高效液相色譜法和生物效價(jià)測(cè)定法在縮宮素注射劑質(zhì)量控制中的對(duì)照研究

徐容

(南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校藥學(xué)醫(yī)技系，江蘇 南通 226000)

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高效液相色譜法和生物效價(jià)測(cè)定法在縮宮素注射劑質(zhì)量控制中的對(duì)照研究

徐容

(南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校藥學(xué)醫(yī)技系，江蘇 南通 226000)

目的 采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)縮宮素注射劑進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)與傳統(tǒng)的生物效價(jià)測(cè)定法進(jìn)行比照，觀察兩種方法的優(yōu)劣。方法 選取8個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的100個(gè)批次的縮宮素注射劑，分別采用HPLC法和生物效價(jià)法對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)定，并將結(jié)果進(jìn)行比較，并進(jìn)一步觀察樣品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。結(jié)果 兩種方法檢測(cè)的縮宮素含量除兩家藥企外(P=0.027、P=0.011)，其他企業(yè)生產(chǎn)的縮宮素含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.556、0.637、0.614、0.559、0.315、0.429)；8家藥企的縮宮素注射劑含量在55.9%～126.1%之間，平均98.5%，其中有三個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的縮宮素注射劑含量相對(duì)偏低；縮宮素注射劑儲(chǔ)存2年后其效價(jià)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)。結(jié)論 采用HPLC法對(duì)縮宮素注射劑測(cè)定，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，靈敏度和準(zhǔn)確度高，有效避免了生物效價(jià)測(cè)定法因動(dòng)物個(gè)體差異造成的誤差，同時(shí)也能將人為測(cè)定的誤差控制在較小的范圍內(nèi)。另縮宮素注射劑最佳存貯期為2年，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致藥劑中部分有效成分降解。

縮宮素；HPLC法；質(zhì)量控制；穩(wěn)定性

縮宮素(oxytocin)注射劑是臨床產(chǎn)科常用藥物，主要用于催產(chǎn)、引產(chǎn)及產(chǎn)后因?qū)m縮無力導(dǎo)致的子宮出血等癥狀[1]。它主要通過結(jié)合妊娠子宮平滑肌上相應(yīng)的受體，刺激子宮節(jié)律性收縮，在產(chǎn)婦宮縮無力難產(chǎn)時(shí)，增加子宮收縮強(qiáng)度和頻率，使胎兒順利娩出，此外，它還可刺激乳腺平滑肌，促進(jìn)乳汁分泌[2]。目前，國(guó)產(chǎn)縮宮素注射劑生產(chǎn)廠家繁多，質(zhì)量控制是不可或缺的重要環(huán)節(jié)，國(guó)家藥典中對(duì)于縮宮素質(zhì)量控制的主要方法還是生物效價(jià)測(cè)定法[3]，但該法由于用到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可能會(huì)因動(dòng)物個(gè)體差異產(chǎn)生一定的誤差，另外對(duì)研究人員的操作要求較高，后期在結(jié)果處理時(shí)人為因素干擾較大[4]。為建立一種更加客觀、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的質(zhì)控方法，筆者通過不斷改進(jìn)，建立以HPLC法測(cè)定宮縮素質(zhì)量的檢測(cè)方法，并與生物效價(jià)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 儀器和試劑

主要實(shí)驗(yàn)儀器包括美國(guó)Thermo公司TSQ Quantum Ultra三重四級(jí)桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司HP1100高效液相色譜儀，傅里葉變換紅外光譜儀，紫外分光光度計(jì)，紫外燈，奧爾科特立體器官測(cè)定系統(tǒng)，乙腈等。標(biāo)準(zhǔn)品縮宮素由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供(批號(hào)150529-200902)，去氨加壓素的標(biāo)準(zhǔn)品由GL Biochem公司生產(chǎn)(批號(hào)P100518-ZG061714)規(guī)格為每瓶5.7 mg，純度98.87%。本研究中用來分析的8個(gè)企業(yè)生產(chǎn)共100個(gè)批次的縮宮素注射劑規(guī)格均為10 IU·mL-1，另外取江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院2013年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)縮宮素注射液留樣，在10～20 ℃，相對(duì)濕度30%～50%下儲(chǔ)存，作為藥物穩(wěn)定性的研究標(biāo)本。

