利用SSR分子標(biāo)記研究國(guó)內(nèi)外黍稷地方品種和野生資源的遺傳多樣性

連 帥，陸 平，喬治軍，張 琦，張 茜，劉敏軒，王瑞云

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；3山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所，太原 030031）

利用SSR分子標(biāo)記研究國(guó)內(nèi)外黍稷地方品種和野生資源的遺傳多樣性

連 帥1,2，陸 平2，喬治軍3，張 琦2，張 茜2，劉敏軒2，王瑞云1

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；3山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所，太原 030031）

【目的】從分子水平研究國(guó)內(nèi)外黍稷種質(zhì)資源的遺傳多樣性差異，為黍稷種質(zhì)資源的研究、保護(hù)和利用提供依據(jù)?！痉椒ā坑貌煌乩韥?lái)源且性狀差異顯著的6份黍稷種質(zhì)資源對(duì)來(lái)自高通量測(cè)序技術(shù)開發(fā)的黍稷基因組SSR引物進(jìn)行篩選，從而獲得條帶清晰，穩(wěn)定性好的63對(duì)SSR黍稷基因組引物，利用這63對(duì)SSR多態(tài)性引物對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外的192份黍稷地方品種和野生種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。統(tǒng)計(jì)各試材在同一引物中的條帶情況，并以此來(lái)分析試材的遺傳多樣性與所在群體間的親緣關(guān)系?！窘Y(jié)果】63對(duì)SSR引物共檢測(cè)出161個(gè)等位變異位點(diǎn)，平均每個(gè)SSR位點(diǎn)2.56個(gè)；平均Shannon-Weaver指數(shù)（I）為0.6275，平均基因多樣度（Nei）為0.3874，平均PIC值為0.4855。10個(gè)不同地理來(lái)源群體間表現(xiàn)出顯著的遺傳多樣性差異，各群體的有效等位變異變化范圍較窄，最小的是南方群體，為1.2407±0.4315；最大的是內(nèi)蒙古高原群體，為1.8846±0.4892。國(guó)內(nèi)群體Shannon-Weaver指數(shù)為內(nèi)蒙古高原＞東北地區(qū)＞黃土高原＞西北地區(qū)＞南方地區(qū)，而國(guó)外Shannon-Weaver指數(shù)排序依次為前蘇聯(lián)＞歐洲＞蒙古＞印度＞美國(guó)。從Nei’s基因雜合度分析，觀察雜合度(Ho)最小的是印度群體，為0.2372±0.2962，最大的是內(nèi)蒙古高原群體，為0.3966±0.3250。期望雜合度（He）最小的是美國(guó)群體，為0.3114±0.2203；最大的是內(nèi)蒙古高原群體，為0.4622±0.1862。從國(guó)外種、國(guó)內(nèi)栽培種和國(guó)內(nèi)野生種3個(gè)大群體來(lái)看，野生種質(zhì)資源有效等位基因數(shù)（1.9285±0.5101）、Shannon-Weaver指數(shù)（0.6948±0.2852）、Nei基因多樣性指數(shù)（0.4373± 0.1773）遠(yuǎn)大于國(guó)外種和國(guó)內(nèi)栽培種。而對(duì)國(guó)內(nèi)外兩大群體而言，國(guó)內(nèi)資源的有效等位基因數(shù)（1.8145±0.4519）、Shannon-Weaver指數(shù)（0.6657±0.2413）和Nei基因多樣性指數(shù)（0.412±0.1574）均大于國(guó)外資源（1.6862± 0.4527、0.5897±0.2469、0.3652±0.1655）。UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，10個(gè)地理群聚為三大類，內(nèi)蒙古高原地區(qū)、黃土高原地區(qū)、東北地區(qū)、西北地區(qū)、蒙古地區(qū)聚為一類，前蘇聯(lián)、美國(guó)、印度、歐洲地區(qū)聚為一類，南方地區(qū)單獨(dú)聚為一類。其中，來(lái)自東北黑龍江齊齊哈爾的泰來(lái)小野糜（34號(hào)）在截距0.37處被獨(dú)立分為一支，來(lái)自甘肅的野黍子（19號(hào)）在截距0.34處被分為獨(dú)立個(gè)體，表明這兩個(gè)材料與其他材料遺傳差異較大。但從整體遺傳多樣性上來(lái)看192份材料國(guó)內(nèi)外群體遺傳分化不明顯，群體間的親緣關(guān)系較近，且不同群體間材料存在著互相滲透?！窘Y(jié)論】?jī)?nèi)蒙地區(qū)、東北地區(qū)、黃土高原地區(qū)種質(zhì)資源遺傳多樣性最豐富，是遺傳關(guān)系最為復(fù)雜的地區(qū)，進(jìn)一步印證了中國(guó)是黍稷起源的中心。

