響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化水芹黃酮超聲波輔助提取工藝及其抗氧化性

千春錄，侯順超，殷健東，林 晨，劉 笑，顧 林，金昌海，陳學(xué)好，李良俊,*

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)水生蔬菜研究室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化水芹黃酮超聲波輔助提取工藝及其抗氧化性

千春錄1，侯順超1，殷健東1，林 晨1，劉 笑1，顧 林1，金昌海1，陳學(xué)好2,3，李良俊2,3,*

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)水生蔬菜研究室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

以水芹為試材，采用超聲波輔助方法提取其黃酮，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取水芹黃酮工藝，最后對(duì)水芹黃酮抗氧化活性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明：最佳工藝條件為料液比1∶38（g/mL）、超聲時(shí)間62 min、超聲溫度69 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，在此條件下，水芹葉黃酮提取量為8.201mg/g（鮮質(zhì)量），該結(jié)果與預(yù)測(cè)值8.238 mg/g接近，表明所建數(shù)學(xué)模型與實(shí)際情況擬合較好。水芹葉黃酮含量遠(yuǎn)高于莖稈，且都有較強(qiáng)的抗氧化能力，其中莖稈黃酮抗氧化能力強(qiáng)于葉黃酮，這可能是莖稈和葉黃酮成分差異所致。

水芹；黃酮；超聲提?。豁憫?yīng)面法；抗氧化性

水芹（Oenanthe javanica）為傘形花科芹菜屬2a生植物，富含抗壞血酸、維生素、膳食纖維、多酚、鈣磷鐵等多種礦質(zhì)元素[1]。水芹的嫩莖和葉柄可作蔬菜食用[2]，同時(shí)具有降血壓、預(yù)防糖尿病、預(yù)防心臟病等病癥的功能[3-7]，是一種具有保健功能的藥食同源蔬菜。水芹在國(guó)內(nèi)多地都有分布，其栽培歷史悠久，以中國(guó)的東部和南部居多，近年來在長(zhǎng)江流域等地形成了特色的水芹產(chǎn)業(yè)，其栽培面積和消費(fèi)量逐年增加。國(guó)內(nèi)水芹主要用于鮮食，其功能成分分析和深加工需進(jìn)一步研究。

黃酮類化合物普遍存在于植物體內(nèi)，有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、保護(hù)植物免受紫外線損傷的作用，且具有較高的抗氧化和清除自由基活性。黃酮類物質(zhì)也是一種藥用成分，可以抗癌、防癌，治療心腦血管疾病，還可以降低血糖，增強(qiáng)非特異性免疫功能和體液免疫功能，以及具有抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性等廣譜的藥理活性，在藥物資源上具有重要地位[8-11]。目前，黃酮類化合物提取方法主要有溶劑提取法、大孔吸附樹脂法、超聲波和微波輔助提取法、超臨界流體提取法等[12-19]。超聲波輔助提取操作方便、提取效率高、耗時(shí)短，已被廣泛應(yīng)用到各種黃酮類物質(zhì)的提取，但在水芹黃酮提取中的應(yīng)用鮮見報(bào)道。水芹含有多種生物活性物質(zhì)，包括芹菜素及其糖苷、山奈酚、水蓼素、槲皮素及其糖苷、木犀草素等黃酮類物質(zhì)以及咖啡酸、綠原酸等酚酸類物質(zhì)[20-23]。水芹中黃酮類物質(zhì)是水芹藥用功能的活性物質(zhì)，且含量較高[3-7,20-23]，有效提取水芹黃酮類物質(zhì)，是水芹深入開發(fā)的前提。本研究通過超聲波輔助提取，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法分析對(duì)水芹黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)水芹黃酮類物質(zhì)抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為水芹功能成分分析和深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水芹（Oenanthe javanica (Bl.) DC. cv. Fuqin No. 1）宜興市豐匯水芹專業(yè)合作社；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸鹽緩沖液、磷酸鈉、鉬酸銨、硫酸（H2SO4）、抗壞血酸（VC）（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；UV-7504c紫外-可見分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司；XH-2008D電腦智能溫控低溫超聲波合成萃取儀 北京祥科技發(fā)展有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水芹黃酮的提取