2 試驗(yàn)方法

2.1 生物效價(jià)測(cè)定法測(cè)定縮宮素效價(jià) 本研究中的生物效價(jià)測(cè)定法采用的是大鼠離體子宮法，實(shí)驗(yàn)前48 h于大鼠子宮兩側(cè)皮下注射乙烯雌酚，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天取處死小鼠子宮置于離體器官恒溫水浴裝置中，用生物記錄儀張力傳感器連接，供試品和標(biāo)準(zhǔn)品分別用生理鹽水進(jìn)行稀釋，分為高低不等的4個(gè)劑量，按照2010年版《中國(guó)藥典》[5]中縮宮素生物測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，借助藥典中量反應(yīng)平行線法對(duì)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，排除不可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，按照剩余結(jié)果計(jì)算效價(jià)。

2.2 高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定縮宮素效價(jià) 縮宮素HPLC法測(cè)定中，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，取940 mL磷酸二氫鈉(0.1 mol·L-1)溶液，同時(shí)加入60 mL(0.1 mol·L-1)磷酸氫二鈉溶液混勻，通過磷酸溶液將pH值調(diào)至6.0，取上述緩沖液作為流動(dòng)相A，將乙腈和水按照1∶1比例混勻，作為流動(dòng)相B，按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間0、5、35、35.1、45 min，對(duì)應(yīng)流動(dòng)相A百分率75%、75%、35%、75%、75%，對(duì)應(yīng)流動(dòng)相B百分率25%、25%、65%、25%、25%。取適量去氨加壓素和縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品，配制系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，其中每毫升溶液中含5 μg去氨加壓素和5 IU縮宮素，將試驗(yàn)溶液分離度控制在5.0以上。取縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品通過流動(dòng)相A稀釋至10 IU·mL-1作為對(duì)照溶液，另取適量待檢的縮宮素注射液，通過流動(dòng)相A進(jìn)行稀釋，稀釋濃度為10 IU·mL-1，作為供試品溶液，取供試品溶液100 μL進(jìn)樣，通過外標(biāo)法計(jì)算峰面積從而最終得出待檢注射劑中縮宮素含量。

3 方法學(xué)考察

3.1 專屬性考察 首先，按照“2.2”項(xiàng)中的方法配制只含有輔料的空白樣品溶液進(jìn)樣，色譜圖見圖1，通過圖1可以明確輔料對(duì)于樣品測(cè)定中的主峰無干擾。本研究中，我們通過多種破壞性試驗(yàn)，使待檢樣本中產(chǎn)生出各種雜質(zhì)，作為縮宮素雜質(zhì)對(duì)照品，通過觀察主峰和雜質(zhì)的分離情況，為縮宮素注射劑質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持。其中，破壞性試驗(yàn)取試驗(yàn)樣品三份，加入1 mL濃度為1 mol·L-1鹽酸，1 mL濃度為1 mol·L-1氫氧化鈉溶液，沸水中加熱三種方法進(jìn)行破壞，將破壞后的溶液pH調(diào)至7，按照“2.2”項(xiàng)中方法進(jìn)樣，分析色譜圖(見圖2)，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過破壞性試驗(yàn)產(chǎn)生的雜質(zhì)對(duì)照品中各雜質(zhì)與主峰分離度好，不干擾樣品測(cè)定。

圖1 空白輔料色譜圖

圖2 樣品與雜質(zhì)對(duì)照品主峰分離度色譜圖

3.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 以流動(dòng)相A將適量縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋成23.04、11.52、5.76、2.88、1.44、0.72、0.36 IU·mL-1的六種溶液，各取6種溶液100 μL，依次通過HPLC色譜儀進(jìn)行分析，將得到的色譜圖中縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積(A)和分別對(duì)應(yīng)的濃度(C)進(jìn)行線性回歸，從而建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=6.847×10-6X+0.432,r=0.998，同時(shí)也說明在此濃度范圍內(nèi)，縮宮素的濃度與峰面存在良好的線性關(guān)系。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將“2.2”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液分別于0、12、18、24、35 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)樣分析，計(jì)算上述時(shí)間點(diǎn)下測(cè)得的縮宮素峰值面積，未發(fā)現(xiàn)顯著性下降，證明供試品溶液的穩(wěn)定性較好。

