氨基雙四唑型金屬螯合磁性納米粒子的制備及其對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能

單丙輝+王超展+衛(wèi)引茂

摘 要 通過4步化學(xué)反應(yīng)對(duì)磁性Fe3O4@SiO2納米粒子進(jìn)行化學(xué)修飾，設(shè)計(jì)和制備了一種N，N′二（5四唑亞甲基）胺修飾的金屬螯合磁性納米粒子。用X射線光電子能譜（XPS）、Zeta電位對(duì)該新型吸附劑進(jìn)行了表征。用靜態(tài)吸附法研究了螯合Cu吸附劑對(duì)溶菌酶、細(xì)胞色素C和α糜蛋白酶的吸附性能以及溶液pH值、鹽濃度、蛋白初始濃度對(duì)吸附量的影響。結(jié)果表明，吸附劑對(duì)蛋白質(zhì)的吸附主要通過金屬配位機(jī)理進(jìn)行，且符合Langmuir吸附模型，對(duì)溶菌酶、細(xì)胞色素C和α糜蛋白酶的最大吸附量分別20.0、13.5和17.9 mg/g。此外，將螯合Cu吸附劑用于混合蛋白質(zhì)樣品的吸附，發(fā)現(xiàn)此吸附劑對(duì)混合蛋白質(zhì)樣品中的溶菌酶具有選擇性吸附作用，說明此金屬螯合吸附劑在蛋白質(zhì)選擇性分離富集中具有一定應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞 磁性分離； 金屬螯合； 吸附劑； 蛋白質(zhì)

20160225投稿；20160422接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金（Nos. 21275115， 21475104， 21575114）和長(zhǎng)江學(xué)者高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 （No. IRT15R55） 資助

Email： ymwei@nwu.edu.cn

1 引 言

固定化金屬親和（IMAC）吸附劑在生物大分子分離和純化過程中應(yīng)用廣泛。該類吸附劑一般由基質(zhì)、金屬離子以及在二者之間起到鍵合連接作用的螯合配體組成。 傳統(tǒng)的基質(zhì)有大孔硅膠、瓊脂糖、有機(jī)聚合物等，但這些基質(zhì)存在傳質(zhì)慢、分離操作困難等缺點(diǎn)。近年來，磁性材料因具有大的比表面積、超順磁性、低毒性、良好的生物相容性以及磁響應(yīng)性高等特點(diǎn)[1]，作為吸附劑的基質(zhì)在蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分離純化中獲得了廣泛應(yīng)用。配體的作用是將金屬離子固定在基質(zhì)上，同時(shí)對(duì)分離選擇性有重要影響。迄今為止，文獻(xiàn)中已報(bào)道了多種配體，主要分為4種類型[2～5]： （1）二齒配體，如水楊醛，氨基異羥肟酸，8羥基喹啉； （2）三齒配體，如亞氨基二乙酸（IDA），磷酸絲氨酸，二甲基吡啶胺，羧甲基脯氨酸和N（2甲基吡啶）氨基乙酸； （3）四齒配體，包括次氮基三乙酸（NTA）和羧甲基化天冬氨酸； （4）五齒配體，如N，N′，N′三羧甲基乙二胺和四乙烯五胺。最近，文獻(xiàn)[6，7]報(bào)道了一種基于1，4，7三氮雜環(huán)壬烷的多齒配體，其在蛋白質(zhì)分離中具有良好效果。這些配體絕大多數(shù)屬于氨羧型配體，其中三齒和四齒的螯合配體能同時(shí)兼顧與金屬離子穩(wěn)定結(jié)合并使金屬離子留有足夠的空軌道固定蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)證明，這些配體更為適合作為IMAC材料的配基。

四唑基團(tuán)的解離程度與羧基接近，且具有較好的穩(wěn)定性[8]。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，四唑?qū)饘匐x子具有螯合作用[9]。本研究以四唑代替IDA中的羧基，設(shè)計(jì)一種不同于氨羧型配體的氨基四唑型三齒配體，采用四氧化三鐵（Fe3O4）磁性納米粒子為基質(zhì)，制備一種新型金屬螯合吸附劑，并研究了固定Cu吸附劑對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV2550型紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）； PHI5400 X射線光電子能譜儀（XPS， 美國(guó)PE公司）； Masterzeta 2000動(dòng)態(tài)光散射儀（英國(guó)Malvern公司）； JY200C凝膠電泳儀（北京JUNYI公司）。