將水芹葉和莖稈分開，每次準(zhǔn)確稱取水芹葉或莖稈2.000 g，加入1 mL的70%乙醇溶液碾磨成漿，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，并調(diào)節(jié)料液比，置于超聲萃取儀內(nèi)，設(shè)定一定超聲溫度，水浴一定時(shí)間，期間進(jìn)行超聲波（功率60 W）輔助提取，將提取液減壓抽濾，收集濾液，所得濾渣再次用前法提取，合并兩次濾液，定容至100 mL，搖勻后測(cè)定黃酮的含量。

1.3.2 黃酮含量的測(cè)定

采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法測(cè)定黃酮含量[24]。

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，相當(dāng)于蘆丁0、75、150、300、450、600 μg移入10 mL刻度比色管中，加入80%乙醇溶液至4 mL，各加1 mL磷酸鹽緩沖液和5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，振搖后放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，用80%乙醇溶液定容至10 mL，混勻后放置10 min；以零管為空白，搖勻后用1 cm的比色杯在510 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。由測(cè)定的吸光度和蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)含量，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.001 4X+0.013 6（X為蘆丁質(zhì)量/μg，Y為吸光度；R2=0.997 0）。

1.3.2.2 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確吸取試樣溶液1 mL，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中的操作步驟，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出試樣吸光度相應(yīng)的蘆丁含量，按式（1）求出樣品黃酮提取量：

式中：X1為樣品的黃酮提取量/（mg/g）；m1為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)液中黃酮含量/μg；V2為待測(cè)液的總體積/mL；m2為供試品取樣量/g；V1為待測(cè)液移取的體積/mL。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 料液比對(duì)黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 g水芹葉（莖稈），加入1 mL的70%乙醇溶液碾磨成漿，按1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）的料液比分別加入70%乙醇溶液，在70 ℃條件下超聲提取60 min后，抽濾得到提取液，定容至100 mL，測(cè)定黃酮含量。

1.3.3.2 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 g水芹葉（莖稈），加入1 mL的70%乙醇溶液碾磨成漿，按1∶35的料液比加入70%乙醇溶液，在70 ℃條件下，分別超聲提取40、50、60、70、80 min后，抽濾得到提取液，定容至100 mL，測(cè)定黃酮含量。

準(zhǔn)確稱取2.000 g水芹葉（莖稈），加入1 mL的70%乙醇溶液碾磨成漿，按1∶35的料液比加入70%乙醇溶液，分別在50、60、70、80、90 ℃條件下，超聲提取60 min后，抽濾得到提取液，定容至100 mL，測(cè)定黃酮含量。

1.3.3.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取量的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 g水芹葉（莖稈），加入1 mL的70%乙醇溶液碾磨成漿，按1∶35的料液比分別調(diào)整乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%，在70 ℃條件下超聲提取60 min后，抽濾得到提取液，并定容至100 mL，測(cè)定黃酮含量。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

采用Design-Expert 7.0.0軟件中的Box-Behnken方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）3 個(gè)因素，以黃酮提取量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)各因素及水平見表1。由單因素試驗(yàn)可知水芹莖稈黃酮含量較低，且改變各因素條件其提取量變化不顯著，所以用響應(yīng)面法優(yōu)化水芹葉黃酮的提取工藝。

表1 水芹葉黃酮提取響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Variables and levels used in response surface design for fl avonoid extraction from Oenanthe javanica

1.3.5 總抗氧化能力的測(cè) 定

采用磷鉬絡(luò)合物法測(cè)定，配制終濃度為0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L鉬酸銨（16.5 mL硫酸、5.32 g磷酸鈉、2.471 7 g鉬酸銨，用蒸餾水溶解并定容至500 mL）的磷鉬試劑。取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.4 mL，加入4 mL磷鉬試劑，置于95 ℃水浴鍋90 min，在695 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定其吸光度。用相同質(zhì)量濃度的VC溶液作陽性對(duì)照，吸光度越高，總抗氧化活性越強(qiáng)。

1.3.6 DPPH自由基清除率的測(cè)定

有一天，老公下班回家看到我正和鄰居大媽說這些，把這情景偷偷攝了下來。晚上，他拿出視頻給我看?？粗曨l里的自己，我覺得好陌生。他說：“我一直覺得你知書達(dá)理，現(xiàn)在怎么會(huì)變成這樣？”我自己也呆住了。

