柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗中的可轉(zhuǎn)移性與應(yīng)用

羅小燕，張瑞花，賈慶麟，王文強，白昌軍，丁西朋

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

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柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗中的可轉(zhuǎn)移性與應(yīng)用

羅小燕，張瑞花，賈慶麟，王文強，白昌軍，丁西朋

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

為鑒定山螞蝗(Desmodium)種質(zhì)資源的遺傳背景及親緣關(guān)系，選取92對柱花草(Stylosanthesspp.)EST-SSR標(biāo)記和來自8個種的16份山螞蝗材料，分析柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗中的通用性，并對8種山螞蝗進(jìn)行親緣關(guān)系分析。研究結(jié)果表明，柱花草EST-SSR標(biāo)記在8種山螞蝗種的可轉(zhuǎn)移率為63.04%～73.91%，其中50對可在全部8種山螞蝗中進(jìn)行有效擴增。16對多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記在16份山螞蝗種質(zhì)中共檢測到等位基因35個，平均2.19個。聚類分析表明，16份山螞蝗種質(zhì)可分為5類，與形態(tài)學(xué)劃分結(jié)果相似。可見，柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗上具有較高的可轉(zhuǎn)移性，可應(yīng)用于山螞蝗種質(zhì)資源評價及親緣關(guān)系研究。

山螞蝗；柱花草；EST-SSR標(biāo)記；可轉(zhuǎn)移性；親緣關(guān)系分析

山螞蝗屬(Desmodium)植物為一年或多年生草本或灌木豆科植物，起源于東亞、墨西哥和巴西，是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的植物資源[1]。山螞蝗具有適應(yīng)強、生長迅速、生物量大、葉片蛋白含量高的特點，是極具潛力的高蛋白飼料資源，具有較好的飼用和綜合利用價值[2-3]。山螞蝗屬植物在全球約有350種，而在中國分布有27個種5個變種[4]，多數(shù)山螞蝗為二倍體(2n=2x=22)[5]。目前，關(guān)于山螞蝗植物系統(tǒng)發(fā)育研究主要以形態(tài)學(xué)分類為主，但山螞蝗植物種類繁多，有些種和亞種間的形態(tài)特征非常相近，形態(tài)學(xué)鑒定非常困難，存在較多同種異名或同名異種的現(xiàn)象[6-7]。國內(nèi)外有學(xué)者利用隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、擴增共有序列遺傳標(biāo)記(amplified consensus genetic markers,ACGM)及同工酶等分子標(biāo)記對山螞蝗種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性及種間親緣關(guān)系分析，但因研究手段和材料的不同，其研究結(jié)果也存在一定差異，所以開展研究山螞蝗屬種間的親緣關(guān)系對山螞蝗種質(zhì)資源研究與利用尤為重要[8-11]。

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR)，又稱微衛(wèi)星(microsatellite)，是一類由1～6個堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列，基于SSR序列的SSR標(biāo)記，是一種基于DNA長度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)[12]。根據(jù)其來源的不同，SSR標(biāo)記可分為基因組SSR標(biāo)記和EST-SSR標(biāo)記兩種[13]。SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性、操作簡單等多個優(yōu)點，是種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位和分子標(biāo)記輔助育種的理想工具[13-16]。但SSR標(biāo)記的開發(fā)成本較高，在遺傳背景研究較薄弱的物種中應(yīng)用非常有限。分子標(biāo)記的種間通用性是降低其開發(fā)成本，提高利用效率，促進(jìn)遺傳學(xué)基礎(chǔ)較薄弱物種分子遺傳學(xué)研究的重要途徑[17]。山螞蝗和柱花草(Stylosanthesspp.)作為我國南方重要牧草資源，均為豆科蝶形花亞科的草本或灌木植物，親緣關(guān)系較近。因此，本研究以前期開發(fā)的柱花草EST-SSR標(biāo)記為基礎(chǔ)[18]，通過屬間通用性分析開發(fā)在山螞蝗中可用的SSR標(biāo)記，并對山螞蝗種間親緣關(guān)系進(jìn)行分析，本研究將為山螞蝗遺傳學(xué)研究提供重要的分子標(biāo)記工具，為其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究提供更多分子水平上的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用材料為來自8個種的16份山螞蝗材料(表1)，其中7份為卵葉山螞蝗，2份圓葉舞草，2份絨毛山螞蝗，異果山綠豆、異葉山螞蝗、度尼山螞蝗、糙伏山螞蝗和灰色山螞蝗各1份。全部材料均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心提供。本研究選用的92對柱花草EST-SSR引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表2)，試驗中所用的dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×Buffer(含Mg2+)及Marker DL 2000等試劑均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 基因組DNA提取

從試驗基地選擇新鮮的山螞蝗幼嫩葉片，迅速放入冰盒帶回實驗室，利用改良CTAB法進(jìn)行山螞蝗基因組DNA抽提[19]。通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoVue超微量分光光度計(GE healthcare)對基因組DNA進(jìn)行質(zhì)量和濃度測定，然后將濃度統(tǒng)一稀釋至100 ng·μL-1，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增和電泳檢測