黍稷；地方品種；野生種；SSR標(biāo)記；遺傳多樣性

0 引言

【研究意義】黍稷（Panicum miliaceum L.）起源于中國(guó)[1]，屬于禾本科（Gramineae）黍?qū)伲≒anicum L.），一年生草本植物，具有早熟、耐旱、耐瘠的特性[2]。全世界黍稷栽培面積約600萬(wàn)公頃，主產(chǎn)區(qū)分布在歐洲和亞洲，主產(chǎn)國(guó)為原蘇聯(lián)和中國(guó)，中國(guó)主要分布在西北、華北、東北地區(qū)，南方有零星種植[3]。黍稷能適應(yīng)多種土壤，對(duì)肥力較差的砂土有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，耐鹽堿能力也較強(qiáng)，常作為鹽堿地和開荒沙漠的先鋒作物。因其生育期短，也作為自然災(zāi)害后的補(bǔ)救作物[4]。中國(guó)雖是黍稷的主產(chǎn)國(guó)，并在種質(zhì)資源方面取得了一些研究成果，但基于DNA水平分子標(biāo)記的研究開發(fā)卻相對(duì)較少，應(yīng)用分子標(biāo)記的報(bào)道則更少，尤其是隨著黍稷種質(zhì)資源研究的不斷深入，對(duì)黍稷的國(guó)外種，野生種和野生近緣植物的搜集、研究和保護(hù)更為需要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，DNA分子標(biāo)記發(fā)展迅速，已作為研究遺傳變異的重要手段應(yīng)用于各種作物的遺傳多樣性研究中，如谷子[5]、玉米[6]、陸地棉[7]、野生稻[8]等。其中，SSR可直接檢測(cè)DNA分子結(jié)構(gòu)變異[9]、并能反映參試材料差異、靈敏度較高、穩(wěn)定性較好、操作較簡(jiǎn)單[10]，因而在遺傳多樣性分析[11]、種質(zhì)鑒定、DNA指紋圖譜構(gòu)建[10]、基因定位和分子標(biāo)記育種[12]中廣泛應(yīng)用。此外，SSR分子標(biāo)記為共顯性，具有多態(tài)性豐富、PCR結(jié)果重現(xiàn)性高和易于鑒別基因型的優(yōu)點(diǎn)[13]，是群體遺傳標(biāo)記變異的最好標(biāo)記之一[14]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于黍稷種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究一直匱乏。M'RIBU等[15]應(yīng)用RAPD技術(shù)研究4種黍稷的遺傳多樣性以判定其來(lái)源，根據(jù)原產(chǎn)地的地理區(qū)域?qū)κ蝠⑵贩N進(jìn)行了劃分。KARAM等[16-17]對(duì)12份來(lái)源于美國(guó)和加拿大的黍稷利用AFLP標(biāo)記檢測(cè)其遺傳多樣性。LáGLER等[18]選用9個(gè)來(lái)自草莓屬植物的ISSR標(biāo)記檢測(cè)了21份匈牙利黍稷，檢測(cè)到15個(gè)等位基因，其中只有7個(gè)引物擴(kuò)增出DNA片段。HUNT等[19]利用禾本科作物（水稻、小麥、燕麥、大麥）的46對(duì)SSR引物對(duì)118份材料進(jìn)行SSR多樣性分析，得出黃土高原生態(tài)型材料的遺傳多樣性比較豐富，有可能是黍稷的起源中心的結(jié)論。CHO等[20]通過(guò)一個(gè)SSR富集文庫(kù)黍基因組DNA開發(fā)了25個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記并分析了50份黍稷材料的遺傳多樣性；連帥等[21]利用5個(gè)黍稷特異性SSR標(biāo)記對(duì)5個(gè)黍稷栽培生態(tài)區(qū)的40份黍稷進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記表現(xiàn)出了一定的地域性；LI等[22]通過(guò)核糖體DNA（rDNA）分析內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ETS），發(fā)現(xiàn)黍稷在ITS具有特異性的特點(diǎn)，并通過(guò)對(duì)新疆墓地出土的古DNA和現(xiàn)代品種黍稷材料的分析，得到黍稷遺傳多樣性隨時(shí)間流逝而部分喪失，還進(jìn)一步推出新疆在黍稷馴化和傳播中東西方聯(lián)系的十字路口的重要地位?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于可應(yīng)用的分子標(biāo)記很少且多態(tài)性不高，已有研究不足以全面反映黍稷的遺傳多樣性水平。小宗作物課題組利用二代測(cè)序技術(shù)大規(guī)模開發(fā)了黍稷基因組SSR引物，并分析了黍稷育成品種的遺傳多樣性（文章已接受待出版）。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究采用前期篩選得到的162對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記進(jìn)一步對(duì)保存在國(guó)家種質(zhì)庫(kù)國(guó)內(nèi)不同生態(tài)區(qū)的地方栽培品種、野生種以及從國(guó)外收集引進(jìn)來(lái)自不同國(guó)家的黍稷種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。以揭示黍稷種質(zhì)資源群體間的遺傳多樣性關(guān)系與遺傳多樣性地理分布的特點(diǎn)，為黍稷種質(zhì)資源的研究、保護(hù)和利用提供依據(jù)，同時(shí)也為后續(xù)進(jìn)行黍稷的起源、演化、傳播研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料包括來(lái)自國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)的50份國(guó)內(nèi)材料和近年新收集引進(jìn)的142份國(guó)外材料（電子附表）。其中國(guó)內(nèi)資源包括31份栽培種（山西2份、內(nèi)蒙3份、黑龍江3份、甘肅5份、新疆3份、陜西4份、吉林3份、寧夏3份、河北2份、遼寧1份、海南1份、青海1份）和19份野生資源（山西9份、內(nèi)蒙5份、黑龍江3份、甘肅1份、新疆1份）。142份國(guó)外資源分別來(lái)自蒙古（81份）、印度（28份）、美國(guó)（11份）、蘇聯(lián)（8份）、土耳其（4份）、波蘭（3份）、德國(guó)（3份）、匈牙利（1份）、吉爾吉斯斯坦（1份）、哈薩克斯坦（1份）、韓國(guó)（1份）。根據(jù)參試材料的來(lái)源地，首先將其分成國(guó)內(nèi)種和國(guó)外種兩大群體；再進(jìn)一步將國(guó)內(nèi)栽培種和野生種質(zhì)分開，分為國(guó)外種，國(guó)內(nèi)栽培種和國(guó)內(nèi)野生種3個(gè)組群；最后根據(jù)栽培區(qū)、地理來(lái)源將來(lái)自國(guó)內(nèi)（12個(gè)省（區(qū)））和國(guó)外（11個(gè)國(guó)家）的材料分為10亞群，分別為內(nèi)蒙古高原區(qū)（內(nèi)蒙古）、東北區(qū)（黑龍江、吉林、遼寧、河北承德）、黃土高原區(qū)（山西、陜西、寧夏）、西北區(qū)（甘肅、新疆、青海）、南方區(qū)（海南）、蒙古（蒙古、韓國(guó)）、印度、美國(guó)、前蘇聯(lián)、歐洲（土耳其、波蘭、德國(guó)、匈牙利、吉爾吉斯斯坦、哈薩克斯坦）。

