灰樹(shù)花胞外多糖的分離純化及免疫調(diào)節(jié)作用

韓麗榮，程 代，孟 夢(mèng)，王莉蕊，王春玲

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

灰樹(shù)花胞外多糖的分離純化及免疫調(diào)節(jié)作用

韓麗榮，程 代，孟 夢(mèng)，王莉蕊，王春玲

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

通過(guò)對(duì)灰樹(shù)花（Grifola frondosa）深層發(fā)酵的胞外多糖（EXGFP）進(jìn)行分離純化，研究其性質(zhì)和免疫活性.灰樹(shù)花胞外粗多糖經(jīng)醇沉、酶-sevag脫蛋白和Sephadex G-100色譜柱分離得到純化組分EXGFP-A.通過(guò)Sepharose 4B凝膠柱法和HPLC法鑒定EXGFP-A的純度，結(jié)果表明EXGFP-A是均一多糖組分，純度為92.68%，.理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EXGFP-A是一種非淀粉類(lèi)、不含糖醛酸及多酚類(lèi)物質(zhì)，含有α -D-葡萄糖苷鍵和吡喃糖環(huán)的中性多糖.MTT實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng) EXGFP-A質(zhì)量濃度為 80，μg/mL、作用 48，h時(shí)，小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7細(xì)胞增殖指數(shù)達(dá)到最大值，為137.5%，.吞噬活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)EXGFP-A能夠提高RAW264.7細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬能力，掃描電子顯微鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAW264.7細(xì)胞經(jīng)過(guò)EXGFP-A處理后，細(xì)胞表現(xiàn)出了明顯的活化特征.

灰樹(shù)花；胞外多糖；分離純化；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7；免疫活性

灰樹(shù)花（Grifola frondosa）是一種珍貴的藥食兩用型真菌［1］，具有多種生物活性，如抗病毒［2］、免疫調(diào)節(jié)［3］、抗輻射［4］、抗腫瘤［5］、抗氧化［6］、調(diào)節(jié)血糖［7］及降血脂作用，從而具有良好的應(yīng)用前景.已有研究證實(shí)了灰樹(shù)花多糖的抗腫瘤活性［8］，因此，對(duì)于其結(jié)構(gòu)分析以及其他活性的研究成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn).隨著對(duì)灰樹(shù)花深入的研究，其化學(xué)成分也逐漸被分離出來(lái)，主要有多糖、蛋白質(zhì)、肽類(lèi)和脂類(lèi)等，其中主要的活性成分為灰樹(shù)花多糖［9］.

近年來(lái)，灰樹(shù)花作為一種珍貴真菌被開(kāi)發(fā)研究，大量的研究已經(jīng)證實(shí)了其具有多種生物活性.國(guó)內(nèi)外對(duì)于灰樹(shù)花的研究主要集中在灰樹(shù)花子實(shí)體多糖的功能學(xué)評(píng)價(jià)［10］.楊陽(yáng)等［11］通過(guò)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了灰樹(shù)花多糖組分的免疫活性.王寶琴等［12］研究結(jié)果證明，高純度堿提灰樹(shù)花 β-葡聚糖能顯著提高小鼠的細(xì)胞吞噬功能及特異性免疫和非特異性免疫功能.但有關(guān)灰樹(shù)花的發(fā)酵培養(yǎng)、多糖結(jié)構(gòu)和體外免疫活性的研究相對(duì)較少.

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)灰樹(shù)花進(jìn)行深層發(fā)酵培養(yǎng)，所得發(fā)酵液經(jīng)提取得到灰樹(shù)花胞外粗多糖，分離純化后得到均一的多糖組分，采用紅外光譜分析等方法對(duì)其進(jìn)行基本的結(jié)構(gòu)分析，利用 MTT實(shí)驗(yàn)、中性紅實(shí)驗(yàn)以及掃描電鏡對(duì)其進(jìn)行體外免疫活性的研究.以上研究將會(huì)為灰樹(shù)花胞外多糖的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

灰樹(shù)花（Grifola frondosa）由天津科技大學(xué)菌種保藏中心提供，編號(hào)為39025.

RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所.