PCR擴增體系和反應(yīng)程序均參照丁西朋等[20]所述。擴增體系為20 μL，包括：100 ng·μL-1的基因組DNA 1 μL，5 μmol·L-1的正向和反向引物各1 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，10 mmol·L-1的dNTPs 0.4 μL，5 U·μL-1的Taq聚合酶0.3 μL，剩余體積用ddH2O補足。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，通過銀染法染色，拍照記錄后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Marker DL 2000作為擴增產(chǎn)物分子量的參照，采用“0，1”系統(tǒng)對清晰的電泳條帶進(jìn)行統(tǒng)計，在同一位點處，沒有條帶的記為“0”，有條帶的記為“1”。將統(tǒng)計結(jié)果匯總到Excel表格中建立二進(jìn)制矩陣。利用POPGENE 1.32軟件進(jìn)行分析，計算每對多態(tài)性標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)(number of alleles，Na)、等位基因頻率(allele frequency)、觀察雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(excepted heterozygosity,He)和Shannon指數(shù)(I)[21]。根據(jù)等位基因頻率按公式(1)計算每個標(biāo)記的多態(tài)性信息含量(polymorphic information content,PIC)。

式中：n表示每個位點檢測到的等位基因數(shù)量，Pi、Pj表示第i、j個等位基因出現(xiàn)的頻率[22]。利用NTSYS-pc2.1e軟件，分析材料間的遺傳相似系數(shù)(geneticsimilarity,GS)，然后利用GS采用非加權(quán)數(shù)據(jù)分析法(UPGMA)對供試材料進(jìn)行聚類分析[23]，并通過FreeTree軟件[24]采用1 000次重抽樣對聚類圖進(jìn)行bootstrap分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗中的通用性

選用92對柱花草EST-SSR標(biāo)記對16份山螞蝗材料進(jìn)行PCR擴增(圖1)，結(jié)果表明，92對標(biāo)記中有70對標(biāo)記在山螞蝗中獲得了條帶清晰且大小合適的條帶，確定為有效引物，占總標(biāo)記的76.1%。剩余22對標(biāo)記中有7對有多條帶(RM40、RM118、RM215、RM377、RM449、RM478和RM491)、15對無擴增產(chǎn)物。

表1 16份供試山螞蝗材料信息Table 1 Information of 16 Desmodium materials in this study

表2 92對柱花草EST-SSR標(biāo)記信息Table 2 Information of 92 EST-SSR markers from Stylosanthes

