結(jié)核感染T細胞斑點試驗在小兒結(jié)核診斷中的應用研究

吳青,李艷,徐萬洲,龔衛(wèi)杰,吳澤剛,蔡璇,韓瑞玲

(武漢大學人民醫(yī)院檢驗科,湖北 武漢 430060)

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結(jié)核感染T細胞斑點試驗在小兒結(jié)核診斷中的應用研究

吳青,李艷,徐萬洲,龔衛(wèi)杰,吳澤剛,蔡璇,韓瑞玲

(武漢大學人民醫(yī)院檢驗科,湖北 武漢 430060)

目的 探討結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)在小兒結(jié)核診斷中的應用價值。方法 回顧性分析78例疑似小兒結(jié)核患者病例，收集患者年齡、性別、是否接種卡介苗、臨床表現(xiàn)及診斷、結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)試驗及T-SPOT.TB檢測結(jié)果。結(jié)合最終臨床診斷，對比分析PPD與T-SPOT.TB檢測在小兒結(jié)核診斷中的應用價值。結(jié)果 78例疑似小兒結(jié)核患者分為確診及臨床診斷小兒結(jié)核組13例，排除小兒結(jié)核組65例。T-SPOT.TB和PPD檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為84.6%、100.0%、100.0%、97.0%和69.2%、76.9%、37.5%、90.9%。T-SPOT.TB檢測的敏感度、特異性均高于PPD，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 T-SPOT.TB檢測診斷小兒結(jié)核的敏感性、特異性均較高。T-SPOT.TB檢測可輔助診斷小兒結(jié)核，陰性結(jié)果有助于排除小兒結(jié)核。

結(jié)核感染T細胞斑點試驗;小兒結(jié)核;結(jié)核菌素試驗;診斷

近年來，結(jié)核分枝桿菌 (MTB) 感染所致的結(jié)核病已成為嚴重危害人類健康的傳染病之一[1-2]。0～14歲兒童由于其免疫力較低初次感染結(jié)核分枝桿菌后就有可能發(fā)展成結(jié)核病，如未能及時發(fā)現(xiàn)并診斷極易發(fā)展成重癥肺結(jié)核和肺外結(jié)核[3]。目前結(jié)核病確診手段依然是細菌學方法。但由于結(jié)核菌的遺傳特性，致使常規(guī)細菌學檢查方法存在著取材困難、靈敏度低、操作復雜，需時間較長等缺點[4]。結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)試驗是MTB感染篩查與輔助診斷的經(jīng)典方法，但其診斷敏感性、特異性均不能滿足臨床需要。因此，盡早發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染是預防與控制結(jié)核病的關(guān)鍵，尋求一個敏感度及特異度均較高的檢測方法已成為臨床的迫切需求。結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)是一種新型免疫學診斷方法。大量研究表明[5-7]結(jié)核特異抗原誘導活化分泌γ干擾素的T淋巴細胞可作為結(jié)核分枝桿菌感染的一種可靠標志物，已被廣泛應用于結(jié)核病的基礎(chǔ)研究和早期診斷等方面。本研究主要探討T-SPOT.TB在小兒結(jié)核診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年8月至2016年4月武漢大學人民醫(yī)院收治的疑似小兒結(jié)核的患者78例，其中男性37例，女性41例，年齡2個月～14歲，平均年齡(6.34±0.73)歲。根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、 影像學檢查、組織病理學檢查、病原學檢查結(jié)果以及抗結(jié)核治療效果進行診斷，分為小兒結(jié)核組(確診及臨床診斷組)患者13例，排除小兒結(jié)核患者65例。分組標準為：(1)確診組：結(jié)核桿菌培養(yǎng)、涂片或gene檢測陽性或有病理學證據(jù)者；(2)臨床診斷組：結(jié)核桿菌培養(yǎng)陰性，但臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、影像學檢查等支持結(jié)核感染，且抗結(jié)核治療有效；(3)排除患者：明確為其他疾病所致，或者經(jīng)其他治療(未經(jīng)抗結(jié)核治療) 病情改善或治愈。