1.2灰樹(shù)花胞外多糖的提取及分離純化

對(duì)灰樹(shù)花進(jìn)行深層發(fā)酵培養(yǎng)，所得發(fā)酵液通過(guò)醇沉法得到胞外粗多糖（EXGFP）.經(jīng)過(guò)除蛋白、脫色、超濾分級(jí)和 Sephadex G-100色譜柱（26，mm× 800，mm）分離，最終得到灰樹(shù)花胞外多糖 EXGFPA.具體操作如下：

醇沉法：將灰樹(shù)花發(fā)酵液減壓濃縮后，加入 95%，的乙醇，使乙醇終體積分?jǐn)?shù)為 75%，，4，℃過(guò)夜提取后，離心收集沉淀，經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚等依次洗滌，冷凍干燥得到灰樹(shù)花胞外粗多糖.

除蛋白：采用酶-sevag法，向5%，的EXGFP溶液中添加3%，的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為6～7，60，℃酶解2，h后，加入sevag溶液，混勻后靜置，取上層的多糖溶液層.向上層溶液中重復(fù)添加 sevag溶液，直至將蛋白完全除去.

脫色、超濾分級(jí)及分離：選擇 AB-8大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色，將得到的多糖溶液以體積分?jǐn)?shù) 5%，緩慢沿壁加入裝好的柱子中，并保持適當(dāng)?shù)牧髁?，直到流出的溶液為無(wú)色溶液為止.將脫色處理后的多糖溶液經(jīng)過(guò)0.45，μm的濾膜進(jìn)行預(yù)處理后超濾分離.冷凍干燥后，采用 Sephadex G-100色譜柱（26，mm× 800，mm）分離，最終得到灰樹(shù)花胞外多糖EXGFP-A.

1.3EXGFP-A純度鑒定

采用 Sepharose 4B凝膠柱法和 HPLC法，對(duì)EXGFP-A進(jìn)行純度鑒定.將5，mg/mL的EXGFP-A溶液上樣至 Sephadex G-75的色譜柱（16，mm× 600，mm）中，洗脫液為三蒸水，流量為0.2，mL/min，每10，min收集1管.采用苯酚-硫酸法測(cè)定各管多糖含量，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制EXGFP-A的洗脫曲線.

采用 0.22，μm 的微孔濾膜對(duì) 10，mg/mL的EXGFP-A 溶液進(jìn)行過(guò)濾后，備用.液相色譜條件：島津 CT0-20A高效液相色譜儀，Shodex OHPak SB-804HQ（8.0，mm×300，mm）凝膠色譜柱；流動(dòng)相為超純水，流量為 0.8，mL/min；示差檢測(cè)器檢測(cè)，色譜柱和檢測(cè)器溫度為 30，℃.相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為Dextran系列，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-0.039，89x3+ 1.174x2-12.06x+47.704，R2=0.999.

1.4EXGFP-A理化性質(zhì)測(cè)定

1.4.1顯色實(shí)驗(yàn)

淀粉檢測(cè)：將EXGFP-A精確配制成1%，的多糖溶液，取1，mL加入2%，的碘-碘化鉀溶液3，mL，混勻后靜置，觀察有無(wú)顏色變化.

多酚類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)：將 EXGFP-A精確配制成5，mg/mL 的多糖溶液，加入 1%，的 FeCl3溶液 1～2滴，搖勻后靜置，觀察有無(wú)顏色變化.

糖醛酸檢測(cè)：將 EXGFP-A 精確配制成0.1，mg/mL 的多糖溶液，取 1，mL加入 6，mL濃H2SO4溶液，85，℃水浴 20，min，室溫靜置，加入0.15%，的咔唑乙醇溶液200，μL，85，℃水浴20，min，室溫靜置，觀察有無(wú)紫紅色絡(luò)合物產(chǎn)生.

1.4.2EXGFP-A的紫外掃描

將 EXGFP-A準(zhǔn)確配制成 1，mg/mL 的多糖溶液，以蒸餾水為空白參照，分別進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，掃描范圍是190～400，nm.

1.4.3EXGFP-A的紅外光譜

1，mg EXGFP-A樣品以KBr壓片，在室溫條件下測(cè)定多糖樣品的紅外光譜［13］.