續(xù)表2

標(biāo)記Marker重復(fù)單元Repeatunit正向引物(5'-3') Forwardprimer(5'-3') 反向引物(5'-3') Reverseprimer(5'-3') 預(yù)期大小Expectedsize/bpRM162(TGA)6GGATGAATTGGAATCCCTTGCAATCCTTGCCACCTCTCTC279RM169(GCC)6TCGACGGAACAATATCCTCCAGCGCTGAAAACCTTAACGA163RM185(ACA)6CGATCACCACAACCAACAACCATCCAAGAAAGTGGGGTGT157RM200(TCA)7GAGGAGGTCTGTTTGACCCATGAGCAGAAGAAGCATTCCA214RM207(AAT)6AATCGCCATTGTCACAGTCACTAGCCACCTCCATCACCAT119RM215(GGC)6GGTTCCAGAGCTCAAACTGCCTTCTTCCGGTGATGGTGTT236RM226(AAC)6AAGAAGCATGGATTACCCCCGCTGTGTGTTCTCCCTTTCC193RM243(GGGATT)4AGAGGGAGGGGCTGAAATTAATCTCCCCAAATCAAAACCC192RM256(TTG)7TCTATCTCCATGCACGCAACCCACCATGAAATATCGGACA231RM265(TGC)6GCTCTGTTGATCAAACCTCCATCACCGTTTTCAACCACAGA148RM279(CAC)6GACCCGAGTACTGAACCCAAGCGACATTGAGCACCCTATT245RM301(GCT)6TTGCTACAATGCATCGCTTCGCTGAGGAGGATCAAAGTGC177RM302(GTT)6GGAGGCTGATGACACGTTTTCTTCTTACCAAGCACTCGGC131RM315(GGA)6TCGCCCTTGTAATAACCGTCTAATCAGGACACCCTCCAGC159RM338(TTC)6GCAGCACTGCATTTCCAATAATTGGGAAGGAGACAAGGGT186RM354(TGA)6CACATGGTGAGGAACACTGGTTCTCTGAACTTTTCCCACAAAA258RM355(GTG)6CGGCAGAGAACAGTTAGCCTAGCAGTGGACAAATGCTGTG199RM362(GCT)6CGGAGAACTTGCTTACGGAGTTAGATCACGCCCAAGCTCT251RM366(TTGGAG)4GGAGTTGCAAAGCCAACACTCCACGTTGTGAGAAGCACAG195RM369(ACACCC)4TCGAAAGGAGCTGGGAATAAGGGAGGGTTGTGAATGTTTG212RM377(TCA)6TGGAGCACGTTTTGTGAAGAGGTTTAGTGAAAGCAGAGGCA250RM384(TTC)6ACAGGAAGCTACATACGGCGCATCCACATTTTGCGATTTG198RM388(TGC)6CCAAGTGTTGTTGAGTGGGACAGACTCATAGGCAGAGCTCAA233RM392(TGCTGA)4GTTTTCGCGGTCTTAACGAGTGCTGCAGGGGATAAGATTC254RM402(AGA)6TCTCTTGTCATGGTGGTGGAACATCCAATCCCTGCAACTC152RM417(AAAC)5AACCAGCAACATAGCAGTATCTGTATGCTTGTGGGATGCCTATT170RM424(TGA)6AGATGTGGAGGACTGGATGGCCTTCCCGTTGAGGAATGTA227RM444(TA)8CAACATCTCACACATGGGGTTTGCTTTTCTCCATCACCAA231RM448(TTC)6GGTGGAAAAGGTTTCATTGCGCAAGTGAAGATTGCGTGAA212RM449(ATGAT)4ACATCAGCATCTCCATTCCCTAATGCTGCCCCTTTGATCT264RM450(AGAGG)4GCCTTCAGGATTCAATTCCATTTGCCTTCTTTCGATTGGT193RM468(ATTTG)4AAACAAATTGAGCCCTCCCTGGGTCCAAAACAATCCTTGA233RM469(GGTT)5TGGACAGTAACCTTTCAACCGTTGGTGAGTGAGATCATTGCTT243RM474(TTCATC)4CAAAGCCATGTTCTTCTGAGGGACCCAAAGCTTGGATTGAA219RM478(ATTTT)4GCGAGGTGATGGGTTTAGAAAACCAAATGTAGCCCAGCAG234RM485(GGA)6GTATCTTTGGCAGGCTTTGCAGGATCGTCCAGCTGAGAAA263RM486(AG)8GGGAAAGGGAATCTTCTTGCCGTGGCATCCTCTTCTGTTT210RM491(AAC)6CATGCATGGGACAGATCAAGGTCCACTCGCGAATTTCTTC276RM496(GT)8GGGATTTGACTATAGGAGGCATTCCTCCCTTCACCTCAGAA181RM498(TC)8TCCTCCTCTCAGGAAATCCACATCATTGTGGTTCTGGTGG248RM500(TTAA)5TCTTGAAATTATGCCCTGCCTCTGCTCTATTTGTGAATCCCAT242RM507(GGT)6TCAATTGAGGTTCACAGGCAGCAGAGCAGTCAATCAGCAG241RM511(CCT)6TCCCACGGATTCCAAAAATATGTGGTAGTGCTTCATCGGA184RM517(TTCT)5CTGTTTCCTAGCAAAACCGCAATTGGCGAATGAAGTGAGG238RM519(TTC)6TGATGATGCTTCTGCGATTCTACAAAGCCACCCTGACTCC280RM521(GCGGGT)4GAGTTGGCTGAGTTTGAGGCGCCTTTCACAACTTCCAACC207RM522(TAG)7TTCAAGGAAAACCCATCTGCAGCCTCATCTTGCTTTGGAA191

不同柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗屬中的可轉(zhuǎn)移率有所差異。在70對有效引物中，有20對在至少1種山螞蝗中無擴增產(chǎn)物(表3)，在山螞蝗屬中可轉(zhuǎn)移率為37.5%～87.5%。其余50對標(biāo)記(占總標(biāo)記的54.35%)在8種山螞蝗中均可檢測到，表明柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗屬中具有較高的通用性。而92對柱花草EST-SSR標(biāo)記在不同種山螞蝗間的可轉(zhuǎn)移性同樣存在明顯差異，在8種山螞蝗中的可轉(zhuǎn)移率為63.04%～73.91%。由此可知，不同種山螞蝗的遺傳背景存在顯著差別，因而檢測到柱花草EST-SSR標(biāo)記的數(shù)量也不同，這表明篩選出的可轉(zhuǎn)移性柱花草EST-SSR標(biāo)記可以對不同種山螞蝗進(jìn)行有效區(qū)分。

圖1 部分EST-SSR標(biāo)記聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Polyacrylamide gel electrophoresis of partially SSR markers表3 20對柱花草EST-SSR標(biāo)記在8種山螞蝗間的可轉(zhuǎn)移性Table 3 Transferability of 20 EST-SSR markers from Stylosanthes across 8 Desmoduim species

標(biāo)記Marker卵葉山螞蝗Do糙伏山螞蝗Ds圓葉舞草Dg異葉山螞蝗Dh絨毛山螞蝗Dv度尼山螞蝗Dr異果山綠豆Dh灰色山螞蝗Di可轉(zhuǎn)移率(標(biāo)記)Transferability(marker)/%RM354+++-+-++75.0RM18+++++-+-75.0RM17++--+--+50.0RM25-+++++++87.5RM169+++-----37.5RM392+++-+-++75.0RM129+++++--+75.0RM500-+-+-+-+50.0RM507++--+-++62.5RM134+--+++-+62.5RM116+-+++++-75.0RM302+++++-++87.5RM355+--++-++62.5RM61++--+-++62.5RM511+-+++-+-62.5RM522+--++--+50.0RM71+++-+++-75.0RM128++++++--75.0RM369++-+++++87.5RM315+-++++-+75.0總標(biāo)記數(shù)*Totalmarker6864626368586264可轉(zhuǎn)移率(種)Transferability(species)/%73.9169.5767.3968.4873.9163.0467.3969.57

