• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雙功能試劑與螯合金屬元素標(biāo)記多肽新技術(shù)的建立

    2016-12-08 00:15:39田慧芳徐慶春丁慧榮田志華張宏
    分析化學(xué) 2016年7期
    關(guān)鍵詞:多肽質(zhì)譜

    田慧芳+徐慶春+丁慧榮+田志華+張宏+朱華+王昕+沈靖

    摘要 建立了雙功能試劑2-[(4-異硫氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-SCN-Bn-DOTA)與標(biāo)準(zhǔn)肽段反應(yīng)的新方法,測(cè)定了反應(yīng)產(chǎn)物與鑭系金屬Eu的螯合效率,探索了其作為靶向探針和蛋白定量標(biāo)記試劑性能??疾炝瞬煌彌_體系的濃度及pH值、p-SCN-Bn-DOTA量與肽段相對(duì)量、反應(yīng)體系中有機(jī)相與水相比例,反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)偶聯(lián)效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: p-SCN-Bn-DOTA量為肽段的32倍,緩沖體系為0.2 mol/L TEAB (pH 8.5),60℃反應(yīng)60 min, 有機(jī)相與水相之比為4.4∶1(V/V)時(shí)標(biāo)記效率高;在HCl/NaAc緩沖體系(pH 4.0)中60℃反應(yīng)60 min,金屬離子鰲合反應(yīng)效率高達(dá)94%。本研究建立了一種新的基于雙功能試劑p-SCN-Bn-DOTA的標(biāo)記方法,并成功用于RGD肽等的標(biāo)記。

    關(guān)鍵詞 雙功能試劑; 標(biāo)記; 多肽; 蛋白定量; 質(zhì)譜

    2015-10-03收稿; 2016-03-11接受本文系北京市自然科學(xué)基金(Nos. 7143172, 7143173)資助

    E-mail: shenjing69@sina.com

    1 引 言

    雙功能試劑連接多肽并螯合金屬元素,可以作為靶向探針結(jié)合分子影像技術(shù)用于腫瘤的靶向治療研究[1],還可以通過標(biāo)記多種金屬元素制備蛋白質(zhì)組學(xué)多重定量試劑[2],用于腫瘤標(biāo)志物的篩選、鑒定、分類等研究。因此雙功能試劑在腫瘤研究方面具有良好的應(yīng)用前景。

    RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽,基于靶向多肽RGD進(jìn)行放射性核素標(biāo)記可用于αvβ3(+)腫瘤的無創(chuàng)性檢查以及判斷患者是否適用于抗腫瘤血管形成治療[3~5]。此外,標(biāo)記的小分子多肽具有生物相容性好、穿透性強(qiáng)、免疫原性低、作用快、易于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn),可在基于靶向探針的蛋白的分析檢測(cè)方面發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[6,7]。

    在腫瘤蛋白質(zhì)組定量分析研究方面,目前已開發(fā)的方法有基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的方法,如ICAT[8]、18O酶切標(biāo)記[9]、SILAC[10] 、iTRAQ [11]等,但這些方法普遍存在同位素價(jià)格昂貴、標(biāo)記難度較大、對(duì)質(zhì)譜分析儀器具有選擇性、同位素峰在質(zhì)譜分析時(shí)會(huì)發(fā)生相互干擾等缺點(diǎn),會(huì)給定量結(jié)果帶來誤差[12]。因此探索非同位素標(biāo)記的方法,開發(fā)具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的蛋白定量試劑具有重要意義。文獻(xiàn)[13~15]報(bào)道了針對(duì)肽段半胱氨酸標(biāo)記設(shè)計(jì)的金屬編碼親和標(biāo)簽。徐明等[16]利用外源Hg標(biāo)簽標(biāo)記硒蛋白/多肽,實(shí)現(xiàn)Se-Hg雙元素標(biāo)記選擇性識(shí)別和檢測(cè)硒蛋白/多肽。但是在實(shí)際的蛋白質(zhì)組學(xué)樣本分析中,需要使用適用于所有肽段的標(biāo)記方法。Liu等[17]開發(fā)了基于雙功能試劑二乙酸胺五乙酸的標(biāo)記方法,實(shí)現(xiàn)了肽段的無歧視標(biāo)記,但所選擇的雙功能試劑標(biāo)記效率不高。針對(duì)此問題,Wang等[18]用羥基琥珀酰亞胺-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA-NHS-ester) 作為螯合試劑進(jìn)行了初步研究,在此基礎(chǔ)上,文獻(xiàn)[12,19]對(duì)標(biāo)記方法進(jìn)行了優(yōu)化,提高了金屬標(biāo)記效率。