1.2 DNA提取與檢測(cè)

每個(gè)參試材料隨機(jī)選取20個(gè)單株中的幼嫩葉片組織60 mg混合后，用新型植物基因組DNA快速提取試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物有限公司）提取基因組DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，之后再用NanoDropND-1000（NanoDrop，Wilmington，DE，USA）測(cè)定濃度后加入100 mL雙純水將其稀釋成DNA母液于-80℃低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR擴(kuò)增及電泳

采用162對(duì)小宗作物課題組通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)開發(fā)的黍稷基因組SSR引物，選用6份不同地理來(lái)源、性狀差異顯著的黍稷種質(zhì)資源（國(guó)外3份，國(guó)內(nèi)3份）為DNA模板進(jìn)行引物的PCR擴(kuò)增和多態(tài)性篩選，最終篩選出63對(duì)條帶清晰，多態(tài)性穩(wěn)定的SSR引物用于后續(xù)的遺傳多樣性分析。

SSR擴(kuò)增反應(yīng)在MY-CYCLERPCR儀上進(jìn)行。20 μL反應(yīng)體系中含1.2 μL基因組DNA、0.6 μL引物、0.4 μL Taq酶（2.5 U·μL-1）、2 μL 10×buffer、0.8 μL dNTP（10 mmol·L-1）和ddH2O 15.0 μL。PCR程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。然后于16℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，之后用硝酸銀染色顯影。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

分別記錄同一SSR引物擴(kuò)增電泳條帶（等位變異）在各參試材料中的有無(wú)。若有，根據(jù)分子量從大到小的順序，記錄為A、B、C……；若無(wú)，記為..。不同群體間和群體內(nèi)的某一位點(diǎn)的觀測(cè)等位變異數(shù)（observed number of alleles，Na）、有效等位變異數(shù)（effective number of alleles，Ne）、觀測(cè)雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）及Shannon-Weaver指數(shù)等遺傳參數(shù)的統(tǒng)計(jì)計(jì)算和不同群體間的Nei78遺傳距離在Popgen1.32軟件包[23]中完成；在PowerMarkerV3.25軟件包和MEGA6軟件包[24]中完成參試材料間多態(tài)性信息含量指數(shù)（polymorphism information content index，PIC）和Nei83遺傳距離頻率計(jì)算及群體間遺傳距離頻率的聚類圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 SSR多態(tài)性引物的篩選

利用隨機(jī)選擇的6份材料對(duì)162對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR退火溫度和引物擴(kuò)增多態(tài)性篩選，有77對(duì)SSR引物能擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定、可辨識(shí)的譜帶，有效擴(kuò)增比率為48.1%，其中63對(duì)SSR引物具有多態(tài)性，多態(tài)性引物比率為77.8%。最終選用63對(duì)具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物進(jìn)行全部參試材料的遺傳多樣性分析。

2.2 SSR位點(diǎn)多樣性分析

表1 63對(duì)SSR引物測(cè)定的遺傳參數(shù)Table 1 Genetic parameters from the 63 polymorphic SSR markers used in this study

