基于納米抗體—堿性磷酸酶融合蛋白的一步酶聯(lián)免疫吸附分析法檢測黃曲霉毒素B1

曹冬梅+許楊+涂追+李燕萍+熊亮+付金衡

摘 要 從噬菌體展示的抗黃曲霉毒素B1（AFB1）納米抗體文庫中，通過四輪親和淘選，得到抗AFB1納米抗體G8。將編碼納米抗體G8的基因與堿性磷酸酶（AP）基因融合，構(gòu)建了重組融合表達(dá)載體pET25b（+）G8AP，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（Rosetta，DE3）感受態(tài)細(xì)胞，異丙基βD硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)融合基因表達(dá)。SDSPAGE結(jié)果表明，融合蛋白G8AP為可溶性表達(dá)，Ni2+NTA親和層析柱純化融合蛋白，對硝基苯磷酸二鈉（pNPP）法測得純化后的G8AP的堿性磷酸酶比活力為（364.5 ± 8.3） U/mg。ELISA檢測結(jié)果表明，G8AP具有特異識別AFB1的活性，與其它真菌毒素（AFB2、AFG1、AFG2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素B1）無交叉反應(yīng)。基于G8AP建立了檢測AFB1的一步ELISA法。在優(yōu)化的條件下，即甲醇濃度20%、鹽離子濃度20 mmol/L、pH 7.4條件下，方法的半數(shù)抑制濃度（IC50）為19.8 ng/mL，線性范圍為4.3～92 ng/mL，檢出限為2.6 ng/mL。對玉米和小麥樣品加標(biāo)回收實驗結(jié)果表明，基質(zhì)對本方法的干擾不明顯，可用于實際樣品檢測。

關(guān)鍵詞 抗黃曲霉毒素B1納米抗體；堿性磷酸酶；融合表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附分析

20151113收稿；20160408接受

本文系國家自然科學(xué)基金（No. 31301479）、南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室青年研究基金（No. SKLFQN201513）及江西省自然科學(xué)基金重大項目（No. 20152ACB20005）資助

Email： tuzhui@ncu.edu.cn

1 引 言

黃曲霉毒素B1（AFB1）主要是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，是谷物污染中常見的真菌毒素，具有強(qiáng)致癌性、致毒性、致畸性[1]。世界各國及國際組織都制定了黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)對不同種類食品中AFB1的限量范圍為0.5～20 μg/kg[2]；飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了各類飼料中AFB1限量范圍為10～50 μg/kg[3]。因此，建立快速、準(zhǔn)確、低成本的AFB1檢測方法，對于保障食品安全具有重要意義。

目前，檢測谷物食品中AFB1的方法主要有薄層色譜法（Thinlayer chromatography，TLC）[4]、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）[5]、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[6]、膠體金試紙條法[7]以及電化學(xué)傳感器[8]等。其中，基于免疫學(xué)原理建立的ELISA方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快速等優(yōu)點[9， 10]。酶標(biāo)抗體是ELISA中的重要組成部分，傳統(tǒng)的化學(xué)偶聯(lián)法制備酶標(biāo)抗體，存在步驟繁瑣、蛋白聚集、標(biāo)記率低等缺點[11]。利用基因工程技術(shù)，將識別元件與顯色元件融合表達(dá)制備出具有雙重功能活性的融合蛋白，不僅可省略酶標(biāo)抗體的制備過程，而且檢測過程更加簡單快速[12]。

現(xiàn)有的基因工程抗體與酶重組的研究多采用單鏈抗體與酶融合。雖然已有部分通過單鏈抗體融合蛋白建立一步法ELISA的報道[13，14]，然而，由于單鏈抗體需要兩個結(jié)構(gòu)域共同發(fā)揮作用，單鏈抗體的活性受到連接肽長度、種類等諸多因素的影響[15]，在原核表達(dá)中常以沒有生物活性的包涵體的形式表達(dá)，限制了單鏈抗體的應(yīng)用[16，17]。納米抗體來源于駱駝科動物的重鏈抗體可變區(qū)，僅由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，易于進(jìn)行基因工程操作[18，19]。近年來，納米抗體用于食品安全檢測已成為研究熱點[20，21]，展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。

