環(huán)介導等溫擴增終端產物檢測及結果判斷的研究進展

付振芳，汪小福，徐俊鋒，李玥瑩

（1.沈陽師范大學 化學與生命科學學院，遼寧 沈陽 110034；2.浙江省農業(yè)科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021）

環(huán)介導等溫擴增終端產物檢測及結果判斷的研究進展

付振芳1，2，汪小福2，徐俊鋒2，李玥瑩1*

（1.沈陽師范大學 化學與生命科學學院，遼寧 沈陽 110034；2.浙江省農業(yè)科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021）

環(huán)介導等溫擴增 （LAMP）技術在2000年被日本學者Notomi等提出，并用瓊脂糖凝膠電泳及SYBRGreenⅠ熒光定量的方法對其產物、擴增靈敏度進行了分析。為了使LAMP終產物檢測更加簡單、直觀、省時，國內外科學家進行了大量的研究，先后提出濁度分析法、HNB指示劑、蠟丸染料等簡便易操作的LAMP終產物檢測及結果判斷方法，目前應用較多的是瓊脂糖凝膠電泳、濁度分析法、HNB指示劑法與SYBRGreenⅠ指示劑法。本文就近年來LAMP終產物檢測及結果判斷進行了綜述，匯總了近年來LAMP終產物檢測方法，以期為未來LAMP終產物檢測方法的發(fā)展提供新的思路。

環(huán)介導等溫擴增 （LAMP）；產物檢測；結果判斷

2000年，日本學者Notomi等在《Nucleic AcidsResearch》上提出用于核酸擴增的環(huán)介導等溫擴增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）技術，該技術運用的2組引物—上/下游外引物（F3/B3）、上/下游內引物（FIP/BIP）能夠特異性識別靶基因上6個位點，在65℃恒溫條件下首次成功完成對M13mp18、HBV、前列腺特異性抗原mRNA的擴增，擴增靈敏度為6個DNA拷貝［1］。

靶基因在BstDNA聚合酶的作用下，60～65℃等溫擴增40～60min即可完成對靶基因的高效擴增。擴增過程可大致分為2個步驟： （1）形成LAMP的基礎結構。F3首先結合到靶基因的3’端擴增出靶基因的互補序列，接著B3結合到該互補序列擴增出靶基因，該靶基因兩端的F3/B3可自身成環(huán)，LAMP基礎結構形成；（2）擴增循環(huán)。FIP/BIP依次結合到LAMP基礎結構的兩端，把基因不斷擴增延伸，最終形成靶基因與其互補序列交替出現(xiàn)、不同片段長度的擴增產物，該產物呈花椰菜狀。隨著反應進行，大量焦磷酸根從 dNTPs上脫落，游離焦磷酸根與體系中的Mg2+結合，形成穩(wěn)定的白色沉淀。

LAMP核酸擴增技術自提出以來，對LAMP的改良優(yōu)化大多集中在實驗條件的優(yōu)化，如Nagamine等［2］發(fā)現(xiàn)環(huán)引物FLP/BLP的加入能進一步提高LAMP的擴增效率，其他還有針對不同靶基因進行的反應時間、反應溫度、反應體系中各組分的濃度 （如Mg2+、甜菜堿等）等的優(yōu)化探究。而LAMP終產物檢測方面使用最多的方法主要是凝膠電泳、濁度檢測、SYBRGreenⅠ熒光檢測。

與其他核酸擴增技術相比，LAMP擴增時間短、靈敏度高、特異性好、儀器設備要求低，為實驗條件有限的基層實驗室或者現(xiàn)場的快速檢測提供了可能，主要用于致病性微生物，如細菌［3-7］、病毒［8-13］、 真菌［14］、 支原體［15］、 衣原體［16］， 致病性寄生蟲［17］， 轉基因成分［18-19］， 腫瘤［20］， 胚胎性別鑒定［21］、 安全用藥［22］、 食品過敏原［23］， 純度檢測［24］等領域的核酸擴增。但由于LAMP靈敏度高、擴增效率高的特點，如果依舊使用從傳統(tǒng)的凝膠電泳方法檢測擴增產物，極易造成實驗室污染或者小面積氣溶膠污染，影響下次實驗的可靠性或直接導致實驗失?。欢阊蹪岫扔^察雖然大大縮短了檢測時間，但具有一定的主觀性。所以研究不開蓋即完成對LAMP擴增產物的檢測對LAMP技術的進一步廣泛使用有著重要意義。

