黃豆豆渣發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味化合物成分分析

宋 昊，鄭玉芝*

（1.北京一輕控股有限責(zé)任公司博士后工作站，北京 100022；2.北京一輕研究院食品工業(yè)研究所，北京 101111；3.中國科學(xué)院過程工程研究所博士后流動(dòng)站，北京 100190）

黃豆豆渣發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味化合物成分分析

宋 昊1,2,3，鄭玉芝2,*

（1.北京一輕控股有限責(zé)任公司博士后工作站，北京 100022；2.北京一輕研究院食品工業(yè)研究所，北京 101111；3.中國科學(xué)院過程工程研究所博士后流動(dòng)站，北京 100190）

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對黃豆豆渣的阿舒假囊酵母固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，研究不同型號萃取頭、萃取溫度、萃取時(shí)間和樣品量對揮發(fā)性成分萃取效果的影響，確定適宜的萃取條件。結(jié)果表明，7.5 g發(fā)酵產(chǎn)物在60 ℃恒溫條件下用50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷型萃取頭萃取30 min，獲得的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量和響應(yīng)強(qiáng)度較高，風(fēng)味化合物信息較為全面。豆渣經(jīng)發(fā)酵后揮發(fā)性成分發(fā)生很大變化，發(fā)酵產(chǎn)物共鑒定出57 個(gè)化合物，其關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)為醇類、萜類和酸類化合物，其中苯乙醇、香茅醇、香葉醇、3-甲基丁酸對發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)較大。

固相微萃取；揮發(fā)性物質(zhì)；黃豆豆渣；微生物發(fā)酵

黃豆富含多種人體必需的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、脂肪和氨基酸等，還含有異黃酮、卵磷脂、低聚糖、豆甾醇等多種生理保健功能性物質(zhì)[1]，一直以來是我國人民的主要食品之一。將黃豆制成豆?jié){、豆奶或豆腐的過程中，會(huì)產(chǎn)生大量去除可溶性蛋白的豆渣副產(chǎn)品，豆渣中含有25%左右的粗蛋白、10%左右的脂肪、40%以上的不溶性纖維、13%左右的可溶性纖維和5%左右的可溶性碳水化合物[2]，直接丟棄或作為粗制飼料都會(huì)造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。隨著人們對環(huán)境保護(hù)的日益重視以及生物質(zhì)資源綜合利用研究的蓬勃發(fā)展，

近年來，豆渣的綜合開發(fā)利用也得到了很大的發(fā)展[3-5]。通過微生物將豆渣中的纖維素等低值生物質(zhì)酶解轉(zhuǎn)化為各種高效能生物質(zhì)，可有效提高其營養(yǎng)價(jià)值和保健功能，實(shí)現(xiàn)豆渣的高值化綜合利用[6-9]。

在豆類原料的微生物發(fā)酵過程中，往往會(huì)產(chǎn)生非常豐富的揮發(fā)性物質(zhì)，構(gòu)成豆類發(fā)酵產(chǎn)品特殊的風(fēng)味，這是因?yàn)榘l(fā)酵過程中菌體會(huì)釋放出多種胞內(nèi)酶，如蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶等，而各種風(fēng)味物質(zhì)的形成與這些酶有直接關(guān)系，豆類中的蛋白、脂肪、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)在這些酶的作用下被降解成各類多肽、氨基酸、脂肪酸、低聚糖、單糖等，而這些小分子物質(zhì)可作為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體，經(jīng)氧化、醇化、酯化、分解以及Maillard反應(yīng)等各種復(fù)雜的生物活性過程，合成多種風(fēng)味化合物，形成豆類發(fā)酵產(chǎn)物的特征風(fēng)味。頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HSSPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)可以有效的對揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析鑒定，是目前應(yīng)用較為廣泛的食品風(fēng)味物質(zhì)分析方法。研究人員已使用該方法對多種傳統(tǒng)黃豆發(fā)酵制品如腐乳[10]、豆豉[11-12]、醬油[13]、納豆[14]等的風(fēng)味成分進(jìn)行了詳細(xì)分析。

