素水解所引起了酶分子局部pH值升高，使得蛋白質(zhì)（酶分子）表面電荷增加，蛋白蛋白以及蛋白平衡離子之間的相互作用增強(qiáng)。這些相互作用的增強(qiáng)使得脲酶的擴(kuò)散系數(shù)增大。為了驗(yàn)證局部pH值變化對酶分子擴(kuò)散的影響，作者使用熒光染料SNARF1（其熒光壽命隨局部pH的變化而變化）對脲酶進(jìn)行了標(biāo)記。作者發(fā)現(xiàn)pH值變化所能引起的酶擴(kuò)散系數(shù)的增加（5%）遠(yuǎn)不及實(shí)驗(yàn)中所觀察到的擴(kuò)散系數(shù)增加比例（28%），這說明pH值增加即使可以引起脲酶擴(kuò)散系數(shù)變化，也不是導(dǎo)致如此大幅度擴(kuò)散增強(qiáng)的主要原因。最后，作者通過計算得出，由于尿素水解所引起的溶液局部溫度的升高約在μK數(shù)量級，所以幾乎可以忽略其對酶分子擴(kuò)散系數(shù)變化的影響。

2013年，Sengupta等[5]又發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶的擴(kuò)散系數(shù)也隨著底物濃度的增加而增大，在排除了電荷、pH值變化、氣泡以及溶液局部溫度升高等因素對酶分子擴(kuò)散增強(qiáng)的影響后，他們認(rèn)為酶催過程中擴(kuò)散系數(shù)變化的原因可能是酶分子瞬時局部溫度升高造成的[5]。同時，在微流控通道中，脲酶與過氧化氫酶都有向底物濃度高的方向擴(kuò)散的趨勢，這是一種分子尺度上類似于生物體系中趨化性的行為。作者認(rèn)為酶分子具有類似于趨化性的行為的主要原因是酶促反應(yīng)中酶分子擴(kuò)散系數(shù)增強(qiáng)的底物依賴性。底物依賴性使酶分子在底物濃度高的地方擴(kuò)散快。因此，可以利用酶的“趨化性”控制酶分子的運(yùn)動方向，這為納米或微米馬達(dá)的設(shè)計及定向藥物運(yùn)輸提供了新思路。

2015年，Bustamante研究組提出酶促反應(yīng)過程中酶分子擴(kuò)散系數(shù)的增強(qiáng)與反應(yīng)熱相關(guān)[1]，只有催化放熱反應(yīng)的酶的擴(kuò)散系數(shù)才會增大，且擴(kuò)散系數(shù)的增加與反應(yīng)速率呈線性相關(guān)。他們研究了4種酶，包括過氧化氫酶、尿素酶、堿性磷酸酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶，發(fā)現(xiàn)前3種催化放熱反應(yīng)的酶，其擴(kuò)散系數(shù)的增加與反應(yīng)速率呈線性關(guān)系。磷酸丙糖異構(gòu)酶催化磷酸丙糖異構(gòu)體之間的構(gòu)象轉(zhuǎn)化，反應(yīng)放熱可以忽略，因此其擴(kuò)散系數(shù)不依賴底物濃度，即反應(yīng)速率。他們提出了一種全新的理論模型解釋酶促反應(yīng)過程中酶擴(kuò)散系數(shù)增強(qiáng)的機(jī)理，即“化聲效應(yīng)”（Chemoacoustic effect）[1]（圖5）。催化位點(diǎn)不對稱的酶在催化反應(yīng)后釋放的熱量使酶本身膨脹而發(fā)生形變，導(dǎo)致對酶溶劑界面產(chǎn)生壓力。溶劑除了通過聲波釋放部分能量，根據(jù)牛頓第三定律，溶劑還會對酶產(chǎn)生反作用力，使酶的質(zhì)心發(fā)生位移。作者認(rèn)為這種反應(yīng)熱所引起的“化聲效應(yīng)”可能才是酶促反應(yīng)中酶擴(kuò)散增強(qiáng)的根本原因。這顛覆了傳統(tǒng)上認(rèn)為反應(yīng)熱不會對酶分子造成干擾的觀點(diǎn)，也使我們認(rèn)識到酶促放熱反應(yīng)或許是通過“化聲效應(yīng)”引起了酶分子的質(zhì)心發(fā)生位移。這種反應(yīng)熱驅(qū)動酶分子運(yùn)動的全新視角表明，反應(yīng)熱或許也會對酶分子的結(jié)構(gòu)完整性及內(nèi)部自由度產(chǎn)生影響。對酶促反應(yīng)中酶擴(kuò)散增強(qiáng)機(jī)制的深入研究，不僅有助于理解生物體內(nèi)酶分子一些復(fù)雜的生物學(xué)行為（比如聚合酶的方向性），也為設(shè)計一些具有特殊功能的納米或微米馬達(dá)指明了新的方向。

