大鼠腦出血模型的建立及評(píng)價(jià)

孟令麗 李 楠 劉 曼 周洪霞

華北理工大學(xué)冀唐學(xué)院,①基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室 河北唐山 063000

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大鼠腦出血模型的建立及評(píng)價(jià)

孟令麗 李 楠 劉 曼 周洪霞①

華北理工大學(xué)冀唐學(xué)院,①基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室 河北唐山 063000

①目的 大鼠自體血法建立大鼠腦出血模型并對(duì)模型進(jìn)行行為學(xué)及病理形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。②方法 抽取大鼠自體股動(dòng)脈血，注射到大鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)。通過(guò)神經(jīng)功能障礙評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠行為學(xué)改變，蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)變化。③結(jié)果 與假手術(shù)組相比，大鼠腦出血后神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(P<0.05)，出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷。HE染色顯示腦出血后腦組織神經(jīng)細(xì)胞胞體收縮，細(xì)胞間隙增大，血腫周圍組織嚴(yán)重水腫。④結(jié)論 抽取股動(dòng)脈血注射到腦部基底節(jié)區(qū)能夠成功復(fù)制腦出血模型。

腦出血 基底節(jié)區(qū) 行為學(xué) 病理形態(tài)學(xué)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種急性腦血管病，具有高發(fā)病率、高病死率及高致殘率的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的健康和生存質(zhì)量[1]。有報(bào)道顯示，腦出血患者在發(fā)病后48小時(shí)內(nèi)死亡率為50%，而在幸存的患者中，僅有20%左右的患者能完全恢復(fù)正常生活能力[2,3]。迄今，在臨床實(shí)踐中缺乏特異有效的治療手段，究其原因主要是腦出血后損傷機(jī)制尚未完全闡明。研究腦出血的損傷機(jī)制最重要前提是成功建立穩(wěn)定的腦出血?jiǎng)游锬Ｐ停虼?，本?shí)驗(yàn)通過(guò)注入自體血復(fù)制腦出血模型，以期為后續(xù)的腦出血發(fā)病機(jī)制及治療研究提供有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 鼠腦立體定位儀購(gòu)于美國(guó)stoetling公司，微量注射器購(gòu)于上海醫(yī)學(xué)儀器廠，多聚甲醛購(gòu)于天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 動(dòng)物分組 健康雄性SD大鼠，9～12周齡，體質(zhì)量(300±20)克，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料和自來(lái)水喂養(yǎng)，室溫(25±2)℃。飼養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)和模型組(ICH)，每組又按時(shí)間點(diǎn)不同分為5個(gè)小組，分別為6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，72小時(shí)和7天。

1.3 模型制備 本實(shí)驗(yàn)抽取50μL新鮮自體股動(dòng)脈血注入右側(cè)基底節(jié)區(qū)建立腦出血模型。大鼠稱重，抽取10%水合氯醛(0.03mL/kg)，左手抓大鼠，右手持針腹腔麻醉，深度麻醉后，常規(guī)消毒，分離右側(cè)股動(dòng)脈，使用微量注射器抽取血液60μL，結(jié)扎血管，縫合刀口。將大鼠重新以俯臥位固定腦立體定位儀上，切開(kāi)皮膚，剝離骨膜，暴露前囟。用顱鉆于前鹵前0.2mm，中線右側(cè)3.5mm處鉆孔，微量注射器通過(guò)立體定位儀由鉆孔進(jìn)針注射新鮮股動(dòng)脈血，深6mm(此處即為腦基底節(jié)區(qū))，注射速度7～10μL/min。注射完畢后留針15分鐘，無(wú)菌骨蠟封閉鉆孔，縫合皮膚。假手術(shù)組注射基底節(jié)區(qū)同體積生理鹽水，其余步驟與模型組相同。

1.4 神經(jīng)功能障礙評(píng)分 Garcia法神經(jīng)功能障礙評(píng)分，神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重，所得分?jǐn)?shù)越低。應(yīng)用雙盲法對(duì)大鼠進(jìn)行六項(xiàng)基本測(cè)試，分別為自主運(yùn)動(dòng)測(cè)試(0～3)分、觸摸軀干反應(yīng)測(cè)試(1～3)分、活動(dòng)對(duì)稱性測(cè)試(0～3)分、金屬絲鼠籠攀援測(cè)試(1～3)分、觸摸觸須反應(yīng)測(cè)試(1～3)分、前肢對(duì)稱性測(cè)試(0～3)分，六項(xiàng)相加即為神經(jīng)功能評(píng)分總數(shù)(3～18)分。

1.5 腦組織血腫周圍病理學(xué)觀察。各組大鼠均取8只，行4%多聚甲醛常規(guī)灌注，快速斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行后固定。常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚5μL，常規(guī)脫蠟水化處理后切片瀝干浮水，浸入Mayer蘇木素中，染核8分鐘，將切片置于盛有自來(lái)水的燒杯中，漂洗3遍；隨后放入0.5%鹽酸酒精中，進(jìn)行分化(鏡下觀察控制酸化時(shí)間，一般為幾秒)，自來(lái)水終止分化；將切片置于自來(lái)水下返藍(lán)2小時(shí)左右；1%伊紅染胞質(zhì)1分鐘；切片常規(guī)脫水透明，封片。光鏡下觀察血腫及血腫周圍區(qū)病理形態(tài)學(xué)改變并拍攝照片。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能障礙評(píng)分(Neurologic deficit score，NDS) 所有大鼠手術(shù)前測(cè)試行為功能均表現(xiàn)良好。術(shù)后大鼠清醒后再次進(jìn)行障礙功能測(cè)試，假手術(shù)組六項(xiàng)測(cè)試均表現(xiàn)正常，評(píng)分在17～18分之間。與假手術(shù)組相比，模型組于術(shù)后出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺陷，其各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分均降低(P<0.05)，ICH組以72小時(shí)最為嚴(yán)重，觸摸大鼠軀干及觸須，右側(cè)軀干反應(yīng)正常，觸須及左側(cè)軀干基本無(wú)反應(yīng)，右側(cè)肢體活動(dòng)正常，左側(cè)無(wú)法攀援，僅能稍微活動(dòng)，評(píng)分最低。術(shù)后7天神經(jīng)功能障礙明顯緩解，體征減輕，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分增加，見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)定