1.2 PPD檢測 結(jié)核菌素純蛋白衍生物TB.PPD(北京祥瑞生物制品有限公司生產(chǎn))；于患者前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射TB.PPD 0.1 mol·L-1(5 U)，72 h后觀察注射部位的反應情況。參照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南》(2008版)[8]標準：硬結(jié)直徑<5 mm為陰性(-)，≥5～<10 mm為弱陽性(+)，≥10～≤20 mm為陽性(+++)，>20 mm或局部出現(xiàn)水泡、淋巴管炎、壞死等為強陽性(+++)。

1.3 T-SPOT.TB檢測 收集患者新鮮5 mL肝素鈉抗凝全血，使用試劑盒(T-SPOT TB，Oxford Immunote Ltd，Abingdon，UK) 從外周抗凝全血中分離出單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，在每個預包被抗人-γ干擾素抗體的板孔中加入2．5×105個單個核細胞(PBMCs)，再往4個單獨板孔中分別加入陰性對照試劑(細胞培養(yǎng)液)、兩種抗原(ESAT-6，CFP-10)及陽性對照，并置于37 ℃，5%CO2，且保持一定濕度(60%～80%)的培養(yǎng)箱孵育16～20 h后，利用堿性磷酸酶偶聯(lián)的二抗和底物顯色，洗板后對斑點進行計數(shù)。結(jié)果判定：抗原ESAT-6或CFP-10板孔中任意一孔點數(shù)與對照孔點數(shù)之差為6即為檢測陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，分別計算PPD和T-SPOT.TB試驗的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值。兩組比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、影像學檢查、組織病理學檢查、病原學檢查等結(jié)果，最終診斷為小兒結(jié)核共13例(確診小兒結(jié)核5例、臨床診斷小兒結(jié)核8例)；臨床診斷排除小兒結(jié)核65例。T-SPOT.TB與PPD檢查的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為84.6%、100.0%、100.0%、97.0%和69.2%、76.9%、37.5%、90.9%。T-SPOT.TB檢測的靈敏度(84.6%)和特異度(100.0%)均高于PPD,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。臨床診斷、T-SPOT.TB、PPD檢測結(jié)果見表1，兩種檢測方法的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值見表2。

表1 T-SPOT.TB與PPD檢測結(jié)果比較/例

表2 T-SPOT.TB與PPD對小兒結(jié)核診斷效能的比較/%

3 討論

結(jié)核是一種常見傳染病，由于居住條件的逐步提高和抗結(jié)核藥物的廣泛使用，使得結(jié)核的發(fā)病率明顯下降。但近年來，由于耐藥性結(jié)核桿菌的增加，結(jié)核的發(fā)生率有所上升[2]。0～14歲小兒作為一個特殊的群體，其感染后患病率高，病情嚴重，預后差。小兒結(jié)核自覺癥狀少，肺結(jié)核特別是肺外結(jié)核的標本采集困難。因此，臨床診斷小兒結(jié)核十分困難，如何早期診斷小兒結(jié)核是臨床共同關(guān)注的問題。PPD試驗具有快速、簡便、成本低的優(yōu)點，但在小兒檢測的靈敏度、特異度方面受患者免疫力影響較大。本研究中PPD試驗靈敏度為69.2%，與小兒免疫力低有關(guān)；特異度為76.9%，此受我國實行卡介苗接種的影響。

T-SPOT.TB作為一種新型免疫性診斷方法，為臨床醫(yī)學帶來了快速準確的結(jié)核病診斷方法。T-SPOT.TB試驗具有耗時少、取材方便、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。目前，歐美等發(fā)達國家均將T-SPOT.TB試驗列入結(jié)核病診療指南，成為替代診斷結(jié)核病的主要方法[9]。本研究顯示T-SPOT.TB試驗檢測小兒結(jié)核靈敏度為84.6%，與鐘一鳴等[10]報告的靈敏度為82.5%基本一致。T-SPOT.TB試驗可作為診斷小兒結(jié)核的有效方法。