3 酶促反應(yīng)過程中酶自身的擴(kuò)散增強(qiáng)的潛在應(yīng)用

3.1 構(gòu)建利用酶促反應(yīng)供能的微馬達(dá)

近年來，利用催化反應(yīng)供能的人造馬達(dá)模擬生物分子馬達(dá)和微生物的研究備受關(guān)注[12]，因?yàn)樗鼈冊诩{米尺度組裝[13]、微型機(jī)器人制造[14～16]、化學(xué)或生物化學(xué)傳感[17～21]等領(lǐng)域具有重要的潛在應(yīng)用。此外，利用靶向運(yùn)動的人造馬達(dá)可運(yùn)輸藥物[22，23]，且比傳統(tǒng)的被動擴(kuò)散方式具有極大的優(yōu)勢，如速度快、用量少等。但是要真正實(shí)現(xiàn)在生物體真實(shí)環(huán)境中的應(yīng)用，人造馬達(dá)必須滿足兩個條件：一是利用生物體液中存在或生物相容性好的物質(zhì)提供能量，進(jìn)行自我驅(qū)動，而不是依靠自電泳或離子擴(kuò)散泳機(jī)制[24]； 第二，制造馬達(dá)的材料具有較好的生物相容性[23，25]。

酶分子是生物體中普遍存在的，并且可以高效催化轉(zhuǎn)化生物體內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)，所以其生物相容性很好。研究表明，過氧化氫酶、脲酶等在催化底物反應(yīng)時，自身的擴(kuò)散系數(shù)隨底物的濃度的升高而增大。當(dāng)酶與底物共存時，酶就成為一個利用化學(xué)反應(yīng)供能的“分子馬達(dá)”，但是酶自身的攜帶能力有限。最近，牛津大學(xué)Dey等[12]提出了一個利用酶促反應(yīng)為動力的微馬達(dá)模型（圖6）。他們分別將過氧化氫酶和脲酶連接聚苯乙烯微球表面，當(dāng)這種表面包裹酶分子的微球在相應(yīng)的底物存在時，擴(kuò)散系數(shù)也會隨著底物濃度的升高而增大。同時，他們也證明了這種微馬達(dá)更傾向于酶底物存在的方向進(jìn)行擴(kuò)散運(yùn)動。利用酶分子構(gòu)建微型馬達(dá)具有極大的優(yōu)勢：一方面酶分子具有較好的生物相容性，另一方面其擴(kuò)散運(yùn)動具有一定的趨向性。因此，如果酶分子具有較大的載體用于攜帶藥物，原理上能夠應(yīng)用于定向藥物輸送。這種可以對特定化學(xué)信號響應(yīng)的微型馬達(dá)可用于構(gòu)建在生理環(huán)境下執(zhí)行特定功能的多功能復(fù)合馬達(dá)。