前期工作通過免疫羊駝，構(gòu)建了噬菌體展示的抗AFB1納米抗體文庫。本研究采用固相淘選技術(shù)，篩選特異性結(jié)合AFB1的納米抗體G8，然后將其與大腸桿菌堿性磷酸酶融合表達(dá)，獲得同時具有堿性磷酸酶活性和AFB1結(jié)合活性的融合蛋白G8AP，建立檢測AFB1的一步ELISA法，替代傳統(tǒng)ELISA中的一抗和酶標(biāo)二抗，為建立快速、低成本的一步法ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Multiskan FC酶聯(lián)免疫檢測儀、Multfuge XIR低溫高速離心機(jī)、NanoDrop 1000紫外可見分光光度計（美國Thermo公司）；Universal hood II凝膠成像系統(tǒng)（美國BIORAD公司）；DYYI III穩(wěn)壓電泳儀（北京六一儀器廠）；JY92IIDN超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；96孔酶標(biāo)板（美國Costar公司）。

噬菌體展示抗AFB1納米抗體文庫參照文獻(xiàn)[21]方法構(gòu)建，通過將納米抗體編碼基因與絲狀噬菌體pIII蛋白編碼基因融合，納米抗體展示于噬菌體表面。大腸桿菌TG1、DH5α和 BL21（Rosetta，DE3），噬菌粒pHEN1，原核表達(dá)載體pET25b（+），輔助噬菌體M13K07，堿性磷酸酶表達(dá)載體pET25b（+）AP均由本實驗室保存；內(nèi)切酶XhoI、NotI和T4 DNA連接酶、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和PCR純化試劑盒購自Takara公司；HRP/AntiM13 Monoclonal Conjugate、Ni2+NTA親和層析柱（HisTrap FF，5 × 1 mL columns）購自美國GE Healthcare公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司）；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin， BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin， OVA）、異丙基βD硫代吡喃半乳糖苷（IsopropyβDthiogalactoside，IPTG）和對硝基苯磷酸二鈉（Disodium 4Nitrophenyl Phosphate，pNPP）購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；人工抗原AFB1OVA由本實驗室制備；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。DNA測序由南京金斯瑞生物科技公司進(jìn)行。

2.2 實驗方法

2.2.1 抗AFB1納米抗體文庫的淘選 參考文獻(xiàn)[22]對噬菌體展示文庫進(jìn)行四輪淘選。包被的人工抗原濃度分別為100， 75， 50和25 μg/mL，以3% BSAPBS和3% OVAPBS交替作為封閉液。第一輪淘選采用酸洗脫方法，第二至四輪淘選采用競爭洗脫法，競爭洗脫AFB1濃度依次為100， 50和25 ng/mL。其中，富集度=后一輪噬菌體回收率/上一輪噬菌體回收率；回收率 = 洗脫的噬菌體數(shù)/當(dāng)輪投入的噬菌體數(shù)。

2.2.2 間接競爭phageELISA篩選抗AFB1納米抗體 展示噬菌體的制備及間接競爭phageELISA鑒定參照文獻(xiàn)[22，23]進(jìn)行。隨機(jī)挑選第四輪淘選的95個克隆，經(jīng)輔助噬菌體M13K07救援后得到展示納米抗體的噬菌體。采用間接競爭phageELISA進(jìn)行陽性克隆的鑒定，根據(jù)OD450值，挑選競爭阻斷效果顯著的噬菌體測序。

2.2.3 融合表達(dá)載體pET25b（+）G8AP的構(gòu)建 分別用限制性內(nèi)切酶XhoI和NotI雙酶切pET25b（+）G8和pET25b（+）AP，瓊脂糖凝膠回收后，T4 DNA連接酶按摩爾比1∶3連接酶切載體與堿性磷酸酶基因片段，CaCl2法轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和雙酶切驗證轉(zhuǎn)化子，陽性克隆進(jìn)行測序。

2.2.4 融合蛋白的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒pET25b（+）G8AP轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主BL21 Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。取單菌落接種于5 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素（Amp）和34 μg/mL氯霉素（CAP）的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)物按1%比例接種于50 mL含Amp和CAP的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，30℃ 搖床振蕩培養(yǎng)6 h，收集誘導(dǎo)培養(yǎng)物于4℃以8000 r/min離心15 min，棄上清液。菌體沉淀加入1/5體積的PBS緩沖液，超聲破碎，在4℃以8000 r/min離心20 min，收集上清液和沉淀，Ni2+NTA柱純化蛋白，SDSPAGE分析表達(dá)產(chǎn)物及純化的融合蛋白。