1 LAMP產物檢測技術

LAMP核酸擴增技術具有的擴增時間短、靈敏度高、特異性高、擴增效率高等優(yōu)點使其自問世以來便得到廣泛的關注。截至目前，國內外科學家已經成功將該技術用于致病性微生物、致病性寄生蟲、轉基因成分、腫瘤、胚胎性別鑒定、安全用藥、食品過敏原、純度檢測等領域的核酸擴增。但相較于LAMP擴增廣泛的應用領域，LAMP技術的產物檢測方法用得較多的有瓊脂糖凝膠電泳、濁度分析、SYBRGreenⅠ熒光檢測技術。

1.1 電泳

LAMP電泳方法、原理與普通PCR電泳相同，即將擴增產物按一定比例與DNA染料混合，加樣、電泳，最終通過凝膠電泳顯像系統(tǒng)成像后觀察條帶位置。所不同的是，LAMP的擴增產物呈特異的梯狀條帶。LAMP的電泳方法有瓊脂糖凝膠電泳、毛細管電泳［25］，瓊脂糖凝膠電泳是較常用的方法，也可以用限制性內切酶EcoRⅠ對LAMP產物進行酶切，產生與理論片段大小相符的產物片段。

1.2 熒光染料法

熒光染料與雙鏈DNA雙螺旋小溝區(qū)域結合后熒光大大增強，因此可以利用熒光信號強度定性指示雙鏈DNA的數(shù)量。熒光染料法用到的染料主要有SYBRGreenⅠ、GoldView以及PMA。其中SYBRGreenⅠ的應用最為廣泛。

SYBRGreenI-LAMP。SYBRGreenⅠ是一種綠色激發(fā)波長染料，在游離狀態(tài)下發(fā)出微弱的熒光，與雙鏈DNA結合后熒光大大增強。在LAMP產物中加入SYBRGreenⅠ溶液，陰性結果為橙色，陽性為熒光黃或紫外燈下發(fā)出熒光。因此，SYBR GreenI可以用來指示LAMP擴增。根據(jù)SYBR GreenⅠ加入的方式，SYBRGreenI-LAMP主要有普通指示法、管壁法、染料蠟丸［26-27］等方法。普通指示法，反應結束后開蓋直接加入SYBRGreenⅠ溶液；管壁法，反應前將SYBRGreenⅠ加在管蓋內壁上，反應結束后離心或顛倒混勻離心管，使蓋內壁的SYBRGreenⅠ與反應液混合，最后觀察離心管中反應液顏色，該方法雖避免了開蓋，但SYBRGreenⅠ會在一定程度上抑制LAMP擴增，所以蓋管蓋時要防止管蓋上的指示劑溶液與反應液混合；染料蠟丸，將SYBRGreenⅠ染料包裹于蠟丸中，反應前體系中加入一粒，擴增結束后95℃處理5min，使蠟丸融化釋放SYBRGreenⅠ染料，染料與擴增產物結合釋放大量熒光，冷卻后蠟丸凝固并把反應終產物封于反應管底部，這樣在很大程度上降低了污染。以上方法只能在擴增終點定性地判斷LAMP是否擴增。為了實現(xiàn)對擴增過程的實時監(jiān)測，以普通PCR熒光定量法為參考衍生出實時熒光法。

另外2種熒光染料是GoldView與PMA。GoldView是一種新型核酸染料，與核酸結合后能產生很強的熒光信號，擴增結束后將GoldView加入反應管中混勻離心，紫外線燈下觀察陽性反應管呈綠色，陰性呈橘紅色［28］。PMA，疊氮溴化丙啶（propidiummonozaide），是一款具有高親和力的光敏反應DNA結合染料，傾向于結合dsDNA。PMA上的光敏性疊氮基團生成高反應性的氮賓基團，它與羥基化合物共價結合，形成不可逆的DNA修飾。PMA完全不能通過細胞膜，因此它只能選擇性地修飾死細胞 “暴露”的DNA。這一特性使得它可以和LAMP聯(lián)合使用，選擇性地擴增活細菌DNA，而不擴增被PMA修飾的死細菌DNA，所以用PMA-LAMP可避免死細胞DNA擴增帶來的活菌計數(shù)錯誤或非特異擴增造成的假陽性結果［29］。

1.3 基于鎂離子、焦磷酸根的檢測技術

LAMP反應過程中會有大量焦磷酸根（P2O4-7）從dNTPs上脫落，游離焦磷酸根與體系中的 Mg2+結合，形成穩(wěn)定的白色焦磷酸鎂（Mg4P2O7）沉淀。所以隨著擴增的進行，體系中焦磷酸鎂沉淀逐漸增多，Mg2+逐漸減少。焦磷酸鎂的積累會使體系變渾濁，基于此產生LAMP濁度法。擴增結束后，用肉眼觀察體系是否變渾濁或離心后底部是否有白色沉淀即可判斷是否有擴增。還可使用濁度儀對體系進行終點濁度檢測或者實時濁度檢測。濁觀察節(jié)省了時間，也避免了開蓋污染，但肉眼觀察判斷是否有渾濁有一定的主觀性，不符合客觀、科學的研究要求。故不少學者開發(fā)出基于體系中Mg2+離子變化的指示劑法。