2.2 腦組織切片HE染色觀察 觀察Sham組HE染色切片，未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變。腦組織細(xì)胞排列緊密、整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。胞核大、圓且均勻藍(lán)染，胞質(zhì)嗜酸性紅染。腦出血6小時(shí)，血腫周圍腦組織出現(xiàn)輕度水腫；術(shù)后24～72小時(shí)，病理改變現(xiàn)象最明顯，血腫周圍組織高度水腫、壞死，細(xì)胞核皺縮濃染，胞漿嗜酸性減弱，部分神經(jīng)元水腫變性、壞死，并伴有大量紅細(xì)胞出現(xiàn)，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)細(xì)胞排列凌亂、疏松，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外間隙增大；腦出血后7天此現(xiàn)象基本消失，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組大鼠腦出血血腫周圍尼氏染色與HE染色結(jié)果(×400)

3 討論

成功復(fù)制腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?，可以模擬人類腦出血的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，包括腦水腫的形成、組織病理形態(tài)學(xué)改變及行為功能學(xué)變化等。因此研究腦出血的重要前提是建立穩(wěn)定的腦出血?jiǎng)游锬Ｐ蚚4,5]，評(píng)定模型是否成功的標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)腦解剖病理學(xué)改變及其行為學(xué)變化[6,7]。目前實(shí)驗(yàn)研究中，常用的腦出血?jiǎng)游锬Ｐ椭饕心z原酶誘導(dǎo)法、自發(fā)性腦出血、微球囊充脹法及自體血注入法四種，四種方法各有利弊，對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的造模方法。

自體血注入法，在立體定位儀的作用下將新鮮的自體動(dòng)脈血注入到大鼠基底節(jié)區(qū)，與人類腦出血的好發(fā)部位及發(fā)生過(guò)程十分接近，可模擬血腫的占位效應(yīng)、腦水腫的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程及血液對(duì)腦組織細(xì)胞的毒性作用，是當(dāng)今研究中的理想ICH模型，主要適合研究腦水腫形成機(jī)制、炎癥反應(yīng)及一些防治藥物的作用靶點(diǎn)[8,9]。本實(shí)驗(yàn)采用自體血注入法，即將50μL自體非肝素抗凝股動(dòng)脈血在立體定位儀下注入成年大鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)誘發(fā)腦出血模型。

成功的ICH動(dòng)物模型須符合ICH的主要病理形態(tài)學(xué)改變和神經(jīng)行為學(xué)變化。本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的ICH模型，HE染色情況下，可見(jiàn)大量紅細(xì)胞，并伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血腫周圍出現(xiàn)明顯水腫，神經(jīng)細(xì)胞腫脹、壞死，組織細(xì)胞間隙增寬。這表明ICH后，腦內(nèi)存在腦組織的神經(jīng)細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)一步檢測(cè)腦組織神經(jīng)損傷程度，結(jié)果顯示，ICH后6小時(shí)動(dòng)物出現(xiàn)一定程度神經(jīng)功能障礙，病變對(duì)側(cè)肢體表現(xiàn)不同程度的癱瘓，其中以ICH后24小時(shí)最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為觸摸左側(cè)肢體及觸須后基本無(wú)反應(yīng)，神經(jīng)行為功能障礙評(píng)分最低。隨時(shí)間延續(xù)，神經(jīng)評(píng)分逐漸增高，在ICH后7天神經(jīng)功能基本恢復(fù)正常。提示，ICH模型大鼠基底節(jié)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞存在嚴(yán)重?fù)p傷，動(dòng)物行為和功能出現(xiàn)異常，其異常程度與病變嚴(yán)重程度相一致。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)注入自體血法成功復(fù)制了腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?，病理形態(tài)學(xué)和行為學(xué)都出現(xiàn)了特征性改變，符合實(shí)驗(yàn)要求，能夠?yàn)楹笃谀X出血機(jī)制的研究提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(2016-05-25 收稿)(庫(kù)雪飛 編輯)

Establishment and evaluation of intracerebral hemorrhage model in rats

MENGLingli,LINan,LIUMan,etal

(JitangCollege,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective The intracerebral hemorrhage models were established by autologous blood injection method in rats, after that were evaluated by the methods of behavioristics and pathology.Methods The right basal ganglia of rats were injected autologous blood.Neurologic deficit score estimated behavioral change.The pathological morphological changes of the brain tissue were tested by Hematoxylin-Eosin staining.Results The neurological function score was markedly decreased in the ICH group compared with the sham group(P<0.05).According to the results of HE staining,the cell body of the brain tissue of rats in the ICH group was shrunk, the cellular space was increased, and the edema around the hematoma was severe.Conclusion The intracerebral hemorrhage models can be successfully prepared by autologous blood injection in the right basal ganglia of rats.

Intracerebral hemmorhage.Basal ganglia.Behavioristics.Pathomorphology

河北省社會(huì)科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：HB13LJ003)；河北省唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào)：12140209A-31)。

孟令麗(1982-)，女，碩士研究生。研究方向：出血性腦損傷。

周洪霞。

R 361

A

2095-2694(2016)05-346-03