    雖然非同位素標(biāo)記的方法已取得了進(jìn)展,但是仍有以下幾方面需要改進(jìn)。首先,DOTA-NHS-ester 容易水解,在反應(yīng)體系中,活化酯與NH2的標(biāo)記反應(yīng)和水解反應(yīng)互相競(jìng)爭(zhēng),不利于反應(yīng)體系中水相和有機(jī)相組成的確立。其次,肽段中NH2與DOTA-NHS-ester是親核取代反應(yīng),反應(yīng)體系應(yīng)在中性或偏堿性條件進(jìn)行;而DOTA-NHS-ester 在堿性條件下極易水解,水解產(chǎn)生酸,在一定程度上改變反應(yīng)體系的pH值[20]。因此,DOTA-NHS-ester的水解敏感性高不利于確立標(biāo)記反應(yīng)條件,對(duì)實(shí)際樣本分析條件的限制很大,因此優(yōu)化雙功能試劑的意義重大。

    2-[(4-異硫氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-SCN-Bn-DOTA)是一種被廣泛應(yīng)用的雙功能螯合試劑,如與牛血清白蛋白(BSA)和雞蛋清溶菌酶標(biāo)記可用于腫瘤的檢測(cè)[21],與利妥昔單抗[22]或核糖核酸[23]反應(yīng)標(biāo)記可以用于抗腫瘤藥的生物分布和顯影的研究,還可以與聚乙二醇[24]標(biāo)記得到膠束用于制劑研發(fā)等。它的化學(xué)結(jié)構(gòu)較DOTA-NHS-ester穩(wěn)定,不易發(fā)生水解反應(yīng),這對(duì)于標(biāo)記反應(yīng)條件的確立十分有利,并可以通過螯合金屬離子標(biāo)記氨基多肽?;趐-SCN-Bn-DOTA的標(biāo)記方法的建立不僅有望開發(fā)一種新型的金屬標(biāo)記試劑,用于腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)的多重定量分析,而且可將該試劑用于RGD肽的標(biāo)記,從而有利于腫瘤受體顯像劑的開發(fā)。本研究建立了基于雙功能試劑p-SCN-Bn-DOTA的螯合金屬元素標(biāo)記多肽新技術(shù),并成功標(biāo)記RGD等標(biāo)準(zhǔn)肽段。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    Ultraflex II基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS,德國布魯克公司);Discovery DV215CD分析天平(美國OHAUS公司);HQ-60渦旋混勻器(北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司);PMC-060掌上離心機(jī)(日本TOMY公司)。

    α-氰基-4-羥基肉桂酸(德國布魯克公司);標(biāo)準(zhǔn)合成肽段 LGEYGFQNALIVR由吉爾生化(上海)有限公司合成;RGD肽由北京中??滇t(yī)藥科技發(fā)展有限公司合成;三乙二胺碳酸鹽(TEAB)、氯化銪(EuCl3)(美國Sigma-Aldrich公司);p-SCN-Bn-DOTA(美國 Macrocyclics 公司);其它試劑均為國產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q(美國Millipore公司)超純水。

    2.2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.2.1 p-SCN-Bn-DOTA與標(biāo)準(zhǔn)肽段的偶聯(lián)反應(yīng) 100 μL 0.5 μmoL p-SCN-Bn-DOTA溶于二甲基甲酰胺(DMF), 50 μL 0.68 μmoL肽段LGEYGFQNALIVR溶于TEAB。將兩種溶液以不同比例混合進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng),考察TEAB的濃度和pH值、DOTA與肽段的摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等條件對(duì)偶聯(lián)效率的影響。其中肽段的終濃度始終為0.05 nmol/μL。稱取RGD肽 1 mg, 加DMF 124 μL,供p-SCN-Bn-DOTA與RGD肽的偶聯(lián)反應(yīng)。

    2.2.2 偶聯(lián)產(chǎn)物與金屬離子的螯合反應(yīng)

    向2.2.1中的反應(yīng)體系加入5 μL 0.1 mol/L EuCl3溶液(鹽酸-乙酸鈉緩沖液或乙酸-乙酸銨緩沖液),再分別加入相應(yīng)的不同pH值的緩沖液50 μL,考察pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合效率的影響。

    2.2.3 MALDI-TOF-MS分析 (1)干點(diǎn)法點(diǎn)樣 取1 μL分析樣品點(diǎn)于Ground steel靶板上,自然干燥后,再點(diǎn)5 mg/mL CHCA基質(zhì)溶液(0.1%TFA-50%乙腈溶液)1 μL,自然干燥后進(jìn)行質(zhì)譜分析。(2)薄層法點(diǎn)樣 先在靶板上點(diǎn)0.5 μL CHCA基質(zhì)的乙醇過飽和溶液,自然干燥后,再點(diǎn)1 μL CHCA基質(zhì)溶液(5 mg/mL,0.1% TFA-50% 乙腈溶液)和樣品的混合溶液。采用Peptide Calib standard mono 作為標(biāo)準(zhǔn)品校正,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5 ppm。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集采用反射模式。儀器控制軟件為FlexControl software verion 3.0,數(shù)據(jù)處理軟件為FlexAnalysis software verion 3.0。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 雙功能試劑的選擇

