利用真核微藻表達外源蛋白的現(xiàn)狀與展望

房 磊 范建華 李元廣（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

利用真核微藻表達外源蛋白的現(xiàn)狀與展望

房 磊 范建華 李元廣（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

近年來，隨著基因工程技術的迅猛發(fā)展，利用真核微藻表達外源蛋白技術得到廣泛關注。綜述了真核微藻表達外源重組蛋白的研究現(xiàn)狀，并分析了其中存在的關鍵科學問題。在此基礎上，闡述了真核微藻作為新型表達系統(tǒng)所面臨的機遇與挑戰(zhàn)，最后展望了真核微藻表達重組蛋白的發(fā)展前景。

房磊，博士研究生，研究方向為微藻基因工程。

E-mail:fangleismile@163.com

微藻生物資源具有集“碳減排、新能源、大健康、水處理”于一體的獨特優(yōu)勢，微藻這一戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)可以被培育為一個應用面廣的“大產(chǎn)業(yè)”，其發(fā)展對當前及未來經(jīng)濟和社會發(fā)展有著巨大推動作用，已成為當今世界生物技術領域的研發(fā)熱點。微藻作為一種“活細胞生物反應器”，不但可以充分吸收環(huán)境中排放的CO2，解決工廠CO2的點源排放問題，緩解溫室效應，而且通過基因工程改造可以滿足人類對水產(chǎn)養(yǎng)殖、生物柴油、醫(yī)藥蛋白1、保健品2、飼料3、功能食品4的需要。因此，微藻的基因工程研究備受科技工作者的關注。

微藻作為“天然的綠色工廠”，可以高效表達藥物蛋白、功能蛋白、食品添加劑等一系列高附加值產(chǎn)品。與細菌的表達系統(tǒng)相比，真核微藻可以完成復雜的蛋白質折疊，形成有活性的蛋白；與酵母表達系統(tǒng)相比，可以進行糖基化，滿足人們對抗原、抗體特異性需求；與轉基因植物相比，其培養(yǎng)周期短、受季節(jié)等外界環(huán)境的限制較少；與動物細胞培養(yǎng)相比，生產(chǎn)成本（蛋白質未純化）不到動物細胞培養(yǎng)的萬分之一5，并且可以實現(xiàn)微藻規(guī)?；囵B(yǎng)。此外，微藻來源的蛋白具有生物相容性，可以不進行純化，直接被動物食用，大大降低純化回收的成本。

屬于藍細菌的Synechocystis PCC 6803是研究較為透徹的原核微藻，目前在其中已經(jīng)成功實現(xiàn)Flounder growth hormone、Acyl-acyl carrier protein thioesterase、Hydrogenase等多種外源蛋白的表達。由于原核微藻除了核糖體以外不具有其他細胞器，不具備蛋白質加工修飾的功能，且藍細菌普遍生長較為緩慢，導致重組蛋白的產(chǎn)率低，因而近年來利用真核微藻表達外源蛋白技術逐漸得到關注。但目前來說，利用真核微藻生產(chǎn)外源重組蛋白技術尚未獲得重大突破，理論基礎研究和應用基礎研究亟待加大投入，以期盡快為微藻戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)的形成提供新的增長點。本文僅對利用真核微藻作為表達系統(tǒng)表達外源蛋白的現(xiàn)狀進行分析并對其發(fā)展前景進行展望。

1 真核微藻表達外源蛋白的國內(nèi)外研究進展

萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是真核微藻中研究最為成熟的表達系統(tǒng)。目前，已在微藻中表達了34種不同的外源蛋白，僅萊茵衣藻中就有29種6。為滿足全球每年1400億元藥物蛋白的市場需求7，迄今已成功在C.reinhardtii中表達多種外源蛋白如：The fourteenth human fibronectin type III domain（14 FN3）8、The tenth human fibronectin type III domain（10 FN3）8、Immunoglobulin G（IgG）9～11等抗體藥物；E7 protein of the Human Papilloma virus type 16 （16 E7）12、Immunotoxins13、Pfs48/4514等疫苗；Erythropoietin15、Bovine milk amyloid A（MAA）16、 Proinsulin8等功能藥物； Human tumor necrosis factor related apoptosisinducing ligand（hTRAIL）17、Allophycocyanin18等抗腫瘤藥物。此外，萊茵衣藻也可以高效表達Xylanase19等食品添加劑。但現(xiàn)有文獻報道中C.reinhardtii存在生長速率慢、細胞密度低、規(guī)模化培養(yǎng)技術不成熟、外源蛋白表達含量低等問題，限制了其產(chǎn)業(yè)化進程。