續(xù)表1 Continued table 1

192份參試材料在63對(duì)SSR引物上共檢測(cè)出161個(gè)等位變異（表1），變幅為2—4個(gè)，平均每對(duì)SSR引物擴(kuò)增出2.56個(gè)等位變異，其中有效等位變異數(shù)1.74，有效等位變異所占比重為67.97%。其中，引物BM552、BM1701、LMX1251等位變異最多，為4個(gè)，其有效等位變異數(shù)分別為2.0741、1.7599和1.1824。多態(tài)性信息量（PIC）的變幅介于0.0877—0.8020，平均值為0.4855，PIC指數(shù)最大的標(biāo)記是BM637，最小的標(biāo)記是LMX786。觀測(cè)雜合度（Ho）在0（LMX1071、1387）—0.9405（LMX1332）變化，平均為0.2940。期望雜合度（He）的平均值為0.3887，最大是0.6664（BM637），最小為0.028（LMX684）。Nei基因多樣性指數(shù)的變化范圍是0.0279（LMX684）—0.6645（BM637）。Shannon-Weaver指數(shù)值最大的位點(diǎn)是BM637，最小的為L(zhǎng)MX684，Shannon-Weaver指數(shù)變化范圍為0.0743—1.0953，平均0.6275。結(jié)果表明，獲得的SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性比較豐富，且不同指標(biāo)能從不同角度揭示黍稷SSR引物在遺傳多樣性方面存在的巨大差異，其中，效等位變異數(shù)、Shannon-Weaver指數(shù)與Nei基因多樣性指數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)，能夠反映群體遺傳多樣性。因此，有效等位變異數(shù)、Nei基因多樣性指數(shù)和Shannon-Weaver指數(shù)這三個(gè)參數(shù)對(duì)于遺傳多樣性分析意義重大。

2.3 不同來(lái)源黍稷資源群體間的遺傳變異分析

由表2可知，各參試群體的有效等位變異變化范圍較窄，最小的是南方群體，為1.2407±0.4315；最大的是內(nèi)蒙古高原群體，為1.8846±0.4892；總體看來(lái)，有效等位變異，國(guó)內(nèi)5個(gè)群體大于國(guó)外各群體。國(guó)內(nèi)群體間的有效等位變異依次為內(nèi)蒙古高原＞東北地區(qū)＞黃土高原＞西北地區(qū)＞南方地區(qū)，變化范圍為（1.2407±0.4315）—（1.8846±0.4892）。國(guó)外群體間有效等位變異依次是前蘇聯(lián)＞歐洲＞蒙古＞印度＞美國(guó)。變化范圍為（1.5522±0.4658）—（1.7409±0.4662）。分析有效等位變異結(jié)果可知，國(guó)內(nèi)外群體間的有效等位變異差異不大，但國(guó)內(nèi)群體間的遺傳豐富度總體大于國(guó)外群體。

國(guó)內(nèi)群體的Shannon-Weaver指數(shù)最小值為0.1669±0.2991；最大值為0.6694±0.2799，均值為0.5319± 0.2888，分布也較國(guó)外更為寬泛。國(guó)內(nèi)群體Shannon-Weaver指數(shù)為內(nèi)蒙古高原＞東北地區(qū)＞黃土高原＞西北地區(qū)＞南方地區(qū)，其中內(nèi)蒙古高原群體與東北地區(qū)群體的Shannon-Weaver指數(shù)接近，只差0.007。國(guó)外群體Shannon-Weaver指數(shù)范圍為（0.4584±0.3102）—（0.5916±0.2722），均值為0.5358±0.2849。Shannon-Weaver指數(shù)排序依次為前蘇聯(lián)＞歐洲＞蒙古＞印度＞美國(guó)。由Shannon- Weaver指數(shù)分析結(jié)果可知，國(guó)內(nèi)群體間的Shannon- Weaver指數(shù)即遺傳均勻度差異不大，但國(guó)內(nèi)群體總體高于國(guó)外。

從Nei’s基因雜合度分析，觀察雜合度（Ho）最小的是印度群體，為0.2372±0.2962，最大的是內(nèi)蒙古高原群體，為0.3966±0.3250；前蘇聯(lián)群體次之，為0.3539±0.3347。期望雜合度（He）最小的是美國(guó)群體，為0.3114±0.2203；最大的是內(nèi)蒙古高原群體，為0.4622±0.1862?？傮w來(lái)看，Ho值國(guó)內(nèi)群體比國(guó)外群體略小，而He值國(guó)內(nèi)群體卻比國(guó)外群體稍大。

表2 10個(gè)群體的遺傳多樣性分析Table 2 Estimates of genetic diversity within 10 populations of the main cultivation areas of broomcorn millet