本研究采用新鮮黃豆豆渣為原料，利用阿舒假囊酵母進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物具有其獨(dú)特的特征風(fēng)味，同時(shí)富含以VB2為主的多種B族維生素、VA、VE，以及大量人體所必需的氨基酸、微量元素和2 種重要的輔酶黃素腺嘌呤單核苷酸和黃素腺嘌呤二核苷酸，是一種具有豐富營養(yǎng)成分的復(fù)合營養(yǎng)強(qiáng)化劑[15-17]，可廣泛應(yīng)用于各種食品和飲料，如各類餅干、面包、營養(yǎng)強(qiáng)化面粉面條以及新型維生素功能飲料等，可有效增加B族維生素的攝入，提高人體健康水平；同時(shí)對于健胃養(yǎng)胃，預(yù)防消化道炎癥、口腔炎癥等具有積極效果[18-19]。本實(shí)驗(yàn)采用HS-SPME方法結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)，研究不同型號萃取頭、萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品量對揮發(fā)性成分萃取效果的影響，優(yōu)化HS-SPME條件，分析發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分及相對含量變化，可為阿舒假囊酵母固態(tài)發(fā)酵復(fù)雜代謝途徑的研究提供基礎(chǔ)依據(jù)，同時(shí)也可為建立良好的固態(tài)發(fā)酵風(fēng)味控制工藝提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyi Guillierm）中國普通微生物菌種保藏管理中心；新鮮東北黃豆敦化市德立糧貿(mào)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司；SPME手動(dòng)進(jìn)樣器、HS-SPME萃取頭（50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/ carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、100 μm）PDMS美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 黃豆豆渣固態(tài)發(fā)酵工藝

[20]工藝，選取市售新鮮黃豆→烘烤→熱水浸泡1 h→去皮→制渣（豆渣含水量50%～60%）→豆渣滅菌→接種10%阿舒假囊酵母菌液→28～30 ℃避光發(fā)酵10d→80 ℃烘干粉粹→取樣測定其揮發(fā)性風(fēng)味成分。

1.3.2 SPME

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，取適量黃豆豆渣發(fā)酵產(chǎn)物，置于15 mL頂空樣品瓶中，加蓋密封，在實(shí)驗(yàn)溫度條件下平衡30 min。將預(yù)先進(jìn)行高溫老化（240 ℃，30 min）后的SPME針頭插入頂空樣品瓶，推出萃取纖維頭，在實(shí)驗(yàn)溫度條件下頂空萃取，最后將萃取頭插入色譜進(jìn)樣口，在240 ℃解吸5 min，進(jìn)行GC-MS分析[21-22]。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：DB-WAX（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度240 ℃；載氣He；流速1.5 mL/min；不分流進(jìn)樣；升溫程序：40 ℃保持3 min，5 ℃/min升溫至120 ℃，保持4 min，8 ℃/min升溫至200 ℃，保持8 min，10 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度240 ℃；離子源溫度230 ℃；母離子m/z 285；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 30.00～500.00。

1.3.4 SPME條件優(yōu)化

選擇不同型號的SPME纖維頭、萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品量作為可能影響揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析的主要因素，以GC-MS檢出的化合物出峰數(shù)量及主體風(fēng)味物質(zhì)的峰面積為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，優(yōu)化SPME條件。

在優(yōu)化所得的最適萃取條件下，分析未接種時(shí)的豆渣培養(yǎng)基的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，作為空白對照。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 SPME纖維頭選擇

7.5 g黃豆豆渣發(fā)酵產(chǎn)物，60 ℃條件下在頂空瓶中平衡30 min備用。分別選取4 種不同的SPME纖維頭：75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS，在60 ℃條件下萃取30 min，每種萃取頭做3 次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.5.2 萃取溫度選擇

7.5 g黃豆豆渣發(fā)酵產(chǎn)物，分別在25（實(shí)驗(yàn)室恒定室溫）、40、60、80 ℃條件下在頂空瓶中平衡30 min備用。選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，分別在上述相應(yīng)溫度條件下萃取30 min，在每種溫度條件下做3 次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.5.3 萃取時(shí)間選擇