3.4 檢驗(yàn)限度和定量限度 通過流動(dòng)相A稀釋縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品，濃度0.01～1 IU·mL-1，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，通過色譜圖觀察得出檢驗(yàn)限度為0.15 IU，定量限度為0.51 IU。

3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別量取100 μL縮宮素注射劑樣品6份，按照“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)樣，觀察色譜圖，通過外標(biāo)法計(jì)算得出各樣品含量平均值為98.4%，RSD<1.0%，證明該法具有良好的重復(fù)性。

3.6 回收率實(shí)驗(yàn) 取縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液3份，將濃度調(diào)至2、10、30 IU·mL-1，分別取上不同濃度的縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，同9份已知含量的縮宮素注射劑樣品混勻，通過液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜連用(LC-MS/MS)法測(cè)得從低到高三種濃度混合溶液的回收率分別為99.25%(RSD=0.72%)，99.41%(RSD=0.51%)，98.92%(RSD=0.78%)，平均回收率為99.27%。

3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS17.0進(jìn)行分析，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，率比較采用χ2檢驗(yàn)，進(jìn)一步的組間比較采用LSD檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 縮宮素注射劑含量測(cè)定 以“2.2”項(xiàng)方法對(duì)8家企業(yè)生產(chǎn)的100個(gè)批次縮宮素注射劑樣品含量進(jìn)行測(cè)定的色譜圖見圖3，通過計(jì)算各樣品含量在55.9%～126.1%之間，平均98.5%，其中有3個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的縮宮素注射劑含量偏低。對(duì)各企業(yè)的縮宮素注射劑含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.724，P=0.031，P<0.05)，表明這些企業(yè)在生產(chǎn)縮宮素注射劑過程中投料量差異較大，造成這些差異主要屬于人為原因造成，不在系統(tǒng)誤差之列，另外個(gè)別企業(yè)不同批次的縮宮素注射劑含量之間也存在差異，離散度較大，說明該企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量波動(dòng)較大，應(yīng)適當(dāng)改進(jìn)，見圖4。

圖3 各企業(yè)縮宮素注射劑色譜圖

圖4 各生產(chǎn)企業(yè)縮宮素注射劑含量

4.2 HPLC法和生物效價(jià)測(cè)定法測(cè)定縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品的精密度比較 根據(jù)“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)方法對(duì)縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，生物效價(jià)測(cè)定法9次測(cè)量結(jié)果分別為9.73、9.91、9.56、9.95、10.02、9.68、9.86、10.14、10.32 IU·mL-1，測(cè)定值變動(dòng)范圍9.56～10.32 IU·mL-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=3.4%，平均效價(jià)9.91 IU·mL-1；HPLC法的9次測(cè)量結(jié)果分別為9.78、9.82、9.91、9.88、9.89、9.96、9.85、9.79、9.88 IU·mL-1，測(cè)定值變動(dòng)范圍9.78～9.96 IU·mL-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.65%平均效價(jià)9.86 IU·mL-1。提示HPLC法精密度要高于生物效價(jià)測(cè)定法。

4.3 HPLC法和生物效價(jià)測(cè)定法測(cè)定企業(yè)縮宮素樣品的效價(jià)比較 分別在“2.1”和“2.2”項(xiàng)方法下對(duì)本研究的8個(gè)企業(yè)100批次的試驗(yàn)樣品進(jìn)行測(cè)定后比較，結(jié)果顯示，兩種方法檢測(cè)的縮宮素含量除兩家藥企外，其他企業(yè)生產(chǎn)的縮宮素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1，將兩者進(jìn)行Pearson檢驗(yàn)顯示，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.624，P<0.05)。