對(duì)于有效等位變異數(shù)和Shannon-Weaver指數(shù)，不同群體的變化趨勢(shì)是一致的。如國(guó)內(nèi)內(nèi)蒙古高原、東北群體都遠(yuǎn)大于國(guó)外群體。而對(duì)于觀察雜合度和期望雜合度來(lái)說(shuō)，變化趨勢(shì)卻并不完全一致，但總的結(jié)果是國(guó)內(nèi)群體的Nei基因多樣性指數(shù)是高于國(guó)外群體。因此，等位變異數(shù)、有效等位變異數(shù)以及有效等位變異所占比重等指標(biāo)，可從不同側(cè)面揭示各群體材料的特點(diǎn)。Nei基因多樣性指數(shù)、Shannon-Weaver指數(shù)則綜合反映了各群體的遺傳多樣性。

據(jù)此，綜合各遺傳參數(shù)可知，國(guó)內(nèi)黍稷種質(zhì)遺傳多樣性總體高于國(guó)外種質(zhì)。國(guó)外群體中，前蘇聯(lián)、歐洲的遺傳多樣性較高。而在國(guó)內(nèi)群體中，內(nèi)蒙古高原、東北地區(qū)的遺傳多樣性較高，除南方地區(qū)外基本均高于國(guó)外群體。南方地區(qū)因不是黍稷栽培的主載區(qū)，取材少，類型單一，多樣性低。

就國(guó)內(nèi)資源和國(guó)外資源兩大群體而言（表3），國(guó)內(nèi)資源的有效等位基因數(shù)（1.8145±0.4519）、Shannon-Weaver指數(shù)（0.6657±0.2413）和Nei基因多樣性指數(shù)（0.412±0.1574）均大于國(guó)外資源（1.6862±0.4527、0.5897±0.2469、0.3652±0.1655）。因此，認(rèn)為此次分析的國(guó)內(nèi)黍稷資源的遺傳多樣性大于國(guó)外種質(zhì)資源。而從國(guó)外種、國(guó)內(nèi)栽培種和國(guó)內(nèi)野生種3個(gè)大群體來(lái)看（表4），野生種質(zhì)資源有效等位基因數(shù)（1.9285±0.5101）、Shannon-Weaver指數(shù)（0.6948±0.2852）、Nei基因多樣性指數(shù)（0.4373± 0.1773）遠(yuǎn)大于國(guó)外種和國(guó)內(nèi)栽培種，而由于缺少了野生種的國(guó)內(nèi)栽培種也同時(shí)因材料過(guò)少，有效等位基因數(shù)（1.6727±0.4612）、Shannon-Weaver指數(shù)（0.5528± 0.2877）、Nei基因多樣性指數(shù)（0.352±0.1925）略低于國(guó)外種（1.6862±0.4527、0.5897±0.2469、0.3652± 0.1655），由此可知，國(guó)內(nèi)野生資源在黍稷遺傳多樣性中的重要地位。

表3 國(guó)內(nèi)外群體遺傳多樣性分析Table 3 Estimates of genetic diversity of populations of broomcorn millet from home and abroad

表4 野生種與國(guó)內(nèi)外群體遺傳多樣性分析Table 4 Estimates of genetic diversity of wild species and populations of broomcorn millet from home and abroad

2.4 遺傳相似性分析

采用POPGENE1.32計(jì)算不同群體黍稷種質(zhì)間的遺傳相似度（表5），結(jié)果顯示遺傳距離的變化范圍為0.0207—0.2948，平均值為0.1030，遺傳一致度的變化范圍0.7447—0.9796，平均值0.9046。其中，南方群體與國(guó)內(nèi)外群體間遺傳距離均達(dá)0.2以上，內(nèi)蒙古高原群體和印度、美國(guó)遺傳距離也達(dá)0.1水平，而遺傳距離最小的是黃土高原和西北群體，只有0.0207，遺傳距離越大，說(shuō)明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，遺傳相似性越低，而各群體間遺傳距離變化區(qū)間只有0.27左右，遺傳一致度接近于1，表明各群體間遺傳距離大不，親緣關(guān)系都很近，遺傳相似性高。

2.5 參試群體的UPGMA聚類分析

利用10個(gè)參試群體繪制的基于UPGMA法的樹狀聚類圖，從遺傳距離頻率0.09處可將所有參試群體聚類為3大組群，分別命名為組群Ⅰ、組群Ⅱ和組群Ⅲ（圖1）。

組群I由來(lái)自于國(guó)內(nèi)黃土高原、東北、西北、內(nèi)蒙古高原生態(tài)區(qū)和蒙古的材料組成。聚類分析表明，遺傳關(guān)系與地理分布有關(guān)，整個(gè)組群I地理分布上緊密連接，由國(guó)內(nèi)黍稷主栽區(qū)與接壤的蒙古構(gòu)成。

表5 10個(gè)群體遺傳距離與遺傳一致度Table 5 Nei’s unbiased measures of genetic identity and genetic distance

圖1 基于SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)的種質(zhì)資源群體間聚類分析圖Fig. 1 Dendrogram generated by UPGMA cluster analysis of 10 populations of the main cultivation areas of broomcorn millet accessions based on data from 63 SSR markers