    目前針對(duì)巰基的金屬元素標(biāo)記方法較多,標(biāo)記氨基的金屬元素標(biāo)記方法研究較少,已有的標(biāo)記N-端氨基的方法有轉(zhuǎn)氨法等,如先將蛋白的游離N-端氨基轉(zhuǎn)化為活性的羰基,然后與連有肼的熒光基團(tuán)反應(yīng)得到標(biāo)記分子[25] 。氨基的金屬標(biāo)記,理論上可以標(biāo)記所有的肽段,對(duì)所有的肽段和蛋白質(zhì)(含巰基和不含巰基的)都能進(jìn)行定量研究[2,20,26,27]。p-SCN-Bn-DOTA是一種雙功能螯合試劑,可與肽段的氨基共價(jià)結(jié)合,并通過絡(luò)合反應(yīng)螯合金屬離子,與Wang等[18]采用的DOTA-NHS-ester相比,其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,不易水解,既能夠明確反應(yīng)體系中水相和有機(jī)相的比例,又有利于確定反應(yīng)體系的pH值,這些均利于標(biāo)記反應(yīng)條件的確立。

    3.2 金屬元素和標(biāo)準(zhǔn)肽段的選擇

    p-SCN-Bn-DOTA可與多種稀土金屬離子形成螯合物,其中與鑭系金屬離子形成的螯合物穩(wěn)定性最佳[28],故選鑭系金屬離子Eu作為螯合標(biāo)簽。

    標(biāo)準(zhǔn)肽段的選擇應(yīng)具有典型性,由于實(shí)際的生物樣本大多是通過胰酶酶解成肽段,肽段C端是精氨酸(R)或者賴氨酸(K),故選用常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白的胰酶酶解肽段LGEYGFQNALIVR作為標(biāo)準(zhǔn)肽段之一;RGD肽由于在腫瘤診斷和治療中的重要意義而被選作為標(biāo)準(zhǔn)肽段。

    3.3 肽段的金屬元素標(biāo)記反應(yīng)原理

    肽段的金屬元素標(biāo)記反應(yīng)的原理如圖1所示,首先是肽段的氨基與p-SCN-Bn-DOTA發(fā)生共價(jià)反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物再與鑭系金屬元素形成穩(wěn)定螯合物。

    以產(chǎn)物和反應(yīng)物的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜峰峰面積計(jì)算標(biāo)記反應(yīng)的效率,標(biāo)記效率(%)= 產(chǎn)物峰面積/(產(chǎn)物峰面積+原肽峰面積)×100%。

    3.4 p-SCN-Bn-DOTA與標(biāo)準(zhǔn)肽段偶聯(lián)反應(yīng)的優(yōu)化

    3.4.1 緩沖體系對(duì)p-SCN-Bn-DOTA標(biāo)記反應(yīng)的影響 考察了3種緩沖體系NaHCO3-Na2CO3體系、DMF-三乙胺體系以及三乙二胺TEAB體系。對(duì)于0.5 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖液(pH 8.8),由于反應(yīng)產(chǎn)物鹽濃度過高,需要稀釋50倍以上才能被MALDI-TOF檢測(cè)到,而且鈉鹽是不可揮發(fā)性鹽,Na+對(duì)質(zhì)譜可能產(chǎn)生的干擾不易去除。Scheinberg等[29]將p-SCN-Bn-DOTA與肽段GGGFC在無水的DMF -三乙胺體系中反應(yīng),但是實(shí)際的生物樣品酶解產(chǎn)物是含水的體系,因此純有機(jī)溶劑的DMF-三乙胺體系不適用于生物樣品酶解產(chǎn)物分析。而TEAB是可揮發(fā)性碳酸鹽,p-SCN-Bn-DOTA與肽段LGEYGFQNALIVR(m/z 1479)可以在TEAB緩沖體系中反應(yīng)生成標(biāo)記產(chǎn)物(m/z 2031),而且結(jié)晶狀態(tài)好,適合質(zhì)譜檢測(cè),因此, 選擇TEAB體系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化。

    3.4.2 p-SCN-Bn-DOTA的量與肽段量的比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記反應(yīng)的影響 由于標(biāo)記反應(yīng)中影響標(biāo)記效率的因素眾多[30,31],本研究考察了p-SCN-Bn-DOTA量與肽段量的比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素,結(jié)果如表1所示。由表1可見,p-SCN-Bn-DOTA和肽段的摩爾比為32倍,在60℃反應(yīng)60 min時(shí),標(biāo)記效率最高,因此選擇上述條件為最佳反應(yīng)條件。與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的DOTA-NHS-ester 50倍過量于肽段、肽段的終濃度為0.125 nmol/μL相比,本方法反應(yīng)試劑的用量少,而且適用的肽段的濃度更低,顯示出更高的標(biāo)記靈敏度。肽段和標(biāo)記產(chǎn)物的質(zhì)譜圖如圖2所示。

    3.4.3 反應(yīng)體系中有機(jī)相與水相比例的考察 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化過程中,為保證肽段的終濃度一致,需要改變有機(jī)相和水相的比例來實(shí)現(xiàn)其它參數(shù)的調(diào)整。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi),反應(yīng)體系中水的比例越高,標(biāo)記效率越低, 最佳有機(jī)相與水相之比為4∶1~5∶1(V/V)。