1.5EXGFP-A免疫活性實(shí)驗(yàn)

1.5.1EXGFP-A對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

采用MTT法［14］測(cè)定EXGFP-A作用RAW264.7細(xì)胞一定時(shí)間后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定 570，nm處各孔的吸光度.細(xì)胞增殖率=A加藥/A對(duì)照×100%，.

1.5.2EXGFP-A對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

本實(shí)驗(yàn)采用中性紅吞噬法測(cè)定 EXGFP-A處理RAW264.7細(xì)胞一定時(shí)間后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定540，nm處的吸光度.

1.5.3EXGFP-A對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為5×104，mL-1，以每孔2，mL加入放有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37，℃、5%， CO2培養(yǎng)4～6，h使細(xì)胞充分貼壁.棄去培養(yǎng)液，加入質(zhì)量濃度分別為0、40、80、160，μg/mL的EXGFP-A，37，℃、5%， CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48，h.

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用 PBS緩沖液洗去殘留培養(yǎng)液，然后以 2.5%，戊二醛溶液固定細(xì)胞 2，h，以不同體積分?jǐn)?shù)（10%，、30%，、50%，、70%，、90%，、100%，）的乙醇依次對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脫水處理，取出蓋玻片，剪成適量大小粘于樣品臺(tái)，待噴金后進(jìn)行電鏡掃描，觀察經(jīng)EXGFP-A作用前后RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)變化.

2　結(jié)果與討論

2.1灰樹(shù)花多糖的分離純化

經(jīng)減壓濃縮、乙醇醇沉、脫脂、酶-sevag法除蛋白、AB-8大孔吸附樹(shù)脂脫色、超濾除雜、Sephadex G-100色譜柱分離以及冷凍干燥，最終得到灰樹(shù)花多糖EXGFP-A，得率為2.84，g/L.

2.2EXGFP-A的純度鑒定

EXGFP-A的純度鑒定結(jié)果如圖1所示.

圖1　EXGFP-A葡聚糖凝膠 G-75洗脫曲線和高效液相色譜圖Fig.1 Sephadex G-75 flew curve and HPLC of EXGFP-A

從Sephadex G-75洗脫曲線可以看出，EXGFP-A的洗脫峰為單一對(duì)稱(chēng)峰型，說(shuō)明EXGFP-A是宏觀均一的多糖組分.高效液相色譜圖中出現(xiàn)較單一對(duì)稱(chēng)主峰，表明該組分是均一多糖，經(jīng)測(cè)定純度為92.68%，，相對(duì)分子質(zhì)量為1.355×106.

2.3EXGFP-A的理化性質(zhì)測(cè)定

EXGFP-A顯色實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1.EXGFP-A為白色粉末狀，溶于水但不溶于有機(jī)試劑，是一種非淀粉類(lèi)、不含多酚類(lèi)物質(zhì)及糖醛酸的中性多糖.

表1　EXGFP-A顯色實(shí)驗(yàn)Tab.1 Color experiments of EXGFP-A

紫外全波長(zhǎng)掃描顯示（圖 2），EXGFP-A在260，nm和 280，nm處無(wú)明顯吸收峰，說(shuō)明 EXGFP-A組分中基本不含核酸以及蛋白質(zhì)，而在 196，nm處有多糖的特征吸收峰，說(shuō)明 EXGFP-A組分是多糖類(lèi)物質(zhì).

圖2　EXGFP-A紫外掃描圖譜Fig.2 UV scanning of EXGFP-A

EXGFP-A的紅外光譜分析結(jié)果如圖3所示.在3，600～3，200，cm-1處是 O—H伸縮振動(dòng)；2，934，cm-1為C—H伸縮振動(dòng)；1，652，cm-1、1，400～1，200，cm-1是C—H的變角振動(dòng)，以上特征吸收峰證明 EXGFP-A是糖類(lèi)物質(zhì).在 1，700～1，775，cm-1處無(wú)明顯吸收峰，表明樣品中不含羧基，即 EXGFP-A是中性多糖. 1，870～1，540，cm-1處是 C=O伸縮振動(dòng).1，069，cm-1處的吸收峰表明EXGFP-A中存在3-6-內(nèi)醚橋，即樣品中含有3-6-內(nèi)醚-半乳糖，而852，cm-1處的吸收峰表明 EXGFP-A的單糖組成為α -D-葡萄吡喃糖，即EXGFP-A屬于吡喃型多糖.此外，807，cm-1處的特征峰則說(shuō)明在多糖分子中存在甘露糖苷鍵，619，cm-1處的吸收峰表明多糖中含有葡萄糖殘基.