組群Ⅱ全部由國(guó)外群體組成。前蘇聯(lián)與歐洲群體遺傳關(guān)系較近，美國(guó)和印度群體遺傳關(guān)系較近，前蘇聯(lián)和歐洲群體地理分布相連，而美國(guó)和印度材料遺傳關(guān)系近，可能因?yàn)橐N地相似一致和長(zhǎng)年馴化的結(jié)果?？傮w上，組群Ⅰ和組群Ⅱ有可能是長(zhǎng)期地理隔離引起的生殖隔離造成的。

組群Ⅲ由南方群體構(gòu)成，南方群體自成一支與國(guó)內(nèi)外群體遺傳關(guān)系均較遠(yuǎn)，從地理分布上看，它離黍稷主栽區(qū)較遠(yuǎn)，長(zhǎng)期的自然條件、人為影響或許是造成與大部分群體差異較大的原因。但因南方群體的取材較少，地區(qū)、品種單一，具體原因有待進(jìn)一步研究。

從192個(gè)參試個(gè)體繪制的基于UPGMA法的樹狀聚類圖（圖2）來(lái)看，所有材料的遺傳距離頻率在0.06—0.37變化，其中來(lái)自東北黑龍江齊齊哈爾的泰來(lái)小野糜（34號(hào)）在截距0.37處被獨(dú)立分為一支，來(lái)自甘肅的野黍子（19號(hào)）在截距0.34處被分為獨(dú)立個(gè)體，表明這兩個(gè)材料與其他材料遺傳差異較大。其余材料在截距0.31處被分為若干個(gè)小群體，個(gè)體與個(gè)體間差異不大，沒有分成大的聚類，整體分布與地理分布有一定關(guān)聯(lián)，也存在區(qū)域間和國(guó)內(nèi)外間的互相滲透。

圖2 基于SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)的192份材料聚類圖Fig. 2 Dendrogram generated by UPGMA cluster analysis of 192 broomcorn millet accessions based on data from 63 SSR markers

綜上，基于遺傳距離頻率的UPGMA法構(gòu)建的樹狀聚類圖與遺傳距離、遺傳一致度的分析結(jié)果，相互印證、吻合一致。

3 討論

3.1 黍稷遺傳多樣性

黍稷雖栽培歷史久遠(yuǎn)，但作為小宗作物，種植面積狹小，食用人群較少，所關(guān)注程度一直較低，所以研究水平也一直落后于水稻、小麥、玉米主要作物。盡管國(guó)家種質(zhì)庫(kù)中保存著8 600多份黍稷種質(zhì)資源，但開展的研究主要集中于形態(tài)學(xué)水平的遺傳多樣性評(píng)價(jià)和抗旱耐鹽資源的初步鑒定等方面，而對(duì)分子水平的遺傳多樣性則所知甚少。如胡興雨等[24]對(duì)來(lái)自國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)中的8 016份黍稷種質(zhì)資源進(jìn)行了株高、千粒重、生育期等11個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行主成分分析和聚類分析；WANG等[25]選擇《中國(guó)黍稷（糜）品種資源目錄》中山西省1 192份黍稷種質(zhì)，分析了黍稷種質(zhì)資源穗型與主要農(nóng)藝性狀的關(guān)系；LIU等[26]研究了不同耐性黍稷在混合鹽脅迫下的生理應(yīng)答機(jī)制并分析了195份黍稷核心種質(zhì)的耐鹽性[27]，為后續(xù)開展耐鹽基因挖掘奠定了基礎(chǔ)；王綸等[28]選用山西省有代表性的500份黍稷種質(zhì)資源采用反復(fù)干旱法進(jìn)行了抗旱性鑒定評(píng)價(jià)；劉曉歡等[29]研究了黍稷品種間農(nóng)藝性狀的形態(tài)解剖差異；張盼盼等[30]對(duì)黍稷苗期PEG脅迫下抗旱指標(biāo)進(jìn)行了鑒選研究。而在分子水平，黍稷中已有AFLP[16-17]、RAPD[15]和ISSR[18]等標(biāo)記應(yīng)用于遺傳多樣性研究。KARAM等[16-17]檢測(cè)了黍稷遺傳多樣性用AFLP銀染標(biāo)記；LáGLER等[18]選用9個(gè)來(lái)自草莓屬植物的ISSR標(biāo)記檢測(cè)了21份匈牙利黍稷；2008年，HUNT等[19]對(duì)來(lái)源于中國(guó)不同生態(tài)區(qū)的118份黍稷材料選取了水稻、小麥、大麥和燕麥的46個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行了遺傳變異分析；2010年，CHO等[20]通過(guò)構(gòu)建黍稷基因組DNA的富SSR文庫(kù)，以此開發(fā)了25個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。上述研究所用標(biāo)記，特別是SSR標(biāo)記的數(shù)量較少，很難全面反映黍稷種質(zhì)資源的多樣性，因此從黍稷自身基因組開發(fā)SSR標(biāo)記對(duì)促進(jìn)其遺傳多樣性的研究具有十分重要的意義。隨著測(cè)序技術(shù)的成熟發(fā)展及其價(jià)格降低，應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)與磁珠富集法相結(jié)合大規(guī)模的開發(fā)了谷子[31]、燕麥[32]、蠶豆[33]和山黧豆[34]等作物的基因組SSR標(biāo)記，大大促進(jìn)了相關(guān)小宗作物分子水平的研究進(jìn)展。本研究對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外不同生態(tài)區(qū)的的192份種質(zhì)（栽培種和野生種）利用前期開發(fā)的黍稷基因組SSR引物進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)出161個(gè)等位變異，其中每對(duì)引物有效等位變異數(shù)1.74，有效等位變異所占比重為67.97%。多態(tài)性信息量PIC介于0.0877—0.8020，Nei基因多樣性指數(shù)的變化范圍是0.0279—0.6645，Shannon-Weaver指數(shù)變化范圍為0.0743—1.0953，其數(shù)值結(jié)果均高于先前研究，基因組SSR標(biāo)記的成功應(yīng)用，對(duì)黍稷種質(zhì)資源的遺傳多樣性有了更全面多樣的認(rèn)識(shí)，并有助于黍稷遺傳資源的進(jìn)一步挖掘利用。同時(shí)本研究建立的SSR標(biāo)記在分子水平也為國(guó)內(nèi)黍稷資源研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