小球藻具有生長周期短、細胞密度高、營養(yǎng)價值高等優(yōu)勢，因此繼C.reinhardtii后，也成為基因工程的主要研究對象。目前成功在橢圓小球藻（Chlorella ellipoidea）中實現(xiàn)了α-defensin20、Flounder growth hormone21的高效表達，在普通小球藻（Chlorella vulgaris）中實現(xiàn)了Lactoferrin22的高效表達。Fan等23首次完成了國際上首個可食用且可規(guī)?；囵B(yǎng)的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的全基因組測序并成功實現(xiàn)了外源基因的轉化。筆者所在團隊在國際上首創(chuàng)了微藻培養(yǎng)領域的一項嶄新的平臺技術——異養(yǎng)-稀釋-光誘導串聯(lián)培養(yǎng)（SHDP）技術24，已經(jīng)成功實現(xiàn)了小球藻高密度高品質培養(yǎng)，其異養(yǎng)培養(yǎng)的平均生長速率不低于3g/（L·h），最高藻細胞密度可高達150g/L，已用于小球藻粉的工業(yè)化生產(chǎn)，這一技術的產(chǎn)業(yè)化為小球藻作為外源蛋白表達平臺的研發(fā)奠定了重要基礎。

此外，在三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）11、杜氏鹽藻（Dunaliella salina）25等真核微藻中也實現(xiàn)了外源蛋白的表達（表1）。

2 真核微藻基因工程技術存在的關鍵科學問題分析

微藻作為“資源節(jié)約型、環(huán)境友好型”的可再生生物資源，符合全球倡導的“低碳經(jīng)濟、可持續(xù)發(fā)展”的戰(zhàn)略，以其作為生物反應器表達外源蛋白具有潛在的商業(yè)價值。但是現(xiàn)有技術下的蛋白表達效率較低，導致其生產(chǎn)成本高，距實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)還有距離。分析其原因主要有以下幾點。

①在表達場所方面，葉綠體轉化系統(tǒng)的表達效率高于核基因組，但是實現(xiàn)葉綠體轉化的微藻相對較少，目前主要有C.reinhardtii6、 D.salina22等微藻，但其培養(yǎng)周期長、細胞密度低，不利于外源蛋白的產(chǎn)業(yè)化研究。而生長速度快且營養(yǎng)價值高的微藻（如小球藻）的培養(yǎng)周期短、細胞密度高、培養(yǎng)工藝成熟，但尚未建立一套完善的小球藻葉綠體轉化系統(tǒng)。

②在整合位點方面，微藻細胞中尚未發(fā)現(xiàn)適合外源基因的整合熱點。微藻的基因工程研究遠遠落后于動物細胞，微藻的遺傳背景尚未研究透徹，外源基因大多以隨機插入或者某一位點的同源重組整合到基因組中，外源蛋白的表達可能會影響到自身蛋白的功能發(fā)揮，導致代謝發(fā)生紊亂。這些因素導致外源基因在轉基因微藻中表達的精確調(diào)控與預期的目標間仍有差距。為此，尚需對微藻的基因組和比較基因組進行系統(tǒng)研究，分析并找到適合引入外源基因的整合熱點。

注：“—”表示引用文章報道能夠檢測出相應物質，但是檢測量低，沒有報道具體數(shù)值。

③在提高外源基因表達效率方面，微藻轉入外源基因后，容易出現(xiàn)表達效率低、基因沉默、微藻的生長速率受到限制等一系列問題。為此需要找到一種使外源基因高效表達的方法。研究表明通過啟動子35、終止子36的優(yōu)化，利用2A肽耦聯(lián)技術19，質粒線性化37，葉綠體轉化38，增強子、操縱子39、內(nèi)含子40以及3’端非轉錄區(qū)41的使用，密碼子優(yōu)化42，Kozak序列的引入43，信號肽的使用44，利用核基質結合區(qū)（MARs）45，使用轉錄因子-UAS表達系統(tǒng)46，增加基因的拷貝數(shù)47等一系列措施均可以增加轉錄、翻譯效率，進一步提高外源基因的表達效率。因此，需要了解和掌握基因的表達機制，從而探索高效、大量表達外源基因的方法。

綜上所述，現(xiàn)階段利用微藻作為表達系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白技術的關鍵突破，需要集中在轉基因的精確表達、高效調(diào)控上48。

3 利用真核微藻生產(chǎn)外源蛋白面臨的機遇與挑戰(zhàn)

