16S rRNA在鑒定害肺戴阿里斯特桿菌中的應(yīng)用

鄭麗娜，呂火烊，胡慶豐，張姣麗

(1. 浙江省新華醫(yī)院，浙江 杭州 310005; 2. 浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014；3.嘉興市第二人民醫(yī)院，浙江 嘉興 314012)

·基礎(chǔ)與臨床研究·

16S rRNA在鑒定害肺戴阿里斯特桿菌中的應(yīng)用

鄭麗娜1,2，呂火烊2@，胡慶豐2，張姣麗3

(1. 浙江省新華醫(yī)院，浙江 杭州 310005; 2. 浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014；3.嘉興市第二人民醫(yī)院，浙江 嘉興 314012)

目的：評(píng)估Vitek-2 Compac全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS )和16S核糖體RNA(16S rRNA)對(duì)害肺戴阿里斯特桿菌(Dialister pneumosintes)的鑒定能力。方法分別用Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀、MALDI-TOF MS以及16S rRNA測(cè)序?qū)Ψ未靼⒗锼固貤U菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果16S rRNA測(cè)序鑒定出該致病菌為害肺戴阿里斯特桿菌，而Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀和MALDI-TOF MS均無(wú)法鑒定。結(jié)論對(duì)于害肺戴阿里斯特桿菌，16S rRNA的鑒定方法具有優(yōu)勢(shì)。

血培養(yǎng)；害肺戴阿里斯特桿菌；全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；16S核糖體

目前已知戴阿里斯特菌屬(Dialister Spp.)有4個(gè)菌種，害肺戴阿里斯特桿菌(Dialister pneumosintes,簡(jiǎn)稱(chēng)Dp)為菌屬中的主要菌種[1]，革蘭陰性專(zhuān)性厭氧小桿菌。在哥倫比亞血平板上培養(yǎng)形成圓形、透明、表面有光澤、光滑的小菌落。革蘭染色，油鏡下呈單個(gè)，成對(duì)或短鏈分布。害肺戴阿里斯特桿菌是潛在的牙周炎致病菌，是目前臨床上牙周組織中較常見(jiàn)的細(xì)菌之一，但具體致病機(jī)制尚不清楚，再者因?yàn)樗b定比較困難，所以害肺戴阿里斯特桿菌的藥敏仍然未知。我們從一例結(jié)腸癌患者血培養(yǎng)中分離到該菌，因該致病菌的報(bào)道較少，鑒定機(jī)制尚不完善，使用常規(guī)方法不能及時(shí)作出鑒定。為此，本研究以害肺戴阿里斯特桿菌為例，平行對(duì)比Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀、MALDI-TOF MS以及以16S rRNA 3種方法的鑒定率，為臨床害肺戴阿里斯特桿菌的鑒定提供方法學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2015年9月27日，從浙江省人民醫(yī)院一例結(jié)腸癌患者血培養(yǎng)中分離得到一株害肺戴阿里斯特桿菌。9月27日，患者因高熱，體溫39.2℃，行雙側(cè)雙瓶抽取血液進(jìn)行血培養(yǎng)，血培養(yǎng)2天后于29日凌晨4點(diǎn)右側(cè)厭氧瓶報(bào)陽(yáng)性，隨后接種于哥倫比亞血瓊脂平板37℃厭氧培養(yǎng)，同時(shí)做需氧對(duì)照。培養(yǎng)48h，厭氧培養(yǎng)的血平板上培養(yǎng)形成小的、圓形、透明、表面有光澤、光滑的菌落。

1.2 儀器與試劑

BactAlert 3D 240 型自動(dòng)血培養(yǎng)分析儀，革蘭染液，顯微鏡，Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；MALDI-TOFMS 鑒定儀購(gòu)自德國(guó)Bruker公司；MALDI—TOFMS所用試劑如三氟乙酸( TFA )、α-氰-4-羥基苯丙烯酸(HCCA )、色譜純乙腈、甲酸、無(wú)水乙醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司Biometra 公司；T-personal PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)；基因組提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；PCR反應(yīng)試劑盒、DNA標(biāo)準(zhǔn)帶購(gòu)自日本Takara公司。

1.3 革蘭染色及Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定

按常規(guī)方法對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭染色鏡檢和Vitek-2 Compac全自動(dòng)微生物鑒定。

1.4 MALDI-TOF MS鑒定[2]

1.4.1 滅活 挑取2～3個(gè)中等大小菌落于1.5ml離心管中，加入300μl蒸餾水混勻，然后加900μl無(wú)水乙醇混勻，12000X g離心2min。

1.4.2 提取蛋白 離心后棄去上層乙醇，下層沉淀加入50μl 70%甲酸混勻，然后加入50μl乙腈混勻，12000X g離心2min。

1.4.3 加樣 取上清1μl加入德國(guó)Bruker公司特制的96孔加樣板，待干燥后，加入1μl基質(zhì)(飽和HCCA溶液)覆蓋加樣位置。

1.4.4 校準(zhǔn)定標(biāo) 每次實(shí)驗(yàn)前需對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)定標(biāo)，以大腸埃希菌DH5α作為標(biāo)準(zhǔn)品。將所取得的特征性質(zhì)譜峰圖與MALDI Biotype 3.0 軟件(德