    3.4.4 緩沖體系濃度及pH值對(duì)反應(yīng)的影響 緩沖體系濃度及pH值是影響螯合劑配位能力的主要因素。本研究考察了0.1, 0.2和0.5 mol/L TEAB緩沖溶液在pH值分別為6.5,7.5,8.5,9.5 時(shí)DOTA與肽段的偶聯(lián)效率,用三乙胺和冰醋酸調(diào)節(jié)pH值。結(jié)果表明,緩沖體系為0.2 mol/L TEAB, pH 8.5的條件下偶聯(lián)效率較高,且重現(xiàn)性好。

    3.5 p-SCN-Bn-DOTA與RGD肽的偶聯(lián)反應(yīng)

    按照2.2.1節(jié)實(shí)驗(yàn)方法制備RGD肽,在優(yōu)化的條件下,即緩沖體系為0.2 mol/L TEAB(pH 8.5),與p-SCN-Bn-DOTA在60℃進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)60 min, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,標(biāo)記效率為90.6%。

    3.6 反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及pH值對(duì)螯合反應(yīng)的影響

    對(duì)于EuCl3與DOTA 偶聯(lián)產(chǎn)物的標(biāo)記反應(yīng),分別考察了乙酸銨-乙酸(HAc-NH4Ac),鹽酸-乙酸鈉(HCl-NaAC)反應(yīng)體系;反應(yīng)溫度為30℃,60℃和100℃;反應(yīng)時(shí)間為15和60 min;pH值為4.0和5.5時(shí)的標(biāo)記效率。結(jié)果如表3及圖4所示, 其中在pH 4.0 的HCl-NaAC緩沖液中,60℃反應(yīng)60 min標(biāo)記效率最高,而且酸性條件下(pH 4.0),可以減少金屬離子和肽段的非特異性結(jié)合。

    3.7 MALDI檢測(cè)方法的考察

    對(duì)用于MALDI檢測(cè)的樣品點(diǎn)樣方法進(jìn)行了考察,比較了干點(diǎn)法和薄層法兩種方法。如圖5所示,結(jié)果顯示干點(diǎn)法相對(duì)較好,結(jié)晶狀態(tài)均勻,樣品檢測(cè)靈敏度高。

    4 結(jié) 論

    本研究通過雙功能試劑p-SCN-Bn-DOTA與RGD等標(biāo)準(zhǔn)肽段反應(yīng),考察與鑭系金屬元素Eu 螯合效率,對(duì)螯合稀土金屬標(biāo)記肽段的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。p-SCN-Bn-DOTA與標(biāo)準(zhǔn)肽段反應(yīng)的條件為:DOTA 為肽段的32倍,緩沖體系為0.2 mol/L TEAB,pH 8.5,反應(yīng)溫度60℃,反應(yīng)時(shí)間為60 min; 偶聯(lián)產(chǎn)物與金屬離子反應(yīng)的條件為:pH 4.0的HCl/NaAC緩沖體系中反應(yīng)60 min。MALDI-TOF檢測(cè)時(shí)樣品點(diǎn)樣方法使用干點(diǎn)法較好。本研究結(jié)果表明, p-SCN-Bn-DOTA在標(biāo)記RGD等多肽上有良好的應(yīng)用,有望成為一種新的高靈敏度金屬標(biāo)記試劑和腫瘤受體顯像劑。

    References

    1 Lee S, Xie J, Chen X. Chem. Rev., 2010, 110(5): 3087-3111

    2 Kerr T J, McLean J A. Chem. Commun., 2010, 46(30): 5479-5481

    3 Ang C Y, Tan S Y, Zhao Y. Org. Biomol. Chem., 2014, 12(27): 4776-4806

    4 Von Wallbrunn A, Hltke C, Zühlsdorf M, Heindel W, Schfers M, Bremer C. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2007, 34(5): 745-754

    5 DI Li-Juan, ZHANG Xu-Chu, ZHANG Chun-Li, WANG Rong-Fu. Labeled Immunoassays and Clinical Medicine, 2007, 14(1): 58-61

    邸麗娟, 張旭初, 張春麗, 王榮福. 標(biāo)記免疫分析與臨床, 2007, 14(1): 58-61

    6 HUANG Yan-Yan, ZHAO Rui. Journal of Instrumental Analysis, 2012, 32(9): 1184-1190

    黃嫣嫣, 趙 睿. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2012, 32(9): 1184-1190

    7 Shiba K. Chem. Soc. Rev., 2010, 39(1): 117-126

    8 Gygi S P, Rist B, Gerber S A, Turecek F, Gelb M H, Aebersold R. Nat. Biotechnol., 1999, 17(10): 994-999

    9 Yao X, Freas A, Ramirez J, Demirev P A, Fenselau C. Anal. Chem., 2001, 73(13): 2836-2842

    10 Ong S E, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen D B, Steen H, Pandey A, Mann M. Mol. Cell. Proteom., 2002, 1(5): 376-386