7.5 g黃豆豆渣發(fā)酵產(chǎn)物，60 ℃條件下在頂空瓶中平衡30 min備用。選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在60 ℃條件下，分別萃取20、30、40 min，每種萃取時(shí)間做3 次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.5.4 樣品量選擇

分別將2.5、5.0、7.5、10.0 g黃豆豆渣發(fā)酵產(chǎn)物在頂空瓶中平衡30 min備用。選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在60 ℃的條件下萃取30 min。每種樣品量做3 次重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃豆豆渣發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味成分萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 SPME纖維頭的選擇

SPME纖維頭采用的固定相或吸附劑一般由非極性的PDMS、弱極性的DVB和CAR幾種材料復(fù)合而成，以針對用以吸附不同類型的揮發(fā)性化合物。選擇4 種常見的具有不同固定相或吸附劑涂層的SPME纖維頭，分別為100 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/ DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS。型號為100 μm PDMS的萃取頭（紅色）一般用于小分子揮發(fā)性非極性物質(zhì)的萃取，75 μm CAR/PDMS型萃取頭（黑色）常用于痕量揮發(fā)性有機(jī)物的檢測，65 μm PDMS/DVB型萃取頭（藍(lán)色）則用于弱極性揮發(fā)性物質(zhì)的檢測，50/30 μm DVB/ CAR/PDMS型萃取頭（灰色）復(fù)合了這幾種固定相材料，適應(yīng)性更為廣泛，適用于C3～C20的大范圍揮發(fā)性物質(zhì)分析。

表1 不同萃取頭萃取黃豆發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味成分及其相對含量比較Table 1 Comparison of the composition and relative contents of volatile components in fermented okara extracted by using different fi bers

結(jié)果表明，在100 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS這4 種萃取頭的萃取物中，分別檢出了20、61、46、57 種化合物，其中100 μm PDMS與65 μm PDMS/DVB型的萃取頭對于黃豆豆渣發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)的萃取效率明顯較低。詳細(xì)分析75 μm CAR/PDMS和50/30 μm DVB/CAR/ PDMS 2 種萃取頭的萃取化合物類型及其所占相對含量，如表1所示。

2 種不同材質(zhì)萃取頭萃取得到的黃豆發(fā)酵產(chǎn)物的主要揮發(fā)性風(fēng)味成分類型基本是一致的，其風(fēng)味成分由以下幾類化合物構(gòu)成：苯乙醇為主的芳香醇類化合物；以香茅醇、香葉醇為代表的萜類化合物；以3-甲基丁酸為主的酸類化合物；吡嗪類化合物。比較2 種萃取頭萃取的化合物數(shù)量和相對含量，可以看出由于75 μm CAR/ PDMS型萃取頭適宜于痕量化合物的萃取，萃取物數(shù)量略多于50/30 μm DVB/CAR/PDMS型萃取頭，但檢定出的這些痕量化合物如2-苯氧乙醇、山梨醇、8-甲基-6-壬烯酸、3-甲基-2-丁烯酸、2-乙基己酸、葡萄糖、辛糖、苯酚等，所占相對含量都非常低，75 μm CAR/PDMS型萃取頭檢出而50/30 μm DVB/CAR/PDMS型萃取頭未能檢出的這些痕量揮發(fā)性化合物的相對含量之和僅為2.19%，非發(fā)酵產(chǎn)物的主體風(fēng)味物質(zhì)。而50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對萜類化合物的萃取能力遠(yuǎn)高于75 μm CAR/ PDMS型萃取頭，黃豆的阿舒假囊酵母固態(tài)發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的特殊風(fēng)味其主要成分即為萜類化合物，所以選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS型萃取頭進(jìn)行萃取較為適宜。豆類發(fā)酵產(chǎn)品的香氣成分非常豐富，揮發(fā)性化合物極性分布廣泛，采用廣譜性的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭與以往的相關(guān)研究[23-25]相吻合。

2.1.2 萃取溫度對SPME的影響

表2 不同萃取溫度條件下SPME發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量比較Table 2 Comparison of the composition of volatile components of fermented okara extracted at different temperatures