3.2 黍稷起源、演化與傳播

黍稷是人類最早馴化栽培的谷物之一，中國(guó)是目前已知的黍稷栽培歷史最悠久的國(guó)家，研究中國(guó)黍稷和國(guó)外黍稷的遺傳多樣性水平，對(duì)于探討黍稷的起源、演化與傳播也具有重要的意義。本研究通過(guò)對(duì)來(lái)自黍稷主栽區(qū)192份黍稷品種進(jìn)行SSR遺傳多樣性的系統(tǒng)分析，揭示了各群體間遺傳多樣性差異。其中，內(nèi)蒙古高原、東北、黃土高原群體在有效等位變異、Shannon-Weaver指數(shù)和Nei基因多樣性指數(shù)都高于其他群體，結(jié)合其他各參數(shù)而言，國(guó)內(nèi)黍稷資源的遺傳多樣性也大于國(guó)外種質(zhì)資源，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)不同群體黍稷種質(zhì)間的遺傳距離變化范圍為0.0207—0.2948，遺傳一致度變化范圍為0.7447—0.9796，更進(jìn)一步顯示出10個(gè)群體來(lái)源的黍稷資源群體間的遺傳距離不大，親緣關(guān)系都很近，遺傳相似性高。

通過(guò)分析各栽培區(qū)的遺傳多樣性可以為黍稷的起源和演化研究提供依據(jù)和思路。在先前研究中，中國(guó)、中亞和中歐都被提出為黍和其野生祖先馴化的可能起源中心，但具體位置尚有待于進(jìn)一步研究確認(rèn)[35]。而中國(guó)黍稷品種資源群體間的顯著差異，作為全世界大面積栽培黍稷的國(guó)家，栽培環(huán)境、自然氣候條件千差萬(wàn)別，同時(shí)還可能隱含著自然和人工優(yōu)勝選擇、栽培資源與野生資源的互相基因滲透，這也是世界的其他地方不能比擬的。從研究中可知，中國(guó)黍稷種質(zhì)的遺傳多樣性高于國(guó)外品種，擁有更多樣多元的遺傳多樣性，此結(jié)果與胡興雨等[24]的研究結(jié)果一致。其中，內(nèi)蒙古高原群體和東北群體品種的遺傳多樣性要高于其他地區(qū)，該區(qū)域有可能是黍稷起源地，并以此向周邊擴(kuò)展，此結(jié)果與LI等[22]推得新疆是黍稷馴化和傳播的十字路口，是由中國(guó)北方通過(guò)新疆向中亞、西亞進(jìn)而進(jìn)入歐洲的結(jié)果一致。同時(shí)，蒙古與國(guó)內(nèi)歸為一組，俄羅斯與歐洲歸為一組的研究互相佐證，表明群體聚類與馴化、傳播及地理分布有一定關(guān)聯(lián)。

3.3 特殊群體與特殊個(gè)體

黑龍江齊齊哈爾的泰來(lái)小野糜（34號(hào)）和甘肅的野黍子（19號(hào)）在聚類分析中非常獨(dú)特，遠(yuǎn)遠(yuǎn)分離于其他黍稷材料之外。這有可能是由于野生種質(zhì)沒有經(jīng)過(guò)人為馴化不受人為環(huán)境影響又或是與其他野生近緣種雜交影響所致。而對(duì)于南方種群雖僅有一份材料但在群體聚類中卻自成一個(gè)獨(dú)立的群體，與國(guó)內(nèi)外其他各群體遺傳距離均達(dá)0.2以上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能與自然環(huán)境，所在的氣候區(qū)有關(guān)，真實(shí)原因還需利用植物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等手段對(duì)其他性狀進(jìn)行深入研究。