    11 Ross P L, Huang Y N, Marchese J N, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin D J. Mol. Cell. Proteom., 2004, 3(12): 1154-1169

    12 LI Jia-Bin, ZHOU Lian-Qi, YAN Hui, LI Nan-Nan, HAO Fei-Ran, TIAN Fang, ZHANG Yang-Jun. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(4): 361-368

    李佳斌, 周廉淇, 顏 輝, 李楠楠, 郝斐然, 田 芳, 張養(yǎng)軍. 色譜, 2014, 32(4): 361-368

    13 Whetstone P A, Butlin N G, Corneillie T M, Meares C F. Bioconjug. Chem., 2004, 15(1): 3-6

    14 Ahrends R, Pieper S, Kühn A, Weisshoff H, Hamester M, Lindemann T, Scheler C, Lehmann K, Taubner K, Linscheid MW. Mol. Cell. Proteom., 2007, 6(11): 1907-1916

    15 He Y, Esteban-Fernández D, Linscheid M W. Talanta, 2015, 134: 468-475

    16 XU Ming, YANG Li-Min, WANG Qiu-Quan. Chinese J. Anal.Chem., 2015, 43(9): 1265-1271

    徐 明, 楊利民, 王秋泉. 分析化學(xué), 2015, 43(9): 1265-1271

    17 Liu H, Zhang Y, Wang J, Zhou C, Cai Y, Qian X. Anal. Chem., 2006, 78(18), 6614-6621

    18 Wang X, Zhang Y J, Wang X Y, Lin H J, Qin W J, Qian X H. Anal. Methods, 2012, (4): 1629-1632

    19 Wang X Y, Wang X, Qin W J, Lin H J, Wei J Y, Zhang Y J, Qian X H. Analyst, 2013, 138: 5309-5317

    20 Wang Xin, Development and Application of a Novel Method for Multiplex Proteomic Quantitation Based on Metal Element Labeling Coupled with Mass Spectrometry, Academy of Military Medical Science, Beijing. 2012

    王 昕. 金屬元素標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組多重定量新方法研究及應(yīng)用, 北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2012

    21 Jakubowski N, Waentig L, Hayen H, Venkatachalam A, Bohlen A V, Roosb P H, Andreas M. J. Anal. At. Spectrom., 2008, 23: 1497-1507

    22 Cooper M S, Ma M T, Sunassee K, Shaw K P, Williams J D, Paul R L, Donnelly P S, Blower P J. Bioconjug. Chem., 2012, 23: 1029-1039

    23 Schlesinger J, Koezle I, Bergmann R, Tamburini S, Bolzati C, Tisato F, Noll B, Klussmann S, Vonhoff S, Wuest F, Pietzsch H J, Steinbach J. Bioconjug. Chem., 2008, 19(4): 928-939

    24 Fonge H, Huang H, Scollard D, Reilly RM, Allen C. J. Control Release, 2012, 157(3): 366-374

    25 Dong S Y, Zhao Z W, Ma H M. J. Proteome Res., 2006, 5(1): 26-31

    26 Whetstone P A, Butlin N G, Corneillie T M, Meares C F. Bioconjug. Chem., 2004, 15(1): 3-6

    27 Ahrends R, Pieper S, Kühn A, Weisshoff H, Hamester M, Lindemann T, Scheler C, Lehmann K, Taubner K, Linscheid M W. Mol. Cell. Proteom., 2007, 6(11): 1907-1916

    28 Izatt R M, Pawlak K, Bradshaw J S, Bruening R L. Chem. Rev., 1991, 91(8): 1721-2085

    29 Antczak C, Jaggi J S, LeFave C V, Curcio M J, McDevitt M R, Scheinberg D A. Bioconjug. Chem., 2006, 17(6): 1551-1560

    30 MI Wei, WANG Jing, YING Wan-Tao, CAI Yun, QIAN Xiao-Hong. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38(10): 1393-1399

    米 薇, 王 晶, 應(yīng)萬濤, 蔡 耘, 錢小紅. 分析化學(xué), 2010, 38(10): 1393-1399

    31 ZHANG Ai-Hong, LIN Hong-Jun, HUANG Shun-Xiang, ZHOU Xue-Zhi. Jounral of Chinese Mass Spectometry Society, 2014, 35(5): 427-437

    張愛紅, 林虹君, 黃順祥, 周學(xué)志. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2014, 35(5): 427-437

    Abstract A novel labeling approach with good compatibility based on 2-(4-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (p-SCN-Bn-DOTA) was established. The labeling conditions of p-SCN-Bn-DOTA with standard peptides were optimized, and the labeling efficiency of macrocyclic complex of p-SCN-Bn-DOTA with lanthanide metal ion Eu was also investigated. The labeling process was a two-step reaction. The labeling efficiency was affected by several factors including pH, buffer, reaction time, reaction temperature, and ratio of p-SCN-Bn-DOTA to peptide. The optimized conditions were as followed: the first step of labeling reaction was reacted in 0.2 mol/L triethylene diamine (TEAB) (pH 8.5) buffer for 60 min at 60℃, and the molar ratio of p-SCN-Bn-DOTA with peptide was 32. The second step of rare earth metal chelating was in pH 4.0 HCl/NaAC buffer for 60 min at 60℃. This approach was successfully applied in RGD peptide labeling.