分別在25、40、60、80 ℃恒溫條件下進(jìn)行SPME，檢測發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，如表2所示。當(dāng)萃取溫度偏低時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)在頂空瓶中的揮發(fā)效率不佳，萃取不完全。萃取溫度的升高有利于揮發(fā)性物質(zhì)從固相中溢出，使得其在頂空瓶氣相中含量增加，萃取頭達(dá)到吸附平衡時(shí)則能夠吸附更多的揮發(fā)性化合物。但同時(shí)，當(dāng)萃取溫度偏高時(shí)，會(huì)加劇某些揮發(fā)性物質(zhì)的流失，可以看出，當(dāng)萃取溫度提高至80 ℃，吡嗪類化合物和脂肪醇數(shù)量明顯下降，對于這些化合物而言，持續(xù)升高萃

取溫度反而會(huì)使得其萃取效率下降。另外，在80 ℃的SPME得到的揮發(fā)性化合物中，檢測到其他溫度條件下未檢出的幾種長鏈脂肪酸（酯），沸點(diǎn)較高，出峰時(shí)間靠后，如：豆蔻酸、棕櫚酸（酯）、硬脂酸（酯）、油酸、亞油酸等，但其相對含量較低，總體僅占檢出揮發(fā)性成分相對含量的3.41%，不是發(fā)酵產(chǎn)物的主體風(fēng)味物質(zhì)。

同時(shí)，從萃取得到的揮發(fā)性化合物中篩選出幾種占香氣成分中主體地位的代表性物質(zhì)：苯乙醇、香葉醇、香茅醇及3-甲基丁酸，總結(jié)其譜圖峰面積隨萃取溫度變化的趨勢，從化合物響應(yīng)強(qiáng)度上比較不同萃取溫度的差異，如圖1所示，當(dāng)萃取溫度在60 ℃以下時(shí)，苯乙醇、香葉醇、香茅醇和3-甲基丁酸的峰面積隨溫度升高逐漸增大，但當(dāng)溫度繼續(xù)提升至80 ℃后，峰面積反而開始減小，說明這些物質(zhì)在萃取頭上的吸附穩(wěn)定性不強(qiáng)，高溫易致使這些揮發(fā)性成分從萃取頭上發(fā)生解吸，出現(xiàn)部分流失。

圖1 不同萃取溫度條件下SPME發(fā)酵產(chǎn)物主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的峰面積比較Fig. 1 Comparison of peak areas of key volatile components of fermented okara extracted at different temperature

綜上，SPME萃取得到的揮發(fā)性化合物數(shù)量隨萃取溫度的升高而增加，但當(dāng)萃取溫度提高至60 ℃以上時(shí)，萃取得到的揮發(fā)性化合物數(shù)量總量變化較小，且在高溫條件下溢出的微量風(fēng)味化合物并非發(fā)酵產(chǎn)物的主體風(fēng)味物質(zhì)。同時(shí)，香氣體系中占主體地位的幾種風(fēng)味化合物隨著萃取溫度提升至60 ℃以上后，均出現(xiàn)不同程度的流失。因此，選擇60 ℃作為最佳萃取溫度較為適宜。

2.1.3 萃取時(shí)間對SPME的影響

表3 萃取時(shí)間對SPME發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量的影響Table 3 Comparison of the composition of volatile components of fermented okara at different extraction times

從表3可以看出，萃取時(shí)間分別為20、30、40 min時(shí)，能夠萃取得到的揮發(fā)性風(fēng)味化合物數(shù)量分別為52、57、56 種，揮發(fā)性化合物總數(shù)量相近，且各種不同類型的化合物在不同萃取時(shí)間條件下數(shù)量變化也較小。

圖2 不同萃取時(shí)間條件下SPME發(fā)酵產(chǎn)物主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的峰面積比較Fig. 2 Comparison of peak areas of volatile components of fermented okara at different extraction times

如圖2所示，萃取時(shí)間為20 min時(shí)，萃取動(dòng)態(tài)平衡可能尚未達(dá)到，所以萃取效率未達(dá)到最佳。隨著萃取時(shí)間的延長，幾種主要的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的峰面積都有一定程度的增加。但當(dāng)萃取時(shí)間從30 min提升至40 min時(shí)，它們的峰面積變化不明顯，或有小幅的下降趨勢，這可能是由于萃取時(shí)間較長而造成的解吸所致。綜上，萃取時(shí)間對SPME效率的影響較小，綜合考慮SPME得到的揮發(fā)性風(fēng)味化合物數(shù)量及其相應(yīng)響應(yīng)強(qiáng)度，選擇30 min作為最佳萃取時(shí)間。