國(guó)Bruker 公司)中的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，并用匹配分值來(lái)給結(jié)果定級(jí)。

1.5 16S rRNA測(cè)序及比對(duì)[3]

1.5.1 細(xì)菌DNA提取 從血平板上挑取2～3個(gè)中等大小菌落于0.5ml離心管中，加入50μl蒸餾水吹打混勻，煮沸10min，12000 X g離心2min，上清液作為模板DNA。

1.5.2 PCR體系配置 取0.25μl Taq酶，5μl Buffer，4μl dNTP，引物F 1μl，引物R 1μl，模板DNA 2μl，加水至配制成50μl體系。

1.5.3 PCR反應(yīng) 94℃×5min，94℃×50s→55℃×50s→72℃×50s 30個(gè)循環(huán)，72℃×5min。

1.5.4 瓊脂糖凝膠電泳 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化已錠的1.0%瓊脂糖凝膠上100V恒壓電泳30min，紫外燈下觀(guān)察結(jié)果，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后所得DNA序列與GenBank中的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 革蘭染色和Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定

革蘭染色為革蘭陰性小桿菌，見(jiàn)圖1，Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀無(wú)法鑒定。

2.2 MALDI-TOF MS鑒定

由于尚未建立未知菌株的數(shù)據(jù)庫(kù)，故無(wú)法鑒定。

2.3 16S rRNA測(cè)序比對(duì)結(jié)果

分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增核苷酸序列長(zhǎng)度1532bp，與害肺戴阿里斯特桿菌相似度為100%。(見(jiàn)圖2，Query：為分離菌株16S rRNA序列，Sbjct：害肺戴阿里斯特桿菌JCM 10004序列)。

圖2 分離菌株16S rRNA序列和害肺戴阿里斯特桿菌JCM 10004序列比較

3 討 論

Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀具有操作簡(jiǎn)便、標(biāo)準(zhǔn)化及快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，能夠?qū)ΤＲ?jiàn)致病菌進(jìn)行鑒定，基本滿(mǎn)足疾病預(yù)防控制的需要，為細(xì)菌檢驗(yàn)鑒定提供準(zhǔn)確性和有效性。但是對(duì)于生長(zhǎng)較為緩慢、生化反應(yīng)模式相近的細(xì)菌種類(lèi)以及少見(jiàn)疑難細(xì)菌誤鑒概率較高[4]。MALDI-TOF MS能夠快速地完成鑒定，成本較低，是目前應(yīng)用和研究的熱點(diǎn)。不足之處在于儀器購(gòu)置成本較高，大部分的醫(yī)院沒(méi)有能力購(gòu)買(mǎi)，同時(shí)技術(shù)在細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)和細(xì)菌耐藥性研究方面的能力仍然有限[5]。16S 核糖體RNA(16S ribosomal RNA)[6]是原核生物的核糖體中30S 亞基的組成部分，長(zhǎng)度約為1,542 nt，一個(gè)細(xì)菌的細(xì)胞中可包含多種具有不同序列的16S rRNA。 16S rRNA是細(xì)菌菌落最常用的基因序列[7]，是獲得基因序列研究細(xì)菌多樣性的克隆擴(kuò)增，篩選克隆，測(cè)序克隆片段最經(jīng)典的方法。16S rRNA具有高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。早在2008年，Bittar F等人就提出了痰液中的復(fù)雜生物群，特別是厭氧菌在培養(yǎng)過(guò)程中很可能被忽視，他用分子生物學(xué)方法檢測(cè)了多個(gè)新興的病原菌[8]，彌補(bǔ)了細(xì)菌培養(yǎng)和表型鑒定的弊端。同時(shí)隨著基因組學(xué)的迅猛發(fā)展,細(xì)菌16S rRNA間隔區(qū)序列數(shù)據(jù)庫(kù)不斷擴(kuò)大,序列分析技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行分類(lèi)與鑒定,確定微生物在進(jìn)化中的位置[9]，已成為微生物分類(lèi)學(xué)中最重要的方法之一。

害肺戴阿里斯特桿菌主要涉及口腔疾病，如牙周炎、急性壞死性潰瘍性牙齦炎和根管感染。Colombo AP等人用微生物鑒定基因芯片(homim)發(fā)現(xiàn)難治性牙周炎的齦下菌群截然不同于治療過(guò)的牙周炎以及健康的牙周[10]，難治性牙周炎的齦下菌群會(huì)持續(xù)性地破壞牙周，引起全身感染。害肺戴阿里斯特桿菌也可從呼吸道，包括呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎[11]的感染處分離到。近期研究發(fā)現(xiàn)羊水、腦膿腫、腎移植患者的尿標(biāo)本以及各種臨床患者的骨和血培養(yǎng)均可檢到。目前文獻(xiàn)已報(bào)道了2例害肺戴阿里斯特桿菌引起的血源性感染。Kogure M等人報(bào)道一位62歲的日本婦女住院時(shí)2瓶血培養(yǎng)陽(yáng)性，經(jīng)16S rRNA鑒定為害肺戴阿里斯特桿菌，增強(qiáng)CT和磁共振成像確定患者患有鼻竇炎和齲齒[12]。Lee MY等用16S rRNA在另一例全身乏力和發(fā)熱的菌血癥患者血培養(yǎng)中鑒定出害肺戴阿里斯特桿菌和還原天芥菜堿消化鏈球[13]?？梢?jiàn)對(duì)本菌的鑒定均有賴(lài)于16S rRNA技術(shù)。