注：*總標(biāo)記數(shù)包括另外50對標(biāo)記。Do，卵葉山螞蝗；Ds,糙伏山螞蝗;Dg,圓葉舞草;Dh,異葉山螞蝗;Dv,絨毛山螞蝗;Dr,度尼山螞蝗;Dh,異果山綠豆D;Di,灰色山螞蝗。表5同。

Note: *Total marker contains other 50 markers. Do,D.ovalifolium; Ds,D.strigillosum; Gg,D.gyroides; Dh,D.heterophyllum; Dv,D.velutinum; Dr,D.rensonii; Dh,D.heterocarpon; Di,D.incanum. The same as Table 5.

2.2 EST-SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

在70對有效標(biāo)記中共檢測到16對標(biāo)記在16份山螞蝗材料間具有多態(tài)性(表4)。16對多態(tài)性SSR標(biāo)記在16份山螞蝗材料中共檢測到等位基因35個，平均每個標(biāo)記2.188個。各多態(tài)性標(biāo)記的觀察雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.000～0.813和0.254～0.647，平均值分別為0.464和0.464。各多態(tài)性標(biāo)記的PIC值為0.215～0.551，平均值為0.360，其中RM243的PIC值最高。各多態(tài)性的Shannon指數(shù)變化范圍在0.410～1.036，平均值為0.672，同樣在RM243中存在最大值，表明標(biāo)記RM243具有較高的多態(tài)性。

2.3 山螞蝗種質(zhì)的遺傳多樣性與聚類分析

利用NTSYS-pc 2.10e軟件對山螞蝗種質(zhì)進(jìn)行遺傳相似系數(shù)分析表明，16份山螞蝗種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為0.523～0.952，平均0.711。其中絨毛山螞蝗E11與E16之間遺傳相似性系數(shù)最大，卵葉山螞蝗A6和異葉山螞蝗D10之間遺傳相似性系數(shù)最小。對每份山螞蝗材料與其它材料之間的平均遺傳相似系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，度尼山螞蝗F12與其它材料的平均遺傳相似系數(shù)最小，為0.621，說明度尼山螞蝗F12與其它7種山螞蝗材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?；贓ST-SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)的UPGMA聚類分析表明，在相似系數(shù)為0.730時，可將16份山螞蝗屬材料明顯劃分為五大類(圖2)：A類包含7份卵葉山螞蝗和2份圓葉舞草；B類包含1份糙伏山螞蝗和1份灰色山螞蝗；C類由2份絨毛山螞蝗材料組成；D類包括1份異果山綠豆和1份異葉山螞蝗；E類只含有1份度尼山螞蝗。

2.4 山螞蝗不同物種間的親緣關(guān)系分析

利用EST-SSR數(shù)據(jù)矩陣對這8種山螞蝗進(jìn)行相似系數(shù)和遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)(表5)，8種山螞蝗間的遺傳相似系數(shù)為0.524～0.791，其中卵葉山螞蝗和圓葉舞草間的相似系數(shù)最大，度尼山螞蝗與異果山綠豆間的相似系數(shù)最小。在8種山螞蝗中，度尼山螞蝗與其它種的相似系數(shù)均值最低，為0.619，說明度尼山螞蝗與其它種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與聚類分析結(jié)果吻合。遺傳距離分析結(jié)果與相似系數(shù)分析結(jié)果相反，卵葉山螞蝗和圓葉舞草間的遺傳距離最小為0.209，度尼山螞蝗與異果山綠豆間的遺傳距離最大，為0.476。

圖2 基于EST-SSR標(biāo)記的16份山螞蝗種質(zhì)的UPGMA樹狀圖Fig.2 Dendrogram of 16 Desmodium germplasm based on EST-SSR analysis表5 不同山螞蝗種間的遺傳距離(斜對線上方)和相似系數(shù)(斜對線下方)Table 5 Genetic distance (below diagonal) and genetic similarity (above diagonal) matrixes between different Desmodium species

山螞種蝗Desmodiumspecies卵葉山螞蝗Do糙伏山螞蝗Ds圓葉舞草Dg異葉山螞蝗Dh絨毛山螞蝗Dv度尼山螞蝗Dr異果山綠豆Dh灰色山螞蝗Di卵葉山螞蝗Do0.2690.2090.3740.2990.3670.2930.303糙伏山螞蝗Ds0.7310.3460.3330.3330.4050.3570.238圓葉舞草Dg0.7910.6540.4170.3210.3210.3450.250異葉山螞蝗Dh0.6260.6670.5830.4290.4520.2620.333絨毛山螞蝗Dv0.7010.6670.6790.5710.3580.4050.333度尼山螞蝗Dr0.6330.5950.6790.5480.6420.4760.405異果山綠豆Dh0.7070.6430.6550.7380.5950.5240.262灰色山螞蝗Di0.6970.7620.7500.6670.6670.5950.738

