277例手足口病樣本病原學(xué)檢測(cè)報(bào)告

王增良，楊　歡

(臨汾市疾病預(yù)防控制中心，山西臨汾　041000)

277例手足口病樣本病原學(xué)檢測(cè)報(bào)告

王增良，楊歡

(臨汾市疾病預(yù)防控制中心，山西臨汾041000)

目的:了解2015年臨汾市手足口病病原學(xué)特征，為手足口病防控提供病原學(xué)依據(jù)。方法:使用Realtime PCR檢測(cè)方法對(duì)腸道病毒進(jìn)行核酸檢測(cè)和型別鑒定，并對(duì)未能分型的腸道病毒的VP2基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)鑒定，得出病毒型別。結(jié)果:277例手足口病臨床診斷病例中，檢測(cè)到腸道病毒核酸陽(yáng)性201例，陽(yáng)性率為71.6%，其中，腸道病毒71型7例，占陽(yáng)性樣本3.5%;柯薩奇病毒A16型62例，占陽(yáng)性樣本30.8%;CA6型94例，占陽(yáng)性樣本46.8%;CA10型3例，占陽(yáng)性樣本1.5%;柯薩奇病毒B5型1例，占陽(yáng)性樣本0.5%;?？刹《?型1例，占陽(yáng)性樣本0.5%;CA4/CA6混合型2例，占陽(yáng)性樣本1%;未分型腸道病毒(EV)33例，占陽(yáng)性樣本16.4%。結(jié)論:2015年臨汾市手足口病流行的病原體主要是CA6型，其次是CA16和其他未分型腸道病毒。

手足口病;病原學(xué);腸道病毒;CoxA 6

手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)是由多種腸道病毒感染引起，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征的兒童常見(jiàn)傳染病。HFMD由腸道病毒EV71型和柯薩奇病毒A4、A5、A7、 A9、A10、A16、B2、B3、B4、B5、B7等多種病毒引起［1］。為探討2015年臨汾市手足口病病原學(xué)特征，提供防控手足口病的病原學(xué)依據(jù)，收集2015年臨汾市手足口病臨床診斷病例樣本277例，進(jìn)行了病原學(xué)檢測(cè)，現(xiàn)將檢測(cè)結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1病例來(lái)源

277例病例樣本來(lái)源于臨汾市各縣區(qū)哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)醫(yī)院首次就診的HFMD病例，其診斷和分類參照國(guó)家《手足口病診斷指南》(2010版)病例定義。

1.2樣本采集

按照《手足口病預(yù)防控制指南》(2009版)要求，采集2015年全年手足口病臨床診斷病例樣本277例，其中，咽拭子標(biāo)本219份，糞便樣本58份，均來(lái)自于不同的病例。采集樣本保存于2～3 mL儲(chǔ)存液中，4℃運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后，24 h內(nèi)完成熒光定量PCR檢測(cè)，剩余樣本分裝保存于－80℃冰箱用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3腸道病毒Real-time PCR檢測(cè)

用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen公司)進(jìn)行病毒RNA提取。使用腸道通用型EV、EV71、CA16、CA6、CA10等熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(江蘇碩世公司)進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，結(jié)果判讀參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。腸道病毒通用型核酸陽(yáng)性EV，而已有病毒類型核酸檢測(cè)不能分型者，為未知型。

1.4未知型腸道病毒的VP2基因片段的PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

對(duì)未知型樣本做進(jìn)一步分型。參考美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中腸道病毒基因組，針對(duì)未知型腸道病毒VP2基因組的部分片段(長(zhǎng)度為794bp，與NCBI編號(hào)為HE572907的VP1序列相對(duì)參考位置為58bp-851bp)設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物為601F(5`-3`):ATATC(C/T)CGGGTGACCGCAGC，下游引物為607R(5`-3`):TC(G/A)GTTGCAGTGTTAG(T/ C)TATTGTTTG;使用One Step RT－PCR Kit(Qiagen公司)進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)，使用QIAxcel毛細(xì)管電泳儀(Qiagen公司)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。擴(kuò)增產(chǎn)物由梓熙生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)復(fù)核。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)結(jié)果使用Micrsoft Excel 2007建立數(shù)據(jù)庫(kù)，使用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1病原學(xué)監(jiān)測(cè)

277例手足口病臨床診斷病例標(biāo)本，經(jīng)用熒光定量PCR檢測(cè)，并對(duì)未知型樣本再用VP2分型方法進(jìn)行型別鑒定，結(jié)果腸道病毒陽(yáng)性樣本201例，陽(yáng)性率為71.6%。腸道病毒型別鑒定結(jié)果分別為腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)7例，占陽(yáng)性樣本3.5%;柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CA16)62例，占陽(yáng)性樣本30.8%;CA6型94例，占陽(yáng)性樣本46.8%;CA10型3例，占陽(yáng)性樣本1.5%;柯薩奇病毒B5型(Coxsackievirus B5，CB5)1例，占陽(yáng)性樣本0.5%;?？刹《?型(Echo9)1例，占陽(yáng)性樣本0.5%;CA4/CA6混合型2例，占陽(yáng)性樣本1%;未分型腸道病毒(EV)33例，占陽(yáng)性樣本16.4%。