3.2 酶的分離純化

從復(fù)雜的生物樣品中分離出具有生物活性的特定成分的研究具有重要意義。對于生物大分子的分離純化，通常采用較溫和的純化條件，以保證其活性?，F(xiàn)有的一些非標(biāo)記的分離技術(shù)主要依賴于被分離物質(zhì)的物理性質(zhì)，如形狀[26]、密度[27]、粘性[28]、介電常數(shù)[29]及擴(kuò)散性質(zhì)[30]等。因此，如果存在與待分離的目標(biāo)物質(zhì)物理性質(zhì)相似的物質(zhì)時，就很難保障分離效率?；诿阜肿訉ζ涞孜餄舛忍荻鹊内呄蛐?，賓夕法尼亞州立大學(xué)的Cremer課題組[31]提出了一種自發(fā)的分離方法，可以從酶分子的混合物中分離出能夠催化某種特定底物的酶分子。如圖7所示，他們設(shè)計了具有2個進(jìn)口和5個出口的微流控通道，一個進(jìn)口用于通入含有了特定底物的緩沖液，另一個進(jìn)口用于通入兩種帶有不同熒光標(biāo)記的酶溶液。兩種溶液同時通入時發(fā)生層流，底物的擴(kuò)散在通道中形成橫向的濃度梯度，由于能夠催化該底物的酶擴(kuò)散變快，在通道中橫向分布變寬，表現(xiàn)出所謂的“趨化性”，最后在底物濃度高的一側(cè)的出口處，流出的可催化反應(yīng)的酶的濃度高于無催化活性的酶。與其它非標(biāo)記技術(shù)相比，趨化分離主要是基于有活性的酶分子擴(kuò)散系數(shù)的底物濃度依賴性，是一種自發(fā)、簡單且對酶分子無損傷的分離方式。這種分離技術(shù)可以推廣應(yīng)用于分離其它活性催化劑及活性極低或無活性的催化劑。

4 展 望

酶分子可以利用酶促反應(yīng)過程中釋放的能量驅(qū)動自身發(fā)生運(yùn)動，即自驅(qū)動。酶分子的自驅(qū)動作用對從生物轉(zhuǎn)運(yùn)到酶分子驅(qū)動的納米或微米智能馬達(dá)的設(shè)計等方面的研究產(chǎn)生非常重要的影響。利用環(huán)境中底物催化所釋放的能量可實(shí)現(xiàn)微米或納米尺度物體的自驅(qū)動，通過底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的能量驅(qū)動不對稱顆粒在微米或亞微米尺度物體的運(yùn)動已多有報道。酶分子的自驅(qū)動能力、多樣性和高效性必將極大地擴(kuò)展和豐富利用酶分子構(gòu)建納米和微米馬達(dá)的新方法，為新型馬達(dá)的發(fā)展奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。此外，如果將這些酶分子催化體系固定到界面上，產(chǎn)生的機(jī)械力將會轉(zhuǎn)移到周圍的液體，基于此可設(shè)計各種各樣的酶分子微型泵，用于藥物、小分子或膠體的運(yùn)輸，而且可以很好地避免非酶類生物催化劑所引起的生物相容性差的問題。最后，利用酶分子的生物“趨化性”行為，還可以在酶分子各自的活性底物存在時，無標(biāo)記且無損地對酶分子及其它活性催化劑進(jìn)行分離。然而，將基于酶分子的人工合成馬達(dá)或泵真正用于生物體系中，實(shí)現(xiàn)特異性的、定點(diǎn)的分子傳送或藥物運(yùn)輸，還存在巨大的挑戰(zhàn)，需要對激活機(jī)制、運(yùn)動的精確控制、生物穩(wěn)定性等因素進(jìn)行嚴(yán)密評估。

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Abstract It is traditionally assumed that enzymatic reaction does not perturb the diffusion of an enzyme iteself. Recent studies have shown that the diffusivity of enzymed increased in a substratedependent manner during catalysis. Thus， the energy released during enzyme catalysis can be used to propel nanoscale objects， e.g. molecule motors driven by enzymatic reactions. Although the dependence of enzyme diffusion on substrate has been reported in several different enzyme systems， the precise origin of this phenomenon is still unknown yet. However， sevral possible mechainsms have been proposed for the enhanced diffusion. This review illustrates recent progresses in the research on the influences of enzymatic reaction on the diffusivity of enzyme， including the change of diffusion coefficient of enzymes， potential mechanisms and related applications.

Keywords Enzyme reaction； Diffusion coefficient； Chemotaxis； Selfpropelled； Nanomotor； Review