本例分離到的菌株，在其他方法均無(wú)法鑒定的情況下，選用了16S rRNA方法成功進(jìn)行了鑒定，提示16S rRNA方法可用于害肺戴阿里斯特桿菌的鑒定。為此建議有條件的實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)建立多種檢測(cè)方法，當(dāng)使用常規(guī)鑒定方法和MALDI-TOF MS無(wú)法鑒定時(shí)可考慮使用16S rRNA方法。

[1]Drago L, Vassena C, Saibene A M, et al. A case of coinfection in a chronic maxillary sinusitis of odontogenic origin: identification of Dialister pneumosintes[J]. J Endod, 2013,39(8):1084-1087.

[2]蔡加昌，張嶸. MALDI-TOF MS在細(xì)菌耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2013,33(2) :152-155.

[3]Frank J A, Reich C I, Sharma S, et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes[J]. Appl Environ Microbiol,2008,74(8):2461-2470.

[4]黃林，顧遲，唐滬強(qiáng). VITEK-2 compact系統(tǒng)鑒定臨床少見(jiàn)疑難細(xì)菌的應(yīng)用及評(píng)價(jià)[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2014,29(11):1175-1177.

[5]程敬偉，孫林英，徐志鵬，等. Vitek-2 Compact和MALDI TOF MS對(duì)棒狀桿菌屬細(xì)菌鑒定能力評(píng)估[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,29(9):15-17.

[6]Witek M A, Conn G L. Functional dichotomy in the 16S rRNA (m1A1408) methyltransferase family and control of catalytic activity via a novel tryptophan mediated loop reorganization[J]. Nucleic Acids Res, 2016,44(1):342-353.

[7]Beernink T M, Wever P C, Hermans M H, et al. Capnocytophaga canimorsus meningitis diagnosed by 16S rRNA PCR[J].Practical?neurology.?2015:practneurol-2015-001166.

[8]Bittar F, Richet H, Dubus J C, et al. Molecular detection of multiple emerging pathogens in sputa from cystic fibrosis patients[J]. PLoS One,2008,3(8):e2908.

[9]Sanschagrin S, Yergeau E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons[J]. J Vis Exp,2014(90) :e51709.

[10]Colombo A P, Boches S K, Cotton S L, et al. Comparisons of subgingival microbial profiles of refractory periodontitis, severe periodontitis, and periodontal health using the human oral microbe identification microarray[J]. J Periodontol,2009,80(9):1421-1432.

[11]Bahrani-Mougeot F K, Paster B J, Coleman S, et al. Molecular analysis of oral and respiratory bacterial species associated with ventilator-associated pneumonia[J]. J Clin Microbiol,2007,45(5):1588-1593.

[12]Kogure M, Suzuki H, Ishiguro S, et al. Dialister pneumosintes bacteremia caused by dental caries and sinusitis[J]. Intern Med,2015,54(6):663-667.

[13]Lee M Y, Kim Y J, Gu H J, et al. A Case of Bacteremia Caused by Dialister pneumosintes and Slackia exigua in a Patient with Periapical Abscess[J]. Anaerobe, 2016,38:36-38.

Theapplicationof16SrRNAinidentificationofdialisterpneumosintes

ZHENGLina1,2，LVHuoyang2@，HUQingfeng2，ZHANGJiaoli3

(1.Zhejiang Xinhua Hospital ,Hangzhou 310005,China;2.Zhejiang Province People's Hospital, Hangzhou 310014,China; 3. The Second People's Hospital of Jiaxing, Zhejiang 314012, China)

ObjectiveTo evaluate thedifferent identification of dialisterpneumosintes.MethodVitek-2 Compact, matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)and 16S ribosomal RNA (16S rRNA) were respectively used to identifydialisterpneumosintes.Result16S rRNA can identificatedialisterpneumosintes and Vitek-2 Compact and MALDI-TOF MS can not.ConclutionForDialister pneumosintes, the identification method of 16S rRNAhas more advantage than the others.

Blood culture；Dialister pneumosintes；Vitek-2 Compact；MALDI-TOF MS；16S rRNA；

鄭麗娜(1988-)，女，浙江杭州人，本科，初級(jí)檢驗(yàn)技師。研究方向：臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)

@

呂火烊 lab_lhx@126.com

R37

B

1672-0024(2016)03-0041-04