2.1.4 樣品量對SPME的影響

表4 不同樣品量對SPME揮發(fā)性風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量的影響Table 4 Comparison of the composition of volatile components of fermented okara at different sample masses

如表4所示，當(dāng)樣品量為2.5、5.0、7.5、10.0 g時(shí)，可檢出的揮發(fā)性物質(zhì)出峰數(shù)量分別為42、56、57、58 種?？梢钥闯觯S著樣品量增多，得到的揮發(fā)性物質(zhì)總量增多。但當(dāng)樣品量大于5.0 g時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)的種類、數(shù)量和響應(yīng)強(qiáng)度變化并不明顯，尤其對于發(fā)酵產(chǎn)物的主體風(fēng)味物質(zhì)如芳香醇類、萜類、酸類和吡嗪類化合物，在樣

品量為7.5 g和10.0 g條件下，揮發(fā)性成分的數(shù)量變化表現(xiàn)出了非常好的時(shí)。這是由于在15 mL的頂空瓶中，樣品量大于7.5 g時(shí)瓶內(nèi)氣氛在達(dá)到萃取平衡時(shí)飽和度較好，各種揮發(fā)性化合物均得到了充分的釋放和吸附。值得注意的是，當(dāng)樣品量大于7.5 g后，樣品在15 mL樣品瓶中所占空間較大，在進(jìn)行SPME各種操作時(shí)易造成萃取頭的污染。因此，本實(shí)驗(yàn)中最佳樣品量定為7.5 g。

2.1.5 SPME重復(fù)實(shí)驗(yàn)誤差分析

采用由上述單因素試驗(yàn)所確定的最適萃取條件，考察SPME方法在萃取黃豆發(fā)酵產(chǎn)物時(shí)的重復(fù)性。分別以發(fā)酵產(chǎn)物的主要揮發(fā)性成分類別的相對含量為指標(biāo)進(jìn)行重復(fù)性的考察，結(jié)果見表5。

表5 黃豆發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分SPME實(shí)驗(yàn)重復(fù)性分析結(jié)果Table 5 Experimental reproducibility analysis of volatile components of fermented okara based on optimized HS-SPME

經(jīng)計(jì)算，黃豆發(fā)酵產(chǎn)物各類揮發(fā)性成分相對含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）最大值為3.80%，最小值為0.24%，平均值為1.91%；GS-MS檢測其總峰面積的RSD為1.33%。其中主要的幾種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的相對含量分別為苯乙醇22.37%、cis-，trans-香葉醇18.05%、3-甲基丁酸15.28%、香茅醇11.96%，其RSD分別為0.40%、1.33%、3.21%和1.09%。說明SPME方法萃取黃豆發(fā)酵產(chǎn)物中的揮發(fā)性成分分析的重復(fù)性良好。

2.2 最適萃取條件下黃豆豆渣發(fā)酵產(chǎn)物中的主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物

表6 黃豆豆渣固態(tài)發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化Table 6 Identifi ed volatile components and their relative contents in fresh and fermented okara

續(xù)表6

續(xù)表6

由表6可知，未經(jīng)發(fā)酵的黃豆豆渣其主要揮發(fā)性成分是吡嗪類化合物、檸檬烯和1-辛烯-3-醇，其中檸檬烯和1-辛烯-3-醇隨著發(fā)酵的進(jìn)行消失，而發(fā)酵前豆渣中吡嗪類化合物的響應(yīng)強(qiáng)度（峰面積為1.54×109）大于豆渣經(jīng)發(fā)酵后培養(yǎng)物中的響應(yīng)強(qiáng)度（峰面積為9.88×108），因此認(rèn)為雖然隨著發(fā)酵的進(jìn)行產(chǎn)生了幾種發(fā)酵前未檢出的吡嗪類化合物，但作為豆類及堅(jiān)果類食品主體風(fēng)味物質(zhì)的吡嗪類化合物并不是阿舒假囊酵母發(fā)酵產(chǎn)物的關(guān)鍵呈味物質(zhì)。