正硅酸乙酯（TEOS， 98%，上海晶純生化科技股份有限公司）； 4（氯甲基）苯基三甲氧基硅烷（95%，上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司）； 三（2氨基乙基）胺和溴乙腈購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 溶菌酶（Lysozyme， Lys）購于Amresco公司； 細(xì)胞色素C（Cytochrome C， CytC）、α糜蛋白酶（Chymotrypsin， αChy）購于LSBIO公司； 牛血清白蛋白（Bovine serum albumin， BSA）購于Wolsen公司； 卵清蛋白（Ovalbumin， OVA）、肌紅蛋白（Myoglobin， Myo），購于Sigma公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 Fe3O4@SiO2的制備 參考文獻(xiàn)[10]和[11]制備。

2.2.2 Fe3O4@SiO2的修飾 將3.0 g Fe3O4粒子置于100 mL三頸瓶中，加入30 mL重蒸甲苯，超聲分散，逐滴加入0.75 mL 4（氯甲基）苯基三甲氧基硅烷，110℃下攪拌反應(yīng)24 h。用甲苯、甲醇分別洗滌，40℃干燥。將干燥后的粒子、30 mL重蒸四氫呋喃（THF）、0.1 mL重蒸吡啶加入到100 mL三頸燒瓶中，再加入0.6 mL三（2氨基乙基）胺，65℃反應(yīng)24 h得到氨基化Fe3O4@SiO2。向THF、甲醇、乙腈洗滌后的粒子中加入30 mL乙腈、2.43 g K2CO3作為縛酸劑、0.3 g KI作為催化劑和1.1 mL溴乙腈，80℃反應(yīng)24 h，得到氰基化Fe3O4@SiO2。用乙腈、甲醇、N，N二甲基甲酰胺（DMF）分別洗滌所得粒子。最后，在粒子中加入30 mL DMF，0.63 g疊氮鈉和0.52 g氯化銨，120℃反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束，用DMF、甲醇、蒸餾水分別洗滌，真空干燥，得到N，N′二（5四唑亞甲基）胺修飾的磁性納米粒子，即氨基雙四唑型磁性納米粒子。

稱取0.5000 g氨基雙四唑型粒子于100 mL錐形瓶中，加入25 mL 5 mmol/L CuSO4溶液，25℃吸附12 h，在磁鐵吸附下除去上清液，再用少量pH 5.0， 0.1 mol/L乙酸乙酸鈉溶液清洗，除去未螯合的Cu， 真空干燥，即得到金屬螯合磁性納米粒子。其合成路線及吸附原理如圖 1所示。

2.2.3 蛋白質(zhì)吸附研究 （1） 溶液pH值的影響 在放置10 mg吸附劑的50 mL離心管中，分別加入5 mL用0.2 mol/L NaCl配制的、不同pH值的0.3 mg/mL Lys、CytC和αChy溶液。將混合吸附劑的蛋白質(zhì)溶液超聲分散1 min，并置于搖床振蕩，結(jié)果表明，25℃下1 h可以達(dá)到吸附平衡。磁鐵分離取上清液，用0.45 μm膜過濾，紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定溶液的吸光度，計(jì)算平衡濃度，根據(jù)式（1）計(jì)算吸附量：

2.2.4 吸附劑的吸附選擇性 配制濃度分別為1 mg/mL的OVA， BSA， Lys和Myo混合溶液。取0.2000 g 吸附劑和2 mL混合液，25℃吸附1 h。收集上清液，吸附劑用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）清洗3次，再用1.0 mL 0.2 mol/L NaCl淋洗。然后，加入1 mL含0.5 mol/L NaCl和0.7 mol/L咪唑的緩沖液進(jìn)行洗脫。收集該過程的上清液、淋洗液和洗脫液，用10%十八烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）對(duì)溶液進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 XPS表征