    Keywords Bifunctional chelating reagents; Labeling; Peptide; Protein quantification; Mass spectrometry

    猜你喜歡
    多肽質(zhì)譜
    氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀在農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用及維護(hù)
    “質(zhì)譜技術(shù)在核工業(yè)中的應(yīng)用”專輯
    高多肽含量苦瓜新品種“多肽3號(hào)”的選育
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    吹掃捕集-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定水中18種揮發(fā)性有機(jī)物
    酶法制備大豆多肽及在醬油發(fā)酵中的應(yīng)用
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:07
    胎盤多肽超劑量應(yīng)用致嚴(yán)重不良事件1例
    徐寒梅:創(chuàng)新多肽藥物研究與開發(fā)
    棗霜化學(xué)成分的色譜質(zhì)譜分析
    Modeled response of talik development under thermokarst lakes to permafrost thickness on the Qinghai-Tibet Plateau
    给我免费播放毛片高清在线观看| 久久6这里有精品| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品av视频在线免费观看| 偷拍熟女少妇极品色| 99在线视频只有这里精品首页| 国产乱人偷精品视频| 婷婷亚洲欧美| www日本黄色视频网| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲国产色片| 波多野结衣巨乳人妻| 91久久精品电影网| 国产一区二区激情短视频| 在现免费观看毛片| 国产成人a区在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 草草在线视频免费看| 两个人视频免费观看高清| 欧美3d第一页| 日本熟妇午夜| 国产伦精品一区二区三区视频9| 天美传媒精品一区二区| 欧美中文日本在线观看视频| av在线亚洲专区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲无线在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 婷婷亚洲欧美| 婷婷六月久久综合丁香| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲图色成人| 精品熟女少妇av免费看| 国国产精品蜜臀av免费| 国产日本99.免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产私拍福利视频在线观看| 最近在线观看免费完整版| 又黄又爽又刺激的免费视频.| av天堂中文字幕网| 亚州av有码| 一本久久中文字幕| 99热这里只有是精品50| 国产爱豆传媒在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 成年免费大片在线观看| 久久久久国产网址| 亚洲综合色惰| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品不卡视频一区二区| 婷婷色综合大香蕉| 插阴视频在线观看视频| 国产av麻豆久久久久久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲18禁久久av| 国产亚洲精品久久久com| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 精品久久久久久久末码| 国产精品一区二区免费欧美| 22中文网久久字幕| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 黄片wwwwww| 亚洲国产精品成人综合色| 午夜精品国产一区二区电影 | 日本成人三级电影网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产亚洲精品久久久com| 黄色欧美视频在线观看| ponron亚洲| 久久久久久久午夜电影| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美日韩国产亚洲二区| 热99在线观看视频| 日本一二三区视频观看| 99久久精品一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 有码 亚洲区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲人成网站在线观看播放| 深夜a级毛片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 熟女电影av网| 国产精品三级大全| 如何舔出高潮| 插逼视频在线观看| 成年女人永久免费观看视频| 精品日产1卡2卡| 伦理电影大哥的女人| 婷婷六月久久综合丁香| 久99久视频精品免费| 人人妻人人看人人澡| 亚洲美女黄片视频| 亚洲av熟女| 国产美女午夜福利| 国产色婷婷99| 一进一出抽搐gif免费好疼| 99热这里只有是精品50| 欧美区成人在线视频| av天堂在线播放| 国产亚洲91精品色在线| 最近手机中文字幕大全| 亚洲不卡免费看| 国产探花极品一区二区| 国产av在哪里看| 美女大奶头视频| 激情 狠狠 欧美| 久久精品夜色国产| 国产 一区 欧美 日韩| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲精品亚洲一区二区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久亚洲精品不卡| 国产成人aa在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久99热这里只有精品18| 男人的好看免费观看在线视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 免费观看人在逋| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 我的女老师完整版在线观看| 69人妻影院| 极品教师在线视频| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲自拍偷在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 好男人在线观看高清免费视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 寂寞人妻少妇视频99o| 长腿黑丝高跟| 国产成人aa在线观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 麻豆国产97在线/欧美| 可以在线观看的亚洲视频| 国产av麻豆久久久久久久| 12—13女人毛片做爰片一| avwww免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 天美传媒精品一区二区| 性欧美人与动物交配| 亚洲在线自拍视频| 少妇高潮的动态图| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产精品三级大全| 在现免费观看毛片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 婷婷精品国产亚洲av| 婷婷色综合大香蕉| 超碰av人人做人人爽久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产av麻豆久久久久久久| 三级国产精品欧美在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 天天躁日日操中文字幕| aaaaa片日本免费| av专区在线播放| 国产成人精品久久久久久| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 一级毛片我不卡| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美三级亚洲精品| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲一区高清亚洲精品| 