2.2不同性質(zhì)標(biāo)本腸道病毒檢出情況

277份樣本中，咽拭子標(biāo)本219份，糞便標(biāo)本58份。在219份咽拭子標(biāo)本中，檢測(cè)出腸道病毒核酸陽(yáng)性148份，陽(yáng)性率67.6%。在58份糞便標(biāo)本中，檢測(cè)出腸道病毒核酸陽(yáng)性53份，陽(yáng)性率91.4%。糞便樣本陽(yáng)性檢出率(91.4%)高于咽拭子樣本陽(yáng)性檢出率(67.6%)(χ2=13.2，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1　不同性質(zhì)標(biāo)本腸道病毒檢出情況n(%)

2.3人群分布

收集的277例樣本中，男155例，腸道病毒陽(yáng)性118例，陽(yáng)性檢出率76.1%;女122例，腸道病毒陽(yáng)性83例，陽(yáng)性檢出率68%，男女比例:1.27∶1，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.31，P＞0.05)。檢測(cè)出的201例陽(yáng)性樣本中，手足口病患者年齡最小5個(gè)月，最大28歲，在0～3歲年齡組182例;其他年齡組19例。見(jiàn)表2、表3。

表2　不同性別患者陽(yáng)性檢出率n(%)

表3　不同性別患者陽(yáng)性檢出率n(%)

2.4時(shí)間分布統(tǒng)計(jì)

201份陽(yáng)性樣本中，4～7月檢測(cè)的HFMD腸道病毒陽(yáng)性數(shù)量最高，呈現(xiàn)夏季高發(fā)特點(diǎn)。4月份起檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)開(kāi)始上升，5～7月份呈現(xiàn)一個(gè)明顯高峰，8月份陽(yáng)性檢測(cè)數(shù)開(kāi)始有所下降。見(jiàn)圖1。

圖1　2015年HFMD檢測(cè)陽(yáng)性份數(shù)時(shí)間分布圖

3　討論

277例手足口病病例樣本的EV型別鑒定結(jié)果，以腸道病毒CA6型陽(yáng)性率為最高，陽(yáng)性率33.9%(94/ 277)，其次，為腸道病毒CA16型，陽(yáng)性率22.4%(62/ 277)。據(jù)報(bào)道，2012年以來(lái)，腸道病毒CA6型逐漸成為中國(guó)大陸HFMD的重要病原，其曾在歐洲和東南亞等世界多地引起過(guò)暴發(fā)流行［2］。這與本次檢測(cè)結(jié)果相一致。

我國(guó)HFMD易感人群多為5歲以下兒童，男性發(fā)病率高于女性。HFMD發(fā)病高峰期主要為每年的3～7月［3］。從表3、表4和圖1可看出，在201例陽(yáng)性樣本中，男性118例，女性83例。0～3歲年齡陽(yáng)性檢出率較高。陽(yáng)性檢出例數(shù)3～7月較多。與報(bào)道基本相同。

本次監(jiān)測(cè)還發(fā)現(xiàn)了EV71和A16型以外的其他型別，包括CA6型，CA10型，柯薩奇病毒B5型，?？刹《?型，CA4/CA6混合型等。這幾種病原型別，在山西省地區(qū)未見(jiàn)有報(bào)道。不同種類的人腸道病毒所引起的HFMD癥狀有所不同，且嚴(yán)重程度及病情進(jìn)展也不完全相同，而至今尚無(wú)有效疫苗［4］。近年來(lái)，許多國(guó)家都報(bào)道了由EV71和CA16型以外的其他腸道病毒引起HFMD爆發(fā)的疫情，且由其他腸道病毒引起的患者容易發(fā)生并發(fā)癥，如脫甲癥、脫皮現(xiàn)象等［5］。這就提示，引起HFMD病毒型別是在不斷變化的，在今后HFMD的防控工作中，要注意，有可能會(huì)出現(xiàn)新的腸道病毒來(lái)取代原有的病毒。因此，做好對(duì)HFMD病原的檢測(cè)，掌握引起HFMD的腸道病毒型別分布和構(gòu)成，從源頭上主動(dòng)對(duì)HFMD進(jìn)行預(yù)防和控制，顯得尤為重要。

［1］劉克洲，陳智.人類病毒性疾?。跰］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010.

［2］曾漢日，陸靖，李暉，等.廣東省2008－2009年柯薩奇A6型腸道病毒的流行及其基因特征分析［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2014，34(10):742-746.

［3］胡躍華，肖革新，郭瑩，等.中國(guó)大陸手足口病流行特征分析［J］.中華疾病控制雜志，2014，8(18):693-697，747.

［4］林虹，馬江濤，陳慧，等.寧夏回族自治區(qū)2013－2014年手足口病病原學(xué)分析［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2015，31(11):1489-1492.

［5］王作梅，王淑珍，李俊紅，等.82例成人手足口病的臨床特點(diǎn)分析［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12(27):5363-5365.

本文編輯:王知平

R446.5

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1671-0126(2016)02-0023-03

王增良，男，副主任技師，從事疾病預(yù)防檢驗(yàn)工作