根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，四唑基團(tuán)解離后形成的四唑環(huán)狀陰離子具有強(qiáng)的給電子能力，可充當(dāng)配位基團(tuán)。因此，本研究模擬金屬螯合吸附色譜中最常用的配體—亞氨基二乙酸結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成了一種氨基雙四唑型配體。該配體通過N和兩個(gè)四唑陰離子環(huán)與金屬配位，因此屬于三齒配體。

為了驗(yàn)證氨基雙四唑型配體結(jié)構(gòu)，用XPS表征了修飾過程中每種粒子的元素含量及其存在環(huán)境。從圖2可見，經(jīng)4（氯甲基）苯基三甲氧基硅烷修飾后出現(xiàn)Cl元素（1.68%， w/w）的特征峰。該粒子與三（2氨基乙基）胺反應(yīng)后，Cl元素的特征峰消失，出現(xiàn)了N元素（2.57%）特征峰。對(duì)于氰基化粒子和氨基雙四唑型粒子，雖然元素的特征峰不變，但是N含量分別增加到4.57%和5.22%，說明粒子表面的氮元素增多，與配體的結(jié)構(gòu)符合。為進(jìn)一步確認(rèn)四唑的形成，對(duì)四唑型吸附劑XPS測(cè)定的N元素進(jìn)行了N1s分峰處理?？梢苑譃榻Y(jié)合能為402.39， 401.06， 400.25， 399.48和398.62 eV的5種N1s特征峰，其中398.62 eV對(duì)應(yīng)于叔胺N原子，400.25 eV對(duì)應(yīng)CNHC的特征峰，402.39， 401.06和399.48 eV屬于四唑環(huán)上N原子的特征峰[12]。N1s分峰結(jié)果表明，吸附劑表面有四唑基團(tuán)生成。

氨基化的粒子由于強(qiáng)烈的質(zhì)子化傾向，具有較大的Zeta電位值； 粒子表面接枝氰基后，質(zhì)子化能力降低，Zeta電位值下降。經(jīng)四唑基修飾后，四唑環(huán)在低pH值下發(fā)生部分解離變成負(fù)離子，故Zeta電位值繼續(xù)降低。當(dāng)粒子螯合銅后，表面正電荷增多，導(dǎo)致不同pH值下的Zeta電位值均大于四唑基粒子。由圖3可知，在pH 2～9范圍內(nèi)，Zeta電位的大小順序?yàn)椋喊被Ｗ?gt;氰基化粒子>金屬螯合粒子>氨基雙四唑型粒子。隨著pH值增加，所有粒子的Zeta電位都呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)樵谌芤簆H值增加的過程中，粒子表面質(zhì)子化減弱，而表面殘存的硅羥基解離程度增大，使表面負(fù)電荷逐漸增多。吸附劑Zeta電位的變化證明了合成每步反應(yīng)都是成功的。

3.3 吸附劑對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能

3.3.1 溶液pH值的影響 由圖4可見，隨著pH值的升高，Lys， CytC和αChy的吸附量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。Lys的吸附量隨pH值升高而呈現(xiàn)出整體上升的趨勢(shì)； CytC的吸附量在酸性溶液中保持不變，在堿性環(huán)境中增加。這符合金屬螯合吸附作用在中性和弱堿性溶液最大的特點(diǎn)[13]。但是，αChy的吸附卻呈現(xiàn)出隨pH增大而減小的趨勢(shì)。該現(xiàn)象與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)：αChy表面有兩個(gè)裸露的組氨酸His57和His40，His57存在于催化三聯(lián)體中，僅起催化作用，His40作用面積較小，但空間取向較靈活，在金屬螯合吸附中可與金屬產(chǎn)生配位作用，從而使αChy在吸附劑表面產(chǎn)生吸附行為[14]，但可能由于靜電作用力參與程度較大的緣故，使蛋白吸附隨pH增大而減小。3種蛋白吸附量與金屬螯合色譜中Lys、CytC、αChy的保留時(shí)間隨pH變化趨勢(shì)一致[7]，也支持了蛋白與吸附劑之間存在螯合作用的機(jī)理。