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

分子標(biāo)記是作物遺傳學(xué)研究和分子育種的重要工具，相對于其它基于PCR的分子標(biāo)記，SSR標(biāo)記因具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性、操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于水稻(Oryzasativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)等模式植物和玉米(Zeamay)、油菜(Brassicanapus)、小麥(Triticumaestivum)等大田作物的遺傳學(xué)研究和分子育種[12,25]。但對于遺傳學(xué)基礎(chǔ)薄弱的植物來說，SSR標(biāo)記的開發(fā)成本較高。然而研究[26-27]表明SSR標(biāo)記在近緣物種乃至遠(yuǎn)緣物種基因組間的具有一定的通用性，因此，對遺傳學(xué)基礎(chǔ)較弱的物種，物種間轉(zhuǎn)移法已成為一種廉價、快捷獲得SSR標(biāo)記的有效途徑。對1 205對綠豆(Vignaradiata)SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲得了603(50.0%)、883(73.3%)和983(81.6%)對分別在豇豆(V.unguiculata)、小豆(V.angularis)和飯豆(V.umbellate)中有效的SSR標(biāo)記[17]。水稻和甘蔗(Saccharumofficinarum)SSR標(biāo)記在竹子(Bambusaspp.)中的通用性比率分別為44.9%和75%[28]；對382對玉米SSR標(biāo)記和100對甘蔗EST-SSR標(biāo)記在禾本科芒屬上的通用性研究[29]表明，其可轉(zhuǎn)移率分別為10.29%和13.00%。山螞蝗是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的豆科牧草，當(dāng)前山螞蝗SSR標(biāo)記的缺失嚴(yán)重限制了其遺傳學(xué)研究及分子育種進(jìn)展。本研究分析了92對柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗屬中的通用性，發(fā)現(xiàn)柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗中的可轉(zhuǎn)移率為77.78%，明顯高于苜蓿EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗屬中的可轉(zhuǎn)移率(54.17%)，說明柱花草與山螞蝗的親緣關(guān)系更近，柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗中具有較好的通用性[9]。本研究使用16對多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記對山螞蝗遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)16對EST-SSR標(biāo)記可以對16份山螞蝗種質(zhì)進(jìn)行有效區(qū)分，說明本研究利用物種間轉(zhuǎn)移法獲得的在山螞蝗有效的柱花草EST-SSR標(biāo)記可作為山螞蝗遺傳學(xué)研究的有效工具，為山螞蝗的遺傳多樣性分析、基因發(fā)掘和鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等研究工作提供基礎(chǔ)。

植物種質(zhì)資源是新品種選育、提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的基礎(chǔ)資源[30]，而遺傳多樣性和親緣關(guān)系的系統(tǒng)研究不僅與資源的收集、保存和更新密切相關(guān)，也是種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用的基礎(chǔ)[31]。傳統(tǒng)的山螞蝗遺傳多樣性研究主要以植物形態(tài)特征為依據(jù)，如范小勇等[6]利用10個形態(tài)指標(biāo)對23份山螞蝗種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，最終將其分為4類，而劉苗苗等[7]通過對山螞蝗的16個植物學(xué)性狀進(jìn)行統(tǒng)計將37份山螞蝗種質(zhì)資源分為6類。由于山螞蝗屬植物種類繁多、植物學(xué)特征復(fù)雜多變，有些種和亞種間的形態(tài)特征非常相近，基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征分類方法很難對這些種進(jìn)行區(qū)分鑒定，因此花粉的顯微結(jié)構(gòu)分析和分子標(biāo)記技術(shù)被用于山螞蝗遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。對重慶地區(qū)6種山螞蝗的花粉顯微結(jié)構(gòu)的觀察比較發(fā)現(xiàn)，圓菱葉山螞蝗、寬卵葉山螞蝗和尖葉山螞蝗的花粉表面紋飾相似，應(yīng)歸為同一亞屬[32]。利用AFLP標(biāo)記對來自7個種的46份山螞蝗種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，最終將46份山螞蝗種質(zhì)分為6類[33]。利用ACGM和EST-SSR 兩種分子標(biāo)記對云貴高原的9個種46份野生山螞蝗種質(zhì)遺傳多樣性研究表明，野生山螞蝗種質(zhì)間存在較高的遺傳多樣性[9]。但這些關(guān)于山螞蝗遺傳多樣性的研究選取的材料差較大，所以各研究結(jié)果存在一定的差異，但都與《中國植物志》[34]中傳統(tǒng)分類不完全一致。