3.1 真核微藻生產(chǎn)外源蛋白所面臨的機遇

當前，微藻生物技術已步入快速發(fā)展階段，除了把微藻開發(fā)成傳統(tǒng)意義上的新食品原料、功能食品等大健康產(chǎn)品外，隨著新能源、碳減排和環(huán)保等方面的迫切需要，微藻在生物能源、生物固碳、富含氮磷廢水處理、動物飼料及食品等行業(yè)具有十分廣闊的應用前景。在C.reinhardtii中已經(jīng)證實微藻是一個良好的“活細胞生物反應器”，可以表達多種外源高附加值產(chǎn)品，微藻的轉基因研究面臨著新的機遇。

首先，真核微藻滿足“綠色經(jīng)濟、可持續(xù)發(fā)展”的戰(zhàn)略需求?！澳茉次C、全球氣候變暖”等問題亟待解決，微藻生物技術的產(chǎn)業(yè)化受到政府、企業(yè)的大力支持及科研工作者的青睞。國家投入充足的科研經(jīng)費用于微藻生物技術的相關研究，必將大力推動微藻遺傳背景的認識以及基因工程領域的技術突破，這為微藻作為生物反應器表達外源蛋白技術的發(fā)展提供了良好的機遇。

其次，真核微藻具備表達高附加值產(chǎn)品的優(yōu)勢。微藻具有葉綠體、線粒體、內(nèi)質網(wǎng)、高爾基體等多種細胞器，可以完成復雜的蛋白質折疊與修飾，是外源蛋白表達系統(tǒng)的不二之選。美國食品與藥品管理局（FDA）將微藻列為安全食品49 50，因此利用微藻表達的外源蛋白可省去提取、純化費用，大大提高了藻源蛋白的競爭優(yōu)勢。

3.2 真核微藻生產(chǎn)外源蛋白所面臨的挑戰(zhàn)

微藻轉基因及其產(chǎn)業(yè)化研究具有廣闊的市場前景，但是實現(xiàn)這一目標的道路是曲折的。目前微藻表達高附加值產(chǎn)品的含量都相對較低，導致生產(chǎn)成本居高不下，限制了其產(chǎn)業(yè)化進程。此外，轉基因產(chǎn)品安全問題備受爭議，因此利用轉基因微藻表達外源蛋白要經(jīng)過各種驗證安全后才能使用。如藻源蛋白易于糖基化，使其表達的外源蛋白具有免疫原型51，作為疫苗等藥物靜脈注射到人體后可能會產(chǎn)生免疫排斥，因此，藻源的外源蛋白需要經(jīng)過繁瑣的動物實驗和多期臨床試驗，這無形中增加其產(chǎn)業(yè)化的成本。另外，微藻轉基因技術尚未成熟，微藻生產(chǎn)重組蛋白在衣藻、三角褐指藻、集胞藻6803等模式微藻中已經(jīng)取得突破，但藻細胞生長速率較低、藻細胞營養(yǎng)成分少，應用價值低；而在生長快營養(yǎng)價值高的小球藻等微藻中，已成功實現(xiàn)核基因組轉化（集中在電擊轉化、農(nóng)桿菌介導、原生質體轉化等方面），但穩(wěn)定性、表達效率亟待提高，并且更加高效的葉綠體轉化、同源重組、RNAi、CRISPR/Cas9體系等技術均尚未突破，需要投入更大精力開展系統(tǒng)的研究。

4 真核微藻表達重組蛋白的發(fā)展前景

隨著微藻生物技術的進步，真核微藻表達外源蛋白的研究將會不僅僅限于C.reinhardtii、P.tricornutum、 C.ellipsoidea、C.vulgaris、C.pyrenoidosa、D.salina等幾種微藻，將會有更多的微藻應用于基因工程研究，特別是那些具有商業(yè)價值的微藻。在洞悉微藻的理化性質和遺傳背景的前提下，建立微藻的轉錄組和代謝組學，實現(xiàn)人們的預期目標與微藻基因表達的精確調(diào)控相統(tǒng)一的目標，使代謝流集中在目標蛋白的生產(chǎn)上，避免造成能源浪費，走“最少的投入、最大的產(chǎn)出”綠色經(jīng)濟路線，是微藻基因工程研究的下一步目標。

基因工程技術日新月異，借助真核微藻這一“活細胞生物反應器”表達外源蛋白、食品添加劑及工業(yè)原料，將會降低醫(yī)藥及功能食品的成本，解決醫(yī)藥蛋白和功能食品價格昂貴的問題。這預示未來的轉基因研究將聚焦以微藻作為生物反應器的研究，可滿足人們對高附加值產(chǎn)品的需求，具有廣闊的應用前景。

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