指示劑法是指根據(jù)指示劑的物理化學特性，在擴增前后加入指示劑，隨著體系中 Mg2+濃度的變化，指示劑因得到或失去Mg2+進而顏色發(fā)生變化的一種方法。常用的指示劑有鈣黃綠素、HNB、MUA-AuNPs、鉻黑T或其衍生物、PAR鈉鹽等，其中鈣黃綠素、HNB最為常用。

鈣黃綠素 （calcein，3，3′-雙 （甲胺二乙酸）熒光素），亮黃色粉末，溶于乙醇和堿，微溶于水；絡合指示劑、熒光指示劑，與鎂離子結合而成的復合物可產生強烈熒光。反應前加入鈣黃綠素，此時鈣黃綠素與錳離子結合為淬滅態(tài)，即無熒光產生。隨著反應進行，大量產生的焦磷酸根與錳離子形成穩(wěn)定的焦磷酸錳沉淀，此時鎂離子取代錳離子與鈣黃綠素結合，產生熒光［30］。AuNPs，納米金（goldnanoparticles），可見光下AuNPs粒子發(fā)生表面等離子體共振，根據(jù)粒子直徑大小顏色從紅色變至紫色。MUA-AuNPs，是納米金與巰基十一烷酸形成的復合物。實驗時提前加入指示劑 MUAAuNPs，在體系中的Mg2+的作用下MUA-AuNPs之間相互螯合，直徑變大，此時體系為紫羅蘭色；擴增完成后，Mg2+與P2O4-7形成穩(wěn)定的白色沉淀，此時失去Mg2+的MUA-AuNPs使得體系變成紅色，因此可根據(jù)體系顏色變化來判斷擴增反應的結果［31］。HNB，羥基萘酚藍（hydroxynaphtholblue），金屬離子指示劑，深紫色粉末，易溶于水和乙醇；其水溶液在pH為7～12時呈藍色，pH＞13時呈紅色。LAMP體系中提前加入HNB水溶液，起初鎂離子與HNB結合使得反應體系為紫羅蘭色；隨著反應的進行，Mg2+與析出的 P2O4-7反應生成Mg2P2O7沉淀，HNB失去Mg2+使得體系顏色變?yōu)樘焖{色，而未反應的體系則仍保持著紫羅蘭色［32］。鉻黑T，1-（1-羥基-2-萘偶氮）-6-硝基-2-萘酚-4-磺酸鈉（eriochromeblackT），又名依來鉻黑T；棕黑色粉末，溶于水，6.3＜pH＜11.6為藍色；絡合指示劑，絡合物為紅色。將指示劑溶液提前加入擴增體系中，反應開始時，鉻黑T或其衍生物與鎂離子結合成為紅色，隨著反應進行副產物焦磷酸根與鎂離子形成沉淀，鉻黑T或其衍生物失去鎂離子后，由紅色變?yōu)樗{色。PAR鈉鹽，吡啶-（2-偶氮-4）間苯二酚一鈉鹽或4-（2-吡啶偶氮）間苯二酚單鈉鹽一水物（4-（2-pyridylazo）resorcinol monosodiumsalt），橙棕色至棕色結晶粉末，易溶于水和乙醇，水溶液呈黃色，絡合指示劑，原理與鉻黑T相同，PAR鈉鹽與鎂離子結合形成橘紅色絡合物，失去鎂離子后橘紅色變?yōu)辄S色［33］。

1.4 與其他技術結合的檢測技術

LAMP單管擴增時間短、效率高、靈敏度好，但由于LAMP引物的復雜性，單管多重LAMP擴增在實現(xiàn)上有一定的難度。所以LAMP與其他技術結合，實現(xiàn)廣義上的多重擴增為解決多重LAMP擴增提供了新的思路。

LFD法。橫向流動試紙條檢測技術（lateral flowdipstick，LFD），該方法基于LAMP擴增原理，上游內引物由生物素 （biotin）標記，同時在內引物擴增的有效區(qū)段內設計1條異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的DNA探針，由FITC標記的探針與生物素標記的LAMP擴增產物特異性雜交，若結果為陽性則檢測線、質控線處均出現(xiàn)條帶，陰性結果只出現(xiàn)質控線一條帶［34-35］。