2.2.5 融合蛋白的堿性磷酸酶活力測定

采用對硝基苯磷酸二鈉法測定堿性磷酸酶酶活力和比活力[24]。在酶標(biāo)板中，分別加入20 μL稀釋不同倍數(shù)的重組蛋白（50， 100， 200， 400， 800， 1000倍）和100 μL pNPP底物液（10 mmol/L pNPP溶于含2.0 mmol/L MgCl2的0.1 mol/L二乙醇胺緩沖液，pH 9.8），37℃孵育15 min，每孔加入80 μL終止液（0.5 mol/L Na2CO3）終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定OD405值，計算重組蛋白催化生成對硝基苯酚的濃度（mmol/L ）。1個酶活力單位（1U）定義為37℃下，每分鐘催化產(chǎn)生1 mmol對硝基苯酚所需的酶量。酶的比活力（U/mg）=酶活力（U/mL）/蛋白濃度（mg/mL）。

2.2.6 一步法ELISA體系的建立與優(yōu)化 包被人工抗原AFB1OVA（0.5 μg/mL），100 μL/孔，4℃過夜。PBST洗滌3次，4%脫脂牛奶（300 μL/孔）37℃封閉2 h。PBST洗滌3次，每孔加入50 μL不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（0， 2， 5， 10， 20， 40， 100， 220 ng/mL）及50 μL 2.06 μg/mL的融合蛋白，37℃孵育1 h。PBST洗板5次，加入100 μL 1 mg/mL pNPP，37℃顯色10 min。加入50 μL 4 mol/L NaOH，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定OD405值?？疾旒状紳舛?、鹽離子濃度及pH值對反應(yīng)體系的影響。以競爭抗原AFB1終濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，以結(jié)合率（B/B0） 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[25]。定義結(jié)合率90%（即IC10）時AFB1濃度為最低檢出限[26]。

B/B0（%） =OD1-ODHankOD2×100%（1）

式中，OD1為競爭抗原孔OD405值， ODBlank為空白對照OD405值， OD2為非競爭對照孔OD405值。

2.2.7 樣品加標(biāo)回收實驗 對玉米和小麥樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，樣品提取方法參考文獻(xiàn)[27]進(jìn)行。稱取1g不含AFB1的樣品（即用商品化ELISA試劑盒未檢出AFB1，南昌博恒生物制品有限公司，檢測限1 μg/kg），分別加入適量AFB1標(biāo)準(zhǔn)品至濃度分別為50和100 μg/kg（每個濃度做6個平行），再加入3 mL 60%甲醇20 mmol/L PBS溶液，劇烈振蕩30 min，5000 r/min離心15 min，回收上清液，用20 mmol/L PBS稀釋1.5倍后進(jìn)行一步法ELISA檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 抗AFB1納米抗體文庫的淘選和陽性克隆的鑒定

噬菌體富集度隨淘選的進(jìn)行呈遞增趨勢，表明特異性結(jié)合AFB1的噬菌體被不斷富集（圖1）。間接競爭ELISA鑒定結(jié)果表明，共有80個克隆的顯色值降低，表明可與AFB1特異性結(jié)合，陽性率為84.2%（圖2）。其中，噬菌體克隆phageG8能夠被完全阻斷（圖2B），

3.2 融合表達(dá)載體pET25b（+）G8AP的構(gòu)建與驗證

雙酶切重組質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見兩個條帶（圖3），分別與理論上酶切后pET25b（+）G8片段（5908 bp）和堿性磷酸酶基因片段（1356 bp）大小相符[28]。測序結(jié)果表明，重組表達(dá)質(zhì)粒pET25b（+）G8AP構(gòu)建正確。

3.3 融合蛋白的表達(dá)與純化

誘導(dǎo)后的蛋白上清和破碎沉淀在SDSPAGE電泳中在65 kDa左右出現(xiàn)條帶，表明IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌中存在可溶性融合蛋白。表達(dá)上清經(jīng)Ni2+NTA親和柱純化后，SDSPAGE結(jié)果顯示，獲得了可溶性重組融合蛋白G8AP（圖4，泳道3）。

3.4 融合蛋白的堿性磷酸酶活性測定

酶活力測定結(jié)果表明，重組融合蛋白具有催化活性。經(jīng)親和純化的重組融合蛋白濃度為0.33 mg/mL，堿性磷酸酶活力為（120.3 ± 2.8） U/mL，酶比活力為（364.5 ± 8.3） U/mg。

3.5 交叉反應(yīng)

采用ELISA法測定融合蛋白與AFB1結(jié)構(gòu)類似物黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）及其它常見谷物污染毒素如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、伏馬菌素B1（FB1）的交叉反應(yīng)率CR[29]：