經(jīng)過阿舒假囊酵母的生長代謝過程，黃豆豆渣在發(fā)酵前后成分發(fā)生了很大變化，同時(shí)產(chǎn)生了大量新的揮發(fā)性成分，形成了發(fā)酵產(chǎn)物獨(dú)特的風(fēng)味。發(fā)酵前后揮發(fā)性成分總數(shù)、種類及相對含量的變化，說明微生物發(fā)酵過程對揮發(fā)性成分的產(chǎn)生有決定性的作用。在發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性成分中相對含量較高的是以香茅醇、香葉醇為代表的萜類化合物、苯乙醇及3-甲基丁酸等，其中香茅醇、香葉醇、異香葉醇、香茅醛、香葉酸等萜類化合物在未經(jīng)發(fā)酵的豆渣培養(yǎng)基中并未檢出，而在發(fā)酵產(chǎn)物中大量出現(xiàn)，占揮發(fā)性成分總量的35%以上，為發(fā)酵產(chǎn)物的主體風(fēng)味物質(zhì)。此外，苯乙醇在發(fā)酵前僅占1.26%，響應(yīng)強(qiáng)度（峰面積為6.61×107），發(fā)酵過后，苯乙醇相對含量明顯增加，占揮發(fā)性成分總量的22.37%，響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到（峰面積為2.80×109）。在酵母細(xì)胞中，苯乙醇可通過莽草酸途徑形成的苯丙酮酸脫羧脫氫形成，也可由苯丙氨酸經(jīng)Ehrlich途徑直接轉(zhuǎn)化[26]。

該黃豆發(fā)酵產(chǎn)物的可檢出揮發(fā)性物質(zhì)成分非常豐富，主要有芳香醇、脂肪醇、吡嗪類、萜類、醛類、酮類、酸類、酯類、雜環(huán)類九大類。經(jīng)過發(fā)酵，芳香醇、脂肪醇、吡嗪類、萜類、雜環(huán)類揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量均有明顯增加，而未發(fā)酵豆渣中存在的多種芳香族苯環(huán)化合物在發(fā)酵產(chǎn)物中消失。值得注意的是，發(fā)酵前豆渣中的幾種不飽和長鏈脂肪酸在發(fā)酵結(jié)束后未被檢出，而具有辛辣氣味和酸味的3-甲基丁酸則在發(fā)酵產(chǎn)物中大量存在，占揮發(fā)性物質(zhì)成分總量的15.28%。

綜上，在最優(yōu)SPME條件下，阿舒假囊酵母的黃豆發(fā)酵產(chǎn)物中的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分包括：苯乙醇（22.37%）、cis-，trans-香葉醇（18.05%）、cis-，trans-異香葉醇（3.27%）、3-甲基丁酸（15.28%）、香茅醇（11.96%）、吡嗪類化合物（7.89%）。

3 結(jié) 論

SPME方法對樣品的預(yù)處理簡便，環(huán)境友好，是一種準(zhǔn)確率高，操作簡單的揮發(fā)性化合物成分分析方法。受不同型號萃取頭、萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品量等環(huán)境因素的影響，SPME方法萃取得到的揮發(fā)性物質(zhì)成分及其響應(yīng)強(qiáng)度也會(huì)產(chǎn)生較大差異。本實(shí)驗(yàn)研究上述4 種因素對萃取效果的影響，通過單因素試驗(yàn)，階段性選擇最優(yōu)條件，得到適宜于黃豆的阿舒假囊酵母發(fā)酵產(chǎn)物的萃取條件為采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS型萃取頭、萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間30 min、樣品量7.5 g。在此條件下，檢出發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性化合物成分57 個(gè)。其中具有新鮮面包味和玫瑰花香的苯乙醇，具有玫瑰甜香的萜類物質(zhì)香茅醇、香葉醇以及具有辛辣味、酸味以及尖刺的奶酪味的3-甲基丁酸對發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味形成貢獻(xiàn)較大。這些揮發(fā)性化合物互相融合，共同形成了發(fā)酵產(chǎn)物非常獨(dú)特的風(fēng)味。