本研究利用柱花草EST-SSR對來自8個種的16份山螞蝗材料進(jìn)行了遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)16份山螞蝗種質(zhì)間的相似系數(shù)為0.523～0.952，平均0.711，說明山螞蝗種質(zhì)的遺傳多樣性較為豐富。根據(jù)聚類分析在相似系數(shù)為0.730時將16份分為5類，結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類基本一致，但也有類外，如A類中包含圓葉舞草、卵葉山螞蝗，該結(jié)果與劉苗苗等[7]、賀欣等[9]和王春梅[32]較為相近，但與《中國植物志》[34]分類不一致。所以，要確定山螞蝗種質(zhì)之間的親緣關(guān)系，不僅要使用合適的分子標(biāo)記，還要結(jié)合各種質(zhì)表型的形態(tài)多樣性和生理生化多樣性研究進(jìn)行綜合分析。

3.2 結(jié)論

綜上所述，柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗上具有較高的可轉(zhuǎn)移性，在8種山螞蝗種的可轉(zhuǎn)移率為63.04%～73.91%；利用柱花草EST-SSR標(biāo)記能夠有效地對8種山螞蝗進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析；本研究所得通用性SSR標(biāo)記將成為山螞蝗種質(zhì)資源評價及親緣關(guān)系研究的有力工具。

References:

[1] 陳艷琴,周漢林,劉國道.山螞蝗飼料資源研究進(jìn)展.草業(yè)科學(xué),2010,27(10):173-178.

Chen Y Q,Zhou H L,Liu G D.Review onDesmodiumas feed resources.Pratacultural Science,2010,27(10):173-178.(in Chinese)

[2] 李茂,陳艷琴,字學(xué)娟,周漢林.山螞蝗屬植物飼用價值評價.中國草地學(xué)報,2013,35(6):53-57.

Li M,Chen Y Q,Zi X J,Zhou H L.Feeding values assessment of species ofDesmodium.Chinese Journal of Grassland,2013,35(6):53-57.(in Chinese)

[3] 劉苗苗,尹小暢,嚴(yán)琳琳,張瑜,廖麗,白昌軍,王志勇.山螞蝗屬(DesmodiumDesv.)營養(yǎng)期營養(yǎng)成分分析.熱帶作物學(xué)報,2015,36(1):125-131.

Liu M M,Yin X C,Yan L L,Zhang Y,Liao L,Bai C J,Wang Z Y.Analysis of nutrient components at vegetative stage onDesmodiumDesv.Chinese Journal of Tropical Crops,2015,36(1):125-131.(in Chinese)

[4] 高成芝,鄒琦麗.廣西廣義山螞蝗屬部分種類的核型及染色體數(shù)目報道.廣西植物,1995,15(2):166-171.

Gao C Z,Zou Q L.A report on the keryotypes and chromosome numbers of some taxa ofDesmodium(Sensu Lat.) from Guangxi.Guihaia,1995,15(2):166-171.(in Chinese)

[5] 劉國道,羅麗娟,白昌軍,王東勁,鄭學(xué)勤.海南豆科飼用植物資源及營養(yǎng)價值評價.草地學(xué)報,2006,14(3):254-256.

Liu G D,Luo L J,Bai C J,Wang D J,Zheng X Q.A survey of Hainan island forage legume resources and assessment of their nutritional values.Acta Agrestia Sinica,2006,14(3):254-256.(in Chinese)

[6] 范小勇,劉國道,虞道耿.山螞蝗屬植物外部形態(tài)變異及形態(tài)類型研究.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(19):10051-10053.

Fan X Y,Liu G D,Yu D G.Exterior morphological variation ofDesmodiumDesv. and research on its morphological type.Journal of Anhui Agricultural Sciences,2010,38(19):10051-10053.(in Chinese)

[7] 劉苗苗,嚴(yán)琳琳,張瑜,廖麗,白昌軍,王志勇.山螞蝗屬(DesmodiumDesv.)種質(zhì)資源形態(tài)多樣性研究.熱帶作物學(xué)報,2014,35(10):1897-1904.

Liu M M,Yan L L,Zhang Y,Liao L,Bai C J,Wang Z Y. Morphological diversity ofDesmodiumDesv.Chinese Journal of Tropical Crops,2014,35(10):1897-1904.(in Chinese)

[8] Bedolla-Garcia B Y,Lara-Cabrera S I.An assessment of genetic diversity inDesmodiumsumichrastii(Fabaceae) of central Mexico.Canadian Journal of Botany,2006,84(5):876-882.

[9] 賀欣,劉國道,劉迪秋,羅富成,黃必志.利用ACGM和EST-SSR標(biāo)記對云貴高原野生山螞蝗屬種質(zhì)的遺傳多樣性分析.草業(yè)科學(xué),2008,17(6):102-111.

He X,Liu G D,Liu D Q,Luo F C,Huang B Z.Analysis of the genetic diversity ofDesmodiumgenus using transferred ACGM and EST-SSR markers.Pratacultural Science,2008,17(6):102-111.(in Chinese)

[10] Heider B,Fischer E,Berndl T,Schultze-Kraft R.Genetic relationships among accessions of four species ofDesmodiumand allied genera (Dendrolobiumtriangulare,Desmodiumgangeticum,DesmodiumheterocarponandTadehagitriquetrum).Tropical Conservation Science,2009,2(1):52-69.