微流控LAMP芯片系統(tǒng)。LAMP與微流控技術的結合在廣義上解決了LAMP無法進行多重擴增以及更加快速的sample-to-answer的問題，主要有單重定性/定量LAMP芯片、多重定性/定量LAMP芯片及單重/多重集成LAMP芯片。單重定性/定量LAMP芯片擴增場所由傳統(tǒng)的EP管改為5μL體積反應槽，一個芯片可承載多個獨立反應槽，反應結束后可根據(jù)反應槽中是否有白色沉淀直接判斷有無擴增 （單重定性），也可以使用可見吸光光度法實時檢測LAMP反應液的混濁程度可以定量樣品中的目的基因 （單重定量）。多重定性/定量LAMP芯片，芯片上設計有輻射狀凹槽，凹槽端點為擴增池（可根據(jù)需要在擴增池中加入終點指示劑），交叉點為加樣孔。加樣后，樣品通過此孔在毛細管拉力的作用下均勻分布到各擴增池進行LAMP擴增。反應結束后，根據(jù)反應槽中是否有白色沉淀或相應的指示劑有無陽性反應直接判斷有無擴增 （多重定性），或使用微型反射式光纖傳感器測定每個樣品的動力學曲線閥值來定量樣品中原始目標基因的含量 （多重定量）。單重/多重集成LAMP芯片，芯片由DNA提取室，毛細管通道和LAMP擴增室三部分組成，多重集成LAMP芯片模板擁有多個LAMP擴增室，其數(shù)量與重數(shù)相同。DNA提取完成后打開螺絲微閥使DNA進入擴增室，加入反應液，完成擴增。擴增結果通過濁度判斷或加入終點指示劑［36-37］。

2 問題及展望

LAMP技術的提出打破傳統(tǒng)核酸擴增技術需要溫度循環(huán)的常規(guī)，縮短了擴增時間、提高了擴增效率，并且其靈敏度高、特異性好、不需要嚴苛的實驗條件以及大型儀器設備、擴增結果可直接裸眼觀察或者通過指示劑法直接觀察的優(yōu)點，為核酸擴增技術普及、條件不足的基層實驗室開展實驗以及現(xiàn)場檢測提供了可能。縱觀15年來的發(fā)展，LAMP產物檢測技術不斷優(yōu)化：從傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳到濁度觀察、指示劑顏色變化等終點判斷方法，再到與其他技術相結合，縮短了檢測周期的同時也克服了開蓋污染以及無法多重擴增的問題。但是相比于LAMP應用領域的遍地開花，LAMP檢測技術的發(fā)展相形見絀，而且已有的方法依舊存在易污染等問題。電泳、濁度分析、SYBRGreenⅠ等檢測方法應用較為廣泛，但開蓋電泳極易造成實驗室污染。濁度分析不能避免肉眼觀察的主觀性；實時濁度分析結果雖更加客觀，但依舊依賴昂貴的實驗儀器，不利于LAMP方法的基層普及或現(xiàn)場檢測。SYBRGreenⅠ提前加入會抑制LAMP擴增，擴增結束后加入又極易造成污染；染料蠟丸法的提出為指示劑的發(fā)展提供了新的思路，克服了前2個問題，但蠟丸的制作在某種程度上增加了檢測成本以及時間。而指示劑 HNB、鈣黃綠素等既不抑制LAMP擴增又簡單易操作的方法可以為LAMP檢測技術的發(fā)展提供參考。LFD法因為要開蓋將試紙條放入終產物中，所以也不能避免開蓋污染，而且試紙條造價較高，該方法適于現(xiàn)場檢測等開放環(huán)境中。芯片法從廣義上解決了LAMP多重擴增的問題，但每個芯片各實驗組之間容易交叉污染的問題并沒有解決。綜上所述，發(fā)展能夠實現(xiàn)多重擴增、低污染率、簡便易操作、低成本的檢測方法依舊是未來LAMP終產物檢測技術的發(fā)展方向。

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（責任編輯：張 韻）

Q78

A

0528-9017（2016）05-0725-05

2016-02-02

浙江省公益性項目 （2014C22001，2015C32063）；浙江省自然科學基金項目 （LY15C200011）

付振芳 （1990—），女，河北邯鄲人，碩士研究生，研究方向為轉基因檢測技術，E-mail：frace7@sina.com。

李玥瑩 （1966—），女，遼寧大連人，教授，博士，碩士研究生導師，研究方向為分子進化與分子生物學，E-mail：yueyinglicn@yahoo.com.cn。

文獻著錄格式：付振芳，汪小福，徐俊鋒，等.環(huán)介導等溫擴增終端產物檢測及結果判斷的研究進展 ［J］.浙江農業(yè)科學，2016，57（5）：725-729.

10.16178/j.issn.0528-9017.20160535