小兒結(jié)核診斷困難，晚期引起嚴重的后遺癥。因此，早期診斷或鑒別診斷意義重大，本研究中11例診斷結(jié)核的患兒 T-SPOT.TB試驗檢測結(jié)果均為陽性，特異度為100%，盡管本研究的數(shù)量不足以得出明確結(jié)論，但研究提示T-SPOT.TB試驗陽性結(jié)果可以診斷小兒結(jié)核。

綜上所述，T-SPOT.TB試驗具有較高靈敏度、特異度，優(yōu)于PPD試驗，可輔助診斷小兒結(jié)核。T-SPOT.TB試驗陽性可診斷小兒結(jié)核。

[1] Zhao Y,Xu S,Wang L,et al.National survey of drug-resistant tuberculosis in China[J].N Engl J Med,2012,366(23):2161-2170.

[2] 全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查技術(shù)指導組,全國第五次結(jié)核病流病學抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國第五次結(jié)病流行病學抽樣調(diào)查報告[J].中國防癆雜志,2012,34(8):485-508.

[3] Boehme CC,Nabeta P,Hillemann D,et al.Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance[J].N Engl J Med,2010,363(11):1005-1015.

[4] Lee SW,Lee CT,Yim JJ.Serial interferon-gamma release assays during treatment of active tuberculosis in young adults[J].BMC Infect Dis,2010,10:300.

[5] 夏露，李鋒，裴寧，等.50例兒童骨結(jié)核臨床分析[J].中華傳染病雜志，2015，33(9)：553-555.

[6] Pigrau-Serrallach C，Rodríguez-Pardo D．Bone and joint tuberculosis[J].Eur Spine J，2013，22(4)：556-566.

[7] 成金英，鮑萬國，汪楊，等．T-SPOT.TB在發(fā)熱患者中的應用價值[J].中華傳染病雜志，2014，32(8)：484-485．

[8] 衛(wèi)生部疾病預防控制局,衛(wèi)生部醫(yī)政司，中國疾病預防控制中心.中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南(2008年版)[M].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2008：1-124.

[9] Ozekinci T,Ozbek E,Celik Y.Comparison of tuberculin skin test and a specific T-cell-based test,T-Spot．TB,for the diagnosis of latent tuberculosis infection[J]．J Int Med Res,2007,35(5)：696-703.

[10] 鐘一鳴,谷秀梅,劉文恩,等.T細胞斑點試驗輔助診斷不同部位肺外結(jié)核感染的應用[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2014,24(17):4415-4417.

Diagnostic performance of T-SPOT.TB assay in children with tuberculosis

WU Qing,LI Yan,XU Wanzhou,et al

(ClinicalLaboratoryDepartment，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan,Hubei430060,China)

Objective To evaluate the application value of T-SPOT.TB assay in the diagnosis of tuberculosis in children.Methods A total of 78 patients of children with suspected tuberculosis were enrolled in this retrospective study.Age,gender,imageology character,clinical manifestation and diagnosis,PPD and T-SPOT.TB testing result were collected.According to the results of clinical diagnosis,the diagnostic value of the two tests were evaluated and compared with each other.Results Thirteen patients had culture-confirmed or probable tuberculosis,and the remaining 65 patients did not have tuberculosis.The sensitivity,specificity,positive predictive value,and negative predictive value of PPD and T-SPOT.TB test were 84.6%,100.0%,100.0%,97.0% and 69.2%,76.9%,37.5%,90.9% respectively.The sensitivity and specificity of T-SPOT.TB assay were higher than PPD test (P<0.05).Conclusions Compared with PPD,T-SPOT.TB assay possesses more satisfactory sensitivity and specificity in the diagnosis of tuberculosis in children,which could provide useful support in diagnosing tuberculosis in children.And tuberculosis could be excluded based on a negative T-SPOT.TB assay.

T-SPOT.TB;Children;PPD test;Diagnosis

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.023

2016-05-20，

2016-10-08)