[11] Yue M F,Zhou R C,Huang Y L,Xin G R,Shi S H,Feng L.Genetic diversity and geographical differentiation ofDesmodiumtriflorum(L.) DC. in south China revealed by AFLP markers.Journal of Plant Biology,2010,53:165-171.

[12] Kalia R K,Mai M K,Kalia S,Dhawan A.Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants.Euphytica,2011,177(3):309-334.

[13] Zane L,Bargelloni L,Patarnello T.Strategies for microsatellite isolation:A review.Molecular Ecology,2002,11(1):1-16.

[14] Tan C,Wu Y,Taliaferro C M,Samuels T.Development of simple sequence repeat markers for bermudagrass from its expressed sequence tag sequences and preexisting sorghum SSR markers.Molecular Breeding,2010,29(1):23-30.

[15] 陳立強,師尚禮.42份紫花苜蓿種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析.草業(yè)科學(xué),2015,32(3):372-381.

Chen L Q,Shi S L.Genetic diversity among 42 alfalfa accessions revealed by SSR markers.Pratacultural Science,2015,32(3):372-381.(in Chinese)

[16] 謝文剛,劉文獻(xiàn),張建全,王彥榮.牧草分子遺傳連鎖圖譜及應(yīng)用.草業(yè)科學(xué),2014,31(6):1147-1159.

Xie W G,Liu W X,Zhang J Q,Wang Y R.Moleculer genetic linkage map and its application in forage crops.Pratacultural Sciences,2014,31(6):1147-1159.(in Chinese)

[17] 鐘敏,程須珍,王麗俠,王素華,王小寶.綠豆基因組SSR引物在豇豆屬作物中的通用性.作物學(xué)報,2012,38(2):223-230.

Zhong M,Cheng X Z,Wang L X,Wang S H,Wang X B.Transferability of mungbean genomic-SSR markers in otherVignaspecies.Acta Agronomica Sinica,2012,38(2):223-230.(in Chinese)

[18] Ding X P,Jia Q L,Luo X Y,Zhang L,Cong H Q,Liu G D,Bai C J.Development and characterization of expressed sequence tag-derived simple sequence repeat markers in tropical forage legumeStylosanthesguianensis(Aubl.) Sw.Molecular Breeding,2015,35(10):202.

[19] 張龍,丁西朋,嚴(yán)玲玲,胡珊娜,白昌軍.8種柱花草屬牧草SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選.草業(yè)科學(xué),2014,31(2):232-242.

Zhang L,Ding X P,Yan L L,Hu S N,Bai C J.Optimization of SSR-PCR system and primers screening of eight species ofStylosanthes.Pratacultural Science,2014,31(2):232-242.(in Chinese)

[20] 丁西朋,羅小燕,賈慶麟,白昌軍.圭亞那柱花草新EST-SSR標(biāo)記驗證及其在柱花草屬上的轉(zhuǎn)移.熱帶作物學(xué)報,2015,36(10):1759-1768.

Ding X P,Luo X Y,Jia Q L,Bai C J.Transferability of novel EST-SSR markers inStylosanthesguianensisacross the species ofStylosanthes.Chinese Journal of Tropical Crops,2015,36(10):1759-1768.(in Chinese)

[21] Yeh F C,Yang R C,Boyle T.POPGENE,the user-friendly shareware for population genetic analysis.Edmonton,AB,Canada:Molecular Biology and Biotechnology Centre,University of Alberta,1999.

[22] Botstein D,White R L,Skolnick M,Davis R W.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms.The American Journal of Human Genetics,1980,32(3):314-331.

[23] Rohlf F J.NTSYS-pc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System,Version 2.10,New York:Exeter Software, 2000.

[24] Hampl V,Pavlicek A,Flegr J.Construction and bootstrap analysis of DNA fingerprinting-based phylogenetic trees with the freeware program FreeTree:Application to trichomonad parasites.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2001,51:731-735.

[25] 王瑞晶,李培英,張延輝.偃麥草EST-SSR標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用.草業(yè)科學(xué),2016,33(8):1526-1535.

Wang R J,Li P Y,Zhang Y H.Development ofElytrigiarepensEST-SSR markers and its application.Pratacultural Science,2016,33(8):1526-1535.(in Chinese)

[26] 鄧紹勇,溫強,李康琴,葉金山,朱培林.大青屬植物通用性SSR引物篩選及應(yīng)用.中草藥,2014,45(22):3317-3322.

Deng S Y,Wen Q,Li K Q,Ye J S,Zhu P L.Screening and application of SSR primers in plants ofClerodendrumL.Chinese Traditional and Herbal Drugs,2014,63(22):3317-3322.(in Chinese)

[27] Lim G A,Jewell E G,Li X,Erwin T A,Love C,Batley J,Spangenberg G,Edwards D.A comparative map viewer integrating genetic maps forBrassicaandBrabidopsis.BMC Plant Biology,2007,7:40-45.