相關(guān)文獻(xiàn)[27-29]表明，萃取頭和萃取溫度的選擇對SPME效果影響較大。而樣品量和萃取時(shí)間等因素則有一個(gè)最適值，小于該值時(shí)，萃取效果不佳，高于該值后，則不再有明顯影響，這是由于萃取頭對揮發(fā)性成分的吸附和解吸是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡過程，當(dāng)頂空瓶內(nèi)達(dá)到飽和狀態(tài)后，萃取效率也趨于穩(wěn)定，這與本研究結(jié)果是一致的。在此研究基礎(chǔ)上，其他類型的萃取頭匹配不同的萃取溫度是否會(huì)得到更多揮發(fā)性成分，這幾種影響因素之間的交互作用是否會(huì)對萃取效果產(chǎn)生復(fù)雜影響還需要進(jìn)一步驗(yàn)證分析。

發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味是由各種揮發(fā)性化合物成分綜合而成，發(fā)酵工藝中的各種因素如溫度、含水量、發(fā)酵時(shí)間等都會(huì)對發(fā)酵過程有很大影響，而在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種復(fù)雜代謝產(chǎn)物則是風(fēng)味成分的主要來源，因此發(fā)酵工藝與發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味有著直接關(guān)系。在本研究的基礎(chǔ)上，可探索通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行增香，

或抑制其不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生，更好地進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)控制。此外，發(fā)酵過程中主要揮發(fā)性副產(chǎn)物的檢出，也為進(jìn)一步探索固態(tài)發(fā)酵途徑及微生物代謝機(jī)理提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

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式中:表示對第m-1幀純凈語音的功率譜估計(jì),表示對第m-1幀的噪聲功率譜估計(jì)。α為調(diào)節(jié)系數(shù),它的選取至關(guān)重要,其取值越接近1對“音樂噪聲”的抑制效果越好,但是會(huì)造成比較大的語音失真,α取值0.95～0.99時(shí)效果較佳[6],max函數(shù)返回兩個(gè)參數(shù)的最大值,SNRpost(m,k)表示后驗(yàn)信噪比,定義后驗(yàn)信噪比為:

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Analysis of Volatile Components in Metabolites from Okara Fermentation

SONG Hao1,2,3, ZHENG Yuzhi2,*
(1. Postdoctoral Programme, Beijing YIQING Holding Co. Ltd., Beijing 100022, China; 2. Beijing Industrial Technology Research Institution, Beijing 101111, China; 3. Postdoctoral Program, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)

The volatile components of the solid state fermented okara by Eremothecium ashbyi Guillierm were analyzed by headspace solid phase micro-extraction (HS-SPME) coupled with gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS). The effects of different fi bers, extraction temperature, extraction time and sample mass on the extraction effi ciency were investigated by single factor methods. The optimal extraction conditions were determined by addition of 7.5 g fermented okara and extraction proceeded for 30 min using 50/30 μm DVB/CAR/PDMS fi ber at 60 ℃. Apparent changes in the kinds and amounts of volatile constituents were found during the fermentation. A total of 57 volatile compounds were identifi ed in the fermented okara. Alcohols, acids and terpenoids were the key fl avor compounds. Phenylethyl alcohol, citronellol, geraniol and 3-methyl butanoic acid made greater contributions to the fl avor.

headspace solid phase micro-extraction (HS-SPME); volatile compounds; okara; microbial fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201610030

TS207.3

A

1002-6630（2016）10-0176-07

宋昊, 鄭玉芝. 黃豆豆渣發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味化合物成分分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(10)： 176-182. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201610030. http：//www.spkx.net.cn

SONG Hao, ZHENG Yuzhi. Analysis of volatile components in metabolites from okara fermentation[J]. Food Science, 2016, 37(10): 176-182. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610030. http://www.spkx.net.cn

2015-09-17

朝陽區(qū)博士后工作經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（2015ZZ-017）

宋昊（1979—），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槭称放c微生物發(fā)酵。E-mail：lyfd2002@163.com

*通信作者：鄭玉芝（1965—），女，教授級高級工程師，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：zhengyuzhi@bitri.cn