取不同質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液3 mL，加入1 mL用無水乙醇配制的DPPH溶液，振蕩混勻后置于暗處，室溫條件下反應(yīng)30 min，用無水乙醇調(diào)零，在517 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度為Ax；空白組為用3 mL無水乙醇代替樣品溶液，其余處理同上，在517 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度為A0；對(duì)照組為1 mL無水乙醇代替DPPH溶液，其余處理同上，在517 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度為Ax0；并以相同質(zhì)量濃度的VC水溶液做對(duì)照，清除率按式（2）計(jì)算[25]：

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著性測(cè)定采用Tukey多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 料液比（a）、超聲時(shí)間（b）、超聲溫度（c）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（d）對(duì)黃酮提取量的影響Fig. 1 Effect of solid-to-liquid ratio (a), ultrasonic time (b), temperature (c) and ethanol concentration (d) on fl avonoid yield

溶劑用量增加有利于黃酮物質(zhì)溶解析出，但隨溶劑用量增加，其對(duì)提取量增加效果減小，同時(shí)增加提取成本。由圖1a可知，隨著溶劑用量的增加，水芹葉黃酮提取量增加，在料液比1∶35時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著提取溶劑用量繼續(xù)增大，水芹葉黃酮提取量不再增大。水

芹莖稈黃酮含量較低，其提取量隨溶劑的比例增加而提高，在料液比1∶25時(shí)達(dá)到最大，但與其他料液比的水芹莖稈黃酮提取量差異不顯著。

超聲波能產(chǎn)生強(qiáng)烈空化效應(yīng)和攪拌作用，從而增加溶劑穿透力，加速溶質(zhì)析出，從而提高提取效率。由圖1b可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，水芹葉黃酮提取量增加，在時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)達(dá)到最大值，此后呈下降趨勢(shì)。水芹莖稈黃酮提取量在50 min時(shí)達(dá)到最大值，但與其他超聲時(shí)間的水芹莖稈黃酮提取量差異不顯著。

超聲溫度升高可加快分子擴(kuò)散速率，從而促進(jìn)黃酮類物質(zhì)析出，然而超聲溫度過高也會(huì)破壞部分黃酮的結(jié)構(gòu)并增加其他非黃酮物質(zhì)析出，影響黃酮活性和提取率。由圖1c可知，隨著超聲溫度升高，水芹葉黃酮提取量增加，當(dāng)超聲溫度為70 ℃時(shí)水芹葉黃酮提取量達(dá)到最大值，超過70 ℃后顯著（P＜0.05）下降。水芹莖稈黃酮提取量也在70 ℃時(shí)達(dá)到最大，但與其他超聲溫度的水芹莖稈提取量差異不顯著。

乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，其對(duì)組織細(xì)胞的穿透能力越強(qiáng)。由圖1d可知，水芹葉黃酮在80%乙醇溶液中提取量達(dá)到最大值，水芹莖稈黃酮在60%乙醇溶液中提取量達(dá)到最大值，在一定乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，葉和莖稈黃酮提取量變化不顯著。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定乙醇為提取劑，以水芹葉黃酮提取量為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The experimental design and results for response surface analysis

采用響應(yīng)面方法分析試驗(yàn)結(jié)果，得到以水芹葉黃酮提取量為響應(yīng)值的回歸方程：Y=8.044+0.61A+0.33B-0.29C-0.015AB+0.4AC-0.12BC-0.55A2-0.95B2-0.6C2。根據(jù)響應(yīng)面分析建立的數(shù)學(xué)模型，得到最佳提取工藝條件是：料液比1∶37.58、超聲時(shí)間61.75 min、超聲溫度69.11 ℃。在此條件下水芹葉黃酮提取量的預(yù)測(cè)值為8.238 mg/g（鮮質(zhì)量，下同）。驗(yàn)證預(yù)測(cè)值，當(dāng)料液比1∶38、超聲時(shí)間62 min、超聲溫度69 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)，得到的水芹葉黃酮提取量為8.201 mg/g，驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)值非常接近，說明所建模型與實(shí)際情況擬合較好。由此得到的超聲波輔助提取水芹黃酮的最佳工藝參數(shù)，在該工藝條件下提取水芹莖稈黃酮提取量為0.986 mg/g，該結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果差別不大。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fi tted quadratic polynomial model

圖2 各因素交互作用對(duì)黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖Fig. 2 Response surface and corresponding contour plots showing the effect of solid-to-liquid ratio, ultrasonic time and extraction temperature on fl avonoid yield