全区人妻精品视频| 日本a在线网址| 丝袜喷水一区| 欧美日韩在线观看h| 久久久久国内视频| 内射极品少妇av片p| 少妇丰满av| 久久久国产成人免费| 日本熟妇午夜| 哪里可以看免费的av片| 国产精品一二三区在线看| 午夜日韩欧美国产| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品电影一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久精品夜色国产| 精品不卡国产一区二区三区| 免费观看人在逋| 男女那种视频在线观看| 久久人人精品亚洲av| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美日本视频| 高清日韩中文字幕在线| 如何舔出高潮| 免费在线观看影片大全网站| 在线观看午夜福利视频| 亚洲最大成人中文| 有码 亚洲区| 免费黄网站久久成人精品| 国产高潮美女av| 69人妻影院| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲精品日韩av片在线观看| 三级毛片av免费| 在线观看66精品国产| 久久久久久久午夜电影| 精品久久久久久久久久免费视频| 一区福利在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲最大成人中文| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产成人a∨麻豆精品| 赤兔流量卡办理| www日本黄色视频网| 国产真实乱freesex| 伦理电影大哥的女人| 成人特级av手机在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 91av网一区二区| 简卡轻食公司| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲天堂国产精品一区在线| 午夜影院日韩av| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品国产高清国产av| 久久精品综合一区二区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品久久久久久久电影| 六月丁香七月| 久久久a久久爽久久v久久| 免费在线观看影片大全网站| 日韩制服骚丝袜av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人精品一区二区免费| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩成人伦理影院| 亚洲乱码一区二区免费版| 我要看日韩黄色一级片| 国产视频内射| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲最大成人av| 色播亚洲综合网| 91精品国产九色| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 男人舔女人下体高潮全视频| 99riav亚洲国产免费| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久久精品94久久精品| 国产视频内射| 国产精品国产高清国产av| 国产精品,欧美在线| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚洲在线观看片| 日韩av不卡免费在线播放| 一级毛片久久久久久久久女| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲中文字幕日韩| 九色成人免费人妻av| 欧美3d第一页| 一级黄色大片毛片| 欧美精品国产亚洲| 免费在线观看成人毛片| 色5月婷婷丁香| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲av不卡在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一本久久中文字幕| 成人亚洲欧美一区二区av| 一夜夜www| 18+在线观看网站| 亚洲av成人av| 国产精品一区二区免费欧美| 丰满人妻一区二区三区视频av| 老司机福利观看| 国产男靠女视频免费网站| 久久久国产成人免费| 99视频精品全部免费 在线| 嫩草影院新地址| 亚洲丝袜综合中文字幕| 我的女老师完整版在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| www日本黄色视频网| aaaaa片日本免费| 国产精品综合久久久久久久免费| 春色校园在线视频观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 毛片一级片免费看久久久久| 看十八女毛片水多多多| 日韩欧美免费精品| 国产成人一区二区在线| 免费大片18禁| 国产精品亚洲美女久久久| 天堂√8在线中文| 观看免费一级毛片| 日韩欧美三级三区| 亚洲图色成人| 国产成人91sexporn| 欧美另类亚洲清纯唯美| 一级a爱片免费观看的视频| 麻豆乱淫一区二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久99久视频精品免费| 精品熟女少妇av免费看| 久久午夜亚洲精品久久| 日本黄大片高清| 一边摸一边抽搐一进一小说| 在线观看66精品国产| 免费人成视频x8x8入口观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲av二区三区四区| 69人妻影院| 亚洲,欧美,日韩| 露出奶头的视频| 久久人妻av系列| 丰满的人妻完整版| 在线播放国产精品三级| 日日撸夜夜添| 国产在线精品亚洲第一网站| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | av卡一久久| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 一区二区三区四区激情视频 | 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲人成网站在线播| av国产免费在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品sss在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美又色又爽又黄视频| 少妇熟女欧美另类| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 99热全是精品| 午夜影院日韩av| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 18禁在线播放成人免费| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日韩欧美精品v在线| 精品人妻熟女av久视频| 国产极品精品免费视频能看的| 偷拍熟女少妇极品色| 午夜视频国产福利| 嫩草影院精品99| 可以在线观看毛片的网站| 久久中文看片网| 午夜久久久久精精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| av黄色大香蕉| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 欧美色视频一区免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人性生交大片免费视频hd| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日本黄色片子视频| 日韩中字成人| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品色激情综合| 男女那种视频在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一个人免费在线观看电影| 伊人久久精品亚洲午夜| 免费人成视频x8x8入口观看| 女同久久另类99精品国产91| 国内精品宾馆在线| 国产乱人视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 少妇人妻一区二区三区视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 欧美成人免费av一区二区三区| 日本色播在线视频| 久久精品国产亚洲av天美| 久久99热这里只有精品18| 国产在视频线在精品| 久久久久久久久大av| 男女那种视频在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 