CR（%）=IC50（AFB1）/IC50（其它毒素）×100% （2）

結(jié)果顯示融合蛋白與AFB2的交叉反應(yīng)率為1.5%，而與其它毒素幾乎無交叉反應(yīng)，表明融合蛋白具有較高的特異性。

3.6 一步法ELISA體系的建立與優(yōu)化

3.6.1 ELISA條件優(yōu)化 樣品常用甲醇溶液萃取，甲醇濃度對G8APELISA檢測的影響如圖5 A所示，當(dāng)甲醇濃度從2.5%升高到20%時，吸光度值有所增大，IC50值變化不大；當(dāng)繼續(xù)升高至40%時，AFB1不能有效的抑制融合蛋白與人工抗原結(jié)合，因此選擇≤20%的甲醇進(jìn)行后續(xù)實驗。

鹽離子濃度的影響如圖5B所示，當(dāng)鹽離子濃度從5 mmol/L升高至40 mmol/L，吸光度值上升，IC50值變化不大；當(dāng)鹽離子濃度升高至80 mmol/L，吸光度值下降，IC50值增大。因此檢測中控制反應(yīng)體系的鹽離子濃度小于40 mmol/L。

反應(yīng)體系pH值的影響如圖5C所示，當(dāng)由酸性變?yōu)橹行?，抗原抗體的結(jié)合能力增強(qiáng)，反應(yīng)體系的靈敏度增強(qiáng)；pH=7.4時，抗原抗體結(jié)合能力最強(qiáng)，靈敏度最高；當(dāng)pH=8.4和9.4時，吸光度值沒有明顯變化，但是AFB1不能有效抑制融合蛋白與人工抗原結(jié)合。因此選擇pH 7.4為最適pH值。

3.6.2 一步法ELISA方法的建立 由于選擇較高濃度甲醇可以減小樣品提取過程中的稀釋倍數(shù)，提高樣品檢測靈敏度，綜合考慮，選擇甲醇20%、鹽離子20 mmol/L、pH 7.4作為最適反應(yīng)條件，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5D）。一步法ELISA的IC50值為19.8 ng/mL，線性范圍（IC20～ IC80）為4.3～92 ng/mL，檢測限（IC10）為2.6 ng/mL。與單克隆抗體間接競爭ELISA檢測方法[27，29]相比，本實驗條件下，融合蛋白一步法ELISA的 IC50值偏高，但是檢測時間大幅縮短，檢測線性范圍更寬。

3.7 樣品加標(biāo)回收實驗

玉米和小麥樣品的黃曲霉素B1加標(biāo)回收實驗結(jié)果如表1所示，加標(biāo)回收率在90.4%～101.5%之間，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，表明樣品的基質(zhì)效應(yīng)對方法的影響不明顯，本方法可用于玉米和小麥樣品中的黃曲霉素B1檢測。

4 結(jié) 論

納米抗體分子量小，易于與其它功能蛋白融合，得到具有多功能的重組蛋白。本研究構(gòu)建了抗AFB1納米抗體與堿性磷酸酶融合表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)，獲得了同時具有納米抗體活性和堿性磷酸酶活性的雙功能可溶性融合蛋白G8AP，建立了基于重組融合蛋白的檢測AFB1的一步法ELISA，可望替代傳統(tǒng)ELISA中的一抗和酶標(biāo)抗體，縮短檢測時間。采用重組融合蛋白，避免了化學(xué)交聯(lián)方法中存在的均一性、穩(wěn)定性差等問題，研究結(jié)果可為免疫學(xué)檢測中關(guān)鍵元件的制備提供新途徑。

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Abstract A phage clone （designated as the antiaflatoxin B1 nanobody， G8） specific binding to aflatoxin B1 （AFB1） was screened from an immunized nanobody phage library. The DNA fragment encoding G8 was subcloned into the vector pET25b（+）alkaline phosphatase （AP）， and fused to the N terminal of AP. The fusion protein G8AP was expressed in E. coli BL21 （Rosetta， DE3） as soluble protein， and purified by immobilized metal affinity chromatography. The purified G8AP exhibited AP activity of 364.5±8.3 U/mg. Enzymelinked immunosorbent assay （ELISA） showed that G8AP was also capable of recognizing AFB1， with negligible crossreactivity toward other six common mycotoxins. A onestep ELISA was established to detect AFB1 using G8AP. The effects of methanol concentration， ionic strength， and pH on the detection sensitivity of the G8APELISA were evaluated and optimized. Under the optimized conditions （methanol 20%， NaCl 20 mmol/L， pH 7.4）， the half inhibitory concentration （IC50） of the G8AP based ELISA was 19.8 ng/mL， with the linear range of 4.3-92 ng/mL and the detection limit of 2.6 ng/mL. The recoveries of AFB1 for corn and wheat samples were 90.4%–101.5%.

Keywords Antiaflatoxin B1 Nanobody； Alkaline phosphatase； Fusion expression； Enzymelinked immunosorbent assay