同時(shí)通過(guò)將國(guó)內(nèi)栽培種和野生種分別分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了國(guó)內(nèi)野生種質(zhì)的豐富遺傳多樣性與其在黍稷種質(zhì)資源中的重要地位，此次野生種質(zhì)只有19份，但其有效等位基因數(shù)、香農(nóng)信息值數(shù)、Nei基因多樣性指數(shù)均遠(yuǎn)高于其他群體，充分顯示其遺傳多樣性的豐富。所以，野生種質(zhì)和南方零星種質(zhì)資源有必要在今后的種質(zhì)保存、資源管理和基礎(chǔ)研究工作中重點(diǎn)關(guān)注。

4 結(jié)論

中國(guó)黍稷種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性，普遍高于國(guó)外材料，而國(guó)內(nèi)資源又以內(nèi)蒙古高原、東北地區(qū)材料的遺傳多樣性最高，進(jìn)一步驗(yàn)證了“中國(guó)是黍稷起源中心”的論點(diǎn)。同時(shí)應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)野生材料、南方種質(zhì)的收集和國(guó)外資源的引進(jìn)，豐富現(xiàn)有資源的遺傳多樣性，并促進(jìn)黍稷遺傳改良、演化傳播等研究。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Genetic Diversity in Broomcorn Millet (Panicum miIiaceum L.) from China and Abroad by Using SSR Markers

LIAN Shuai1,2, LU Ping2, QIAO Zhi-jun3, ZHANG Qi2, ZHANG Qian2, LIU Min-xuan2, WANG Rui-yun1
(1College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;3Institute of Crop Genetic Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031)

【Objective】The objective of this study is to assess the genetic diversity of broomcorn millet accessions which collected from China and abroad.【Method】Five hundred pairs of SSR primers developed in the authors’ laboratory by high-throughput sequencing were used to identify polymorphisms in six representatives randomly selected from the total of accessions. A total of 63 primer pairs produced clear and reproducible polymorphic fragments among the six accessions and then were used to analyze the genetic diversity and relationship of 192 broomcorn millet landraces and wild accessions.【Result】A total of 161 alleles were detected with an average of 2.56 alleles per locus, and the mean Shannon-Weaver index (I), mean Nei and mean PIC were 0.6275, 0.3874 and 0.4855, respectively. The results indicated that there is a significant difference among the 10 populations of broomcorn millet resources in genetic diversity from diverse geographic origins. The variance range of effective alleles number is 1.2407 (South region) - 1.8846 (Inner Mongolia). In domestic populations, the rank of Shannon-Weaver index is Inner Mongolia Plateau＞Tohoku＞Loess Plateau＞Northwest＞southern regions, and the rank of foreign populations is the former Soviet Union＞Europe＞Mongolia＞India＞United States. The results of Nei’s genetic heterozygosity analysis showed that the minimum and maximum of observed (Ho) and expected heterozygosity (He) is 0.2372 from India and 0.3966 from Inner Mongolia as well as 0.3114 from the Unite State and 0.4622 from Inner Mongolia Plateau, respectively. The effective number of alleles (1.9285±0.5101), Shannon-Weaver index (0.6948±0.2852) and Nei gene diversity index (0.4373±0.1773) of the wild germplasm are much higher which in domestic and foreign accessions. For domestic population and alien population, the effective number of alleles (1.8145±0.4519) of domestic resources, Shannon-Weaver index (0.6657±0.2413), and Nei gene diversity index (0.412± 0.1574) of domestic accessions were higher than that in foreign resources (1.6862±0.4527, 0.5897±0.2469, 0.3652±0.1655). UPGMA cluster analysis showed that the 10 geographic populations could be clustered into three categories, the accessions from the Inner Mongolia Plateau, the Loess Plateau, northeast, northwest, Mongolia area were clustered as one group, the former Soviet Union, the United States, India, Europe together as one group, and southern region of China clustered as one independent group. The wild millet (34) which is from Qiqihaer is separated from others at 0.37, the wild millet from Gansu (19) was divided into an independent individual at 0.34, indicating that there are significant genetic variances between the two wild accessions and others. In general, genetic division of population is not significant for 192 domestic and foreign accessions, and there have material interpenetration among different groups.【Conclusion】The Inner Mongolian Plateau, northeast area and the Loess Plateau with the most abundant genetic diversity is the most complex area of genetic relationship, which further confirms that China is the origin center of Panicum miliaceum.

Panicum miliaceum L; landraces; wild species; SSR markers; genetic diversity

2016-03-31；接受日期：2016-05-20

農(nóng)業(yè)部谷子糜子產(chǎn)業(yè)體系（CARS-07-12[1].5-A1）、國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（31301386）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31271791）

聯(lián)系方式：連帥，Tel：15534988123；E-mail：lianshuaisxnd@163.com。通信作者劉敏軒，Tel：01062159962；E-mail：liuminxuan@caas.cn。通信作者王瑞云，Tel：15234420135；E-mail：wry925@126.com