3.3.2 鹽濃度的影響 當(dāng)NaCl濃度小于0.4 mol/L時(shí)，3種蛋白吸附量均隨NaCl濃度的增加而降低； 當(dāng)NaCl濃度大于0.4 mol/L時(shí)，Lys、CytC和αChy吸附量分別減小至8.90、5.08和10.73 mg/g； 繼續(xù)增大NaCl濃度，吸附量保持不變。這種現(xiàn)象與蛋白和吸附劑之間存在的配位和靜電作用有關(guān)。在低離子強(qiáng)度范圍內(nèi)，隨著離子強(qiáng)度增加，吸附量明顯降低，反映蛋白質(zhì)與吸附劑之間存在弱靜電作用； 當(dāng)鹽濃度大于0.4 mol/L后，蛋白質(zhì)與吸附劑之間靜電作用被完全屏蔽，蛋白質(zhì)的吸附作用以配位作用為主。

3.3.3 吸附等溫線 蛋白質(zhì)的吸附量隨著Lys、CytC、αChy的初始濃度增大而增大，在Lys， CytC和αChy初始濃度分別為0.7， 0.2和0.3 mg/mL時(shí)達(dá)到最大吸附量，蛋白質(zhì)的初始濃度繼續(xù)增加，吸附量不再變化。分別用Langmuir和Freundlich模型對(duì)吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。由表1可見，3種蛋白質(zhì)的吸附更符合Langmuir吸附等溫線，說明吸附劑對(duì)3種蛋白質(zhì)的吸附是以單分子層吸附為主。這符合金屬螯合的吸附機(jī)理，即蛋白質(zhì)與固定相表面的金屬離子活性位點(diǎn)配位，從而形成單分子吸附。另外，從Langmuir擬合，計(jì)算出Lys、CytC和αChy的最大吸附量分別為20.0 mg/g， 13.5 mg/g和17.9 mg/g。

3.4 混合蛋白質(zhì)中Lys的分離提純

圖5為混合蛋白質(zhì)純化前后的SDSPAGE凝膠電泳圖。與混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)電泳帶（泳道2）相比，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被吸附后，上清液中僅包含BSA、OVA和Myo，不存在Lys，說明Lys被完全吸附。淋洗液中無蛋白條帶，但在洗脫液中只有Lys條帶，說明氨基雙四唑型吸附劑能從混合蛋白質(zhì)中選擇性萃取出Lys。吸附劑對(duì)其它3種蛋白質(zhì)均有吸附作用，但是對(duì)Lys的吸附作用更強(qiáng)，所以當(dāng)它們混合后，Lys優(yōu)先占據(jù)了吸附劑上的活性位點(diǎn)，其它蛋白質(zhì)保留在上清液中。因此，吸附劑在蛋白質(zhì)分離純化具有選擇性。

4 結(jié) 論

設(shè)計(jì)和制備了一種氨基雙四唑型金屬螯合磁性納米粒子吸附劑，并用XPS和Zeta電位對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。以pH效應(yīng)和鹽效應(yīng)驗(yàn)證了螯合金屬Cu的吸附劑對(duì)蛋白質(zhì)的吸附符合金屬螯合吸附機(jī)理。用吸附劑對(duì)混合蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行萃取分離，證明了此吸附劑對(duì)蛋白質(zhì)具有選擇性吸附能力，說明此吸附劑在蛋白質(zhì)分離領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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Abstract A bis（5methyltetrazolium）aminebonded magnetic nanoparticle adsorbent was prepared by chemically modifying magnetic nanoparticles Fe3O4@SiO2 via four steps chemical reactions. The physical properties of the adsorbent were characterized by Xray photoelectron spectroscopy （XPS） and Zeta potential. The static adsorption behavior of lysozyme， cytochrome C and chymotrypsin on the chelated Cu adsorbent， as well as the influences of the pH value of solution， ion strength and initial protein concentration on the adsorption capacity were evaluated with batch method. The results illustrated that the adsorption of protein proceeded via metal coordination mechanism and was also in accordance with Langmuir adsorption model， and the maximum adsorption capacities of lysozyme， cytochrome C and chymotrypsin were calculated to be 20.0 mg/g， 13.5 mg/g， and 17.9 mg/g， respectively. In addition， the chelated Cu adsorbent was employed to adsorb protein mixture， showing that this new type of adsorbent had selective adsorption to protein mixture. These results illustrated that the metalchelated adsorbent had potential application value in selectively separating and enriching proteins.

Keywords Magnetic separation； Immobilized metal ion affinity； Adsorbent； Protein