[28] Sharma R K,Gupta P,Sharma V,Sood A,Mohapatra T,Ahujaa P S.Evaluation of rice and sugarcane SSR markers for phylogenetic and genetic diversity analyses in bamboo.Genome,2008,51(2):91-103.

[29] 盧玉飛,蔣建雄,易自力.玉米SSR引物和甘蔗EST-SSR引物在芒屬中的通用性研究.草業(yè)學(xué)報,2015,21(5):86-95.

Lu Y F,Jiang J X,Yi Z L.Study on the transferability of maize SSR and sugarcane EST-SSR markers toMiscanthus(Poaceae).Acta Pratacultuae Sinica,2015,21(5):86-95.(in Chinese)

[30] 翟夏杰,張?zhí)N薇,黃頂,王堃.中美牧草育種的現(xiàn)狀與異同.草業(yè)科學(xué),2016,33(6):1213-1221.

Zhai X J,Zhang Y W,Huang D,Wang K.Status,similarities and differences on forage breeding in USA and China.Pratacultural Science,2016,33(6):1213-1221.(in Chinese)

[31] 戎郁萍,曹喆,趙秀芳,趙來喜.美國植物種質(zhì)資源的收集、保存、利用與評價.草業(yè)科學(xué),2007,24(12):22-25.

Rong Y P,Cao Z,Zhao X F,Zhao L X.The collection,conservation,utilization and evaluation of plant germplasm USA.Pratacultural Science,2007,24(12):22-25.(in Chinese)

[32] 王春梅.山螞蝗屬植物種質(zhì)資源的AFLP分析.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2005.

Wang C M.AFLP analysis ofDesmodiumDesv.spp.germplasm resources.Master Thesis.Lanzhou:Gansu Agricultural University,2005.(in Chinese)

[33] 張渝文,李鑫.重慶地區(qū)山螞蝗屬的花粉形態(tài).渝州大學(xué)學(xué)報,1992(4):30-35.

Zhang Y W,Li X.Pollen morphology ofDesmodiumDesv. in Chongqing.Journal of Yuzhou University,1992(4):30-35.(in Chinese)

[34] 中國科學(xué)院中國植物志編委會.中國植物志.北京:科學(xué)出版社,1995:14.

Editorial Committee of Chinese Journal of Plant of Chinese Academy of Sciences.Flora of China.Beijing:Science Press,1995:14.(in Chinese)

(責(zé)任編輯 王芳)

Analysis and application of transferable EST-SSR markers fromStylosanthestoDesmodium

Luo Xiao-yan, Zhang Rui-hua, Jia Qing-lin, Wang Wen-qiang, Bai Chang-jun, Ding Xi-peng

(Institute of Tropical Crops Genetic Resources, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China)

To identify genetic background and relationships ofDesmodiumvarieties, 92StylosanthesEST-SSR markers and 16 varieties from 8Desmodiumspecies were used to assess the transferability ofStylosanthesEST-SSR markers inDesmodiumgenus and analyze the genetic relationships among 8Desmodiumspecies. The results indicated that the transferability ofStylosanthesEST-SSR markers across 8Desmodiumspecies ranged from 63.04% to 73.91%, and 50 markers of them could produce reliable amplification in all 8Desmodiumspecies. A total of 35 alleles were generated by 16 polymorphic markers with an average of 2.19 among 16Desmodiumvarieties. Cluster analysis showed that 16Desmodiumvarieties can be divided into 5 clusters, which was similar to the classification based on morphology. Therefore,StylosanthesEST-SSR markers showed high transferability inDesmodium, and it would be suitable for germplasm evaluation and genetic relationships analysis ofDesmodium.

Desmodium;Stylosanthes; EST-SSR marker; transferability; genetic relationship analysis

Ding Xi-peng E-mail:xipding@163.com;

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0371

2016-07-01 接受日期：2016-08-24

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(1630032013002)；海南地區(qū)國家草品種區(qū)域試驗和“三性”測試和現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)體系牧草崗位科學(xué)家經(jīng)費(CRASG35)

羅小燕(1980-)，女，湖北羅田人，研究實習(xí)員，碩士，主要從事熱帶牧草種質(zhì)資源評價與選育。E-mail:luoxiaoyan@gmail.com

丁西朋(1982-)，男，河南封丘人，副研究員，博士，主要從事熱帶牧草遺傳育種研究。E-mail:xipding@163.com白昌軍(1967-)，男，甘肅民勤人，研究員，博士，主要從事熱帶牧草種質(zhì)資源和栽培利用研究。E-mail:baichangjun@126.com

S540.32;Q943.2

A

1001-0629(2016)11-2237-11*

Bai Chang-jun E-mail:baichangjun@126.com

羅小燕，張瑞花，賈慶麟，王文強，白昌軍，丁西朋.柱花草EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗中的可轉(zhuǎn)移性與應(yīng)用.草業(yè)科學(xué),2016,33(11)：2237-2247.

Luo X Y,Zhang R H,Jia Q L,Wang W Q,Bai C J,Ding X P.Analysis and application of transferable EST-SSR markers fromStylosanthestoDesmodium.Pratacultural Science，2016,33(11)：2237-2247.