由表3和圖2可以看出，該模型P＜0.01，為極顯著，說明該回歸方程與試驗(yàn)擬和程度較好。一次項(xiàng)A、B、C均達(dá)到顯著水平；由3 個(gè)影響因素的F值大小可以得出，3個(gè)因素對(duì)水芹葉黃酮提取量影響大小的排序?yàn)椋毫弦罕龋境晻r(shí)間＞超聲溫度。

2.3 抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

由圖3a可知，水芹黃酮的總抗氧化能力隨其質(zhì)量濃度增加逐步上升，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，但明顯低于VC的總抗氧化能力。水芹莖稈黃酮的總抗氧化能力要強(qiáng)于葉黃酮，可能是由于黃酮成分的差異所致。由圖3b可知，水芹黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用隨其質(zhì)量濃度增加逐步上升，水芹莖稈黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力要大于葉黃酮。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到35 mg/L時(shí)，葉黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到82%，與VC對(duì)DPPH自由基的清除能力接近；莖稈黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到90%，與VC對(duì)DPPH自由基的清除能力相當(dāng)。

圖3 水芹黃酮總抗氧化能力（a）和對(duì)DPPH自由基的清除能力（b）Fig. 3 Total antioxidant capacity (a) and DPPH-radical scavenging capacity (b) of fl avonoid from Oenanthe javanica

3 結(jié) 論

以水芹為試材，用超聲波輔助法提取黃酮。單因素試驗(yàn)考察了料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)4 個(gè)因素對(duì)水芹黃酮提取的影響。采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)條件，得到最佳工藝為料液比1∶38、超聲時(shí)間62 min、超聲溫度69 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，在此條件下水芹葉黃酮提取量為8.201 mg/g（接近預(yù)測(cè)值8.238 mg/g）。另外，水芹黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化作用，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，水芹黃酮對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。水芹莖稈黃酮含量遠(yuǎn)低于葉，但是同質(zhì)量濃度水芹莖稈黃酮的總抗氧化能力和對(duì)DPPH自由基的清除能力要高于水芹葉黃酮。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Flavonoids from Oenanthe javanica and Their Antioxidant Activity

QIAN Chunlu1, HOU Shunchao1, YIN Jiandong1, LIN Chen1, LIU Xiao1, GU Lin1, JIN Changhai1, CHEN Xuehao2,3, LI Liangjun2,3,*
(1. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China; 2. School of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 3. Laboratory of Aquatic Vegetable, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

This study aimed to optimize the ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Oenanthe javanica using single-factor experiments and response surface methodology. The antioxidant activity of the extracted flavonoids was evaluated. The optimal extraction conditions were determined as follows: the time of ultrasonic-assisted extraction, 62 min; temperature, 69 ℃; solid-to-liquid ratio, 1:38 (g/mL); and ethanol concentration, 80%. Under these conditions, the predicted and experimental extraction yield of fl avonoids from leaves was 8.238 and 8.201 mg/g mf, respectively. The good consistency indicated the mathematical model we built could fi t experimental data well. The content of fl avonoids in leaves of O. javanica was much higher than in stems. The fl avonoids extracted from both parts possessed high total antioxidant capacity and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging ability and the fl avonoids from stems had stronger antioxidant ability than those in leave. This difference may be caused by the difference in the composition of fl avonoids extracted from stems and leaves.

Oenanthe javanica; fl avonoid; ultrasonic-assisted extraction; response surface methodology; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201610013

S636.9

A

1002-6630（2016）10-0076-06

千春錄, 侯順超, 殷健東, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化水芹黃酮超聲波輔助提取工藝及其抗氧化性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(10): 76-81. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610013. http://www.spkx.net.cn

QIAN Chunlu, HOU Shunchao, YIN Jiandong, et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Oenanthe javanica and their antioxidant activity[J]. Food Science, 2016, 37(10): 76-81. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610013. http://www.spkx.net.cn

2015-10-08

江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)基金）-青年基金項(xiàng)目（BK20140483）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（14KJB210010）；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014M560451）；揚(yáng)州大學(xué)科技創(chuàng)新培育基金項(xiàng)目（2014CXJ060）

千春錄（1982—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：clqian@yzu.edu.cn

*通信作者：李良?。?969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗卟擞N與開發(fā)。E-mail：ljli@yzu.edu.cn