表1 兩種方法的含量測(cè)定結(jié)果比較

4.4 縮宮素注射劑長(zhǎng)期穩(wěn)定性分析 將2013年和2014年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)縮宮素注射液留樣通過“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè)，同該企業(yè)最新生產(chǎn)的縮宮素注射劑含量水平進(jìn)行比照發(fā)現(xiàn)，2013年生產(chǎn)的縮宮素注射劑有效成分含量明顯降低(P=0.025)，但2014年生產(chǎn)的制劑含量與2015年生產(chǎn)的制劑含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.419)，表明該制劑存在長(zhǎng)期貯存效價(jià)降低的風(fēng)險(xiǎn)。

5 討論

《中國(guó)藥典》中現(xiàn)行的縮宮素注射劑含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)中，以大鼠離體子宮收縮為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，操作較復(fù)雜，且試驗(yàn)周期長(zhǎng)，人為因素造成的誤差較大，對(duì)操作人員的要求高，且重復(fù)性欠佳[5]。這些問題如果得不到有效解決，會(huì)對(duì)企業(yè)在藥物生產(chǎn)時(shí)出現(xiàn)投料偏差的問題，導(dǎo)致藥物整體質(zhì)量和效果達(dá)不到臨床要求，造成患者治療的延誤[6-9]。隨著HPLC技術(shù)以及檢驗(yàn)設(shè)備的不斷優(yōu)化，越來越多的政府藥檢機(jī)構(gòu)及藥物生產(chǎn)企業(yè)開始使用該法來實(shí)現(xiàn)藥物的質(zhì)量控制，由于該法操作簡(jiǎn)單，靈敏度和專屬性強(qiáng)，只要操作人員嚴(yán)格按照操作流程執(zhí)行，其結(jié)果一般較為客觀準(zhǔn)確，并且可重復(fù)性好[10]。

本研究顯示，HPLC法同藥典中傳統(tǒng)的生物效價(jià)測(cè)定法對(duì)本組宮縮素注射劑樣品的檢測(cè)結(jié)果差異不大，而結(jié)合該法的其他優(yōu)越性，有必要將藥典中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量檢測(cè)方法更換。其次，通過HPLC法檢測(cè)8家藥企共100個(gè)批次的縮宮素注射劑質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，有2家企業(yè)通過這兩種方法測(cè)得的縮宮素質(zhì)量差異較大，其余企業(yè)產(chǎn)品差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與用到的動(dòng)物個(gè)體之間存在差異較大或者人為誤差等導(dǎo)致。另外，本研究對(duì)縮宮素注射劑貯存穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，該藥物(10～20 ℃，相對(duì)濕度30%～50%)2年后其效價(jià)均不同程度較低，提醒臨床使用該藥物時(shí)，應(yīng)注意生產(chǎn)日期，對(duì)于2年以上的該藥物，應(yīng)盡量避免給患者使用。

綜上所述，應(yīng)用HPLC法測(cè)定縮宮素注射劑，具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，本研究為宮縮素質(zhì)量控制水平的提高具有一定的價(jià)值。

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A comparative study on the quality control of oxytocin injection by HPLC and BA

XU Rong

(DepartmentofPharmacyandMedicalTechniques,NantongHealthHigherOccupationTechnicalSchool,Nantong,Jiangsu226000,China)

Objective To compare the advantages and disadvantages of HPLC and BA which control the quality of oxytocin injection.Methods We selected 100 batches of oxytocin injection which were produced by 8 enterprises,chose HPLC and BA to measure the samples and compared the test results.Results Differences between the two methods for detecting the oxytocin levels in oxytocin injection produced by two companies were significant (P=0.027,P=0.011),while differences among other oxytocin injection manufacturers were not statistically significant (P=0.556,0.637,0.614,0.559,0.315,0.429).The oxytocin injection content of 8 pharmaceutical companies were within 55.9%～126.1%,averaged 98.5%.The contents of oxytocin injection produced by three enterpriseswere relatively low.After 2 years of storage,the titer of oxytocin injection was significantly decreased with statistically significant difference (P=0.025).Conclusions HPLC used to determine oxytocin injection is relatively simple,sensitive and accurate,which can not only effectively avoid the error due to individual differences of BA,but also control human error of determination within a small range.Besides,the best storage duration for oxytocin injection is 2 years.

Oxytocin;HPLC method;Quality control;Stability

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.014

2016-06-15，

2016-07-19)