中文资源天堂在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久鲁丝午夜福利片| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲国产精品久久男人天堂| 干丝袜人妻中文字幕| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 成人漫画全彩无遮挡| 99热这里只有是精品50| 成人国产麻豆网| 最新在线观看一区二区三区| 色哟哟哟哟哟哟| 国产高清有码在线观看视频| 在线免费观看的www视频| 亚洲成人久久爱视频| 日本成人三级电影网站| 观看美女的网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久伊人网av| 久久久久久久久久久丰满| 99久久精品热视频| 国产精品永久免费网站| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美3d第一页| 中文字幕av成人在线电影| 99久国产av精品国产电影| 亚洲色图av天堂| а√天堂www在线а√下载| 免费av观看视频| 少妇的逼好多水| 最近最新中文字幕大全电影3| 一区福利在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精华一区二区三区| 99久久九九国产精品国产免费| 日本免费a在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 床上黄色一级片| 99热这里只有是精品50| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美色欧美亚洲另类二区| 永久网站在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 黄色配什么色好看| 高清毛片免费观看视频网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 99热全是精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 老司机影院成人| 又粗又爽又猛毛片免费看| 女人被狂操c到高潮| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲图色成人| 长腿黑丝高跟| 国产成人一区二区在线| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 久99久视频精品免费| 悠悠久久av| 欧美成人a在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲无线在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 两个人视频免费观看高清| 网址你懂的国产日韩在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品人妻久久久久久| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲成人av在线免费| 成人性生交大片免费视频hd| 国产精品国产高清国产av| 六月丁香七月| 成人毛片a级毛片在线播放| 99热6这里只有精品| 国产精品福利在线免费观看| 国产中年淑女户外野战色| 国产高潮美女av| 天堂√8在线中文| 一本一本综合久久| 在线观看66精品国产| 免费搜索国产男女视频| 尾随美女入室| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 一本精品99久久精品77| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 精品欧美国产一区二区三| 一级黄色大片毛片| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 久久韩国三级中文字幕| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美日韩乱码在线| 国产免费男女视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 91在线观看av| 俄罗斯特黄特色一大片| 91狼人影院| 欧美一区二区国产精品久久精品| av在线亚洲专区| 中国美女看黄片| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲欧美精品综合久久99| 一进一出好大好爽视频| 97超碰精品成人国产| 夜夜爽天天搞| 大型黄色视频在线免费观看| 免费黄网站久久成人精品| 99在线人妻在线中文字幕| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 成年女人永久免费观看视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 最新中文字幕久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一区二区三区四区激情视频 | 有码 亚洲区| 又黄又爽又免费观看的视频| 麻豆成人午夜福利视频| 久久精品国产自在天天线| 青春草视频在线免费观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产成人精品久久久久久| 成人二区视频| 波多野结衣高清作品| 亚洲,欧美,日韩| 久久国内精品自在自线图片| 精品人妻视频免费看| 亚洲人成网站高清观看| 国产黄色小视频在线观看| 免费观看在线日韩| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 搡女人真爽免费视频火全软件 | 深夜精品福利| 免费看光身美女| 亚洲欧美日韩高清专用| 3wmmmm亚洲av在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 精品久久久久久成人av| 欧美性猛交黑人性爽| 国产高清不卡午夜福利| 少妇人妻精品综合一区二区 | 成年女人永久免费观看视频| 网址你懂的国产日韩在线| 三级毛片av免费| 丰满的人妻完整版| av在线亚洲专区| 99久久精品国产国产毛片| 少妇人妻一区二区三区视频| 成人综合一区亚洲| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产老妇女一区| 国产69精品久久久久777片| 日韩欧美三级三区| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品一区www在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 日韩欧美在线乱码| 最近手机中文字幕大全| 搡老岳熟女国产| 联通29元200g的流量卡| 国产精品久久久久久av不卡| 午夜福利在线在线| 国产精品一区二区免费欧美| 两个人视频免费观看高清| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日本在线视频免费播放| 欧美性感艳星| 身体一侧抽搐| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 激情 狠狠 欧美| 日本-黄色视频高清免费观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 九色成人免费人妻av| 波野结衣二区三区在线| 午夜激情福利司机影院| 99热只有精品国产| 欧美激情久久久久久爽电影| 中文字幕精品亚洲无线码一区| av免费在线看不卡| 天天一区二区日本电影三级| 能在线免费观看的黄片| 日日撸夜夜添| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 好男人在线观看高清免费视频| 少妇丰满av| 在线播放无遮挡| 在现免费观看毛片| 国产精品av视频在线免费观看| 尾随美女入室| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美+日韩+精品| 最近在线观看免费完整版| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产色片| 高清日韩中文字幕在线| 久久鲁丝午夜福利片| 精品无人区乱码1区二区| www日本黄色视频网| 丝袜喷水一区| av女优亚洲男人天堂| 日本三级黄在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品野战在线观看| 免费观看人在逋| h日本视频在线播放| 在线看三级毛片| 哪里可以看免费的av片| 国产视频一区二区在线看| 午夜福利成人在线免费观看|