圖3　EXGFP-A紅外分析圖譜Fig.3 FT-IR spectroscopic analysis of EXGFP-A

2.4EXGFP-A的免疫活性研究

2.4.1EXGFP-A對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

巨噬細(xì)胞作為一種重要的免疫細(xì)胞廣泛分布于機(jī)體中，通過(guò)呈遞抗原、吞噬侵入體內(nèi)的有害物質(zhì)、分泌細(xì)胞因子等途徑發(fā)揮防御和調(diào)節(jié)功能，參與機(jī)體的特異性、非特異性免疫反應(yīng)［15］，在宿主防御方面扮演著重要作用.當(dāng)處于休眠狀態(tài)的巨噬細(xì)胞受到一些免疫增強(qiáng)劑激活后，會(huì)表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺菌、增殖、吞噬及胞飲能力［16］.

本實(shí)驗(yàn)采用噻唑藍(lán)比色法，即 MTT法測(cè)定EXGFP-A對(duì) RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響，以脂多糖（LPS）處理組作為陽(yáng)性對(duì)照，*和**分別表示與空白組相比P＜0.05和P＜0.01，結(jié)果如圖4所示.

圖4　EXGFP-A作用質(zhì)量濃度和作用時(shí)間對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響Fig.4 Effects of EXGFP-A concentration and culturing time on cell proliferation of RAW264.7 cells

不同質(zhì)量濃度的EXGFP-A與細(xì)胞共同培養(yǎng)后，細(xì)胞的增殖能力均有所增加.在共同培養(yǎng) 48，h后，EXGFP-A作用質(zhì)量濃度為80，μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞的增殖指數(shù)最大，為 137.5%，.當(dāng)以 80，μg/mL EXGFP-A在不同培養(yǎng)時(shí)間作用于 RAW264.7細(xì)胞后，結(jié)果如圖4（b）所示.當(dāng)EXGFP-A作用時(shí)間達(dá)到48，h時(shí)，增殖效果達(dá)到最大.

以上結(jié)果表明，EXGFP-A能夠增強(qiáng) RAW264.7細(xì)胞的增殖活性.EXGFP-A作用于RAW264.7細(xì)胞的最佳質(zhì)量濃度為80，μg/mL，最佳作用時(shí)間為48，h.

2.4.2EXGFP-A對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

吞噬作用是巨噬細(xì)胞對(duì)入侵病原微生物的直接反應(yīng)，是免疫系統(tǒng)維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要手段，是非特異性免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)和免疫功能活化的指標(biāo).

通過(guò)中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)測(cè)定 EXGFP-A作用后RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力，以脂多糖（LPS）處理組作為陽(yáng)性對(duì)照，*和**分別表示與空白組相比 P＜0.05和P＜0.01，結(jié)果如圖5所示.當(dāng)EXGFP-A作用質(zhì)量濃度為 80，μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞吞噬活性最高.中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)初步說(shuō)明EXGFP-A能夠刺激RAW264.7細(xì)胞使其處于活化狀態(tài)，能通過(guò)提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力來(lái)發(fā)揮多糖的免疫活性，執(zhí)行各種免疫防御功能.

圖5　EXGFP-A作用質(zhì)量濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.5　Effects of EXGFP-A concentration on the pinocytic activity of RAW264.7 cells

2.4.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

RAW264.7細(xì)胞經(jīng)EXGFP-A處理后，利用掃描電子顯微鏡觀察 EXGFP-A作用前后所引起的細(xì)胞外觀形態(tài)變化，結(jié)果如圖 6所示.當(dāng)用 80，μg/mL EXGFP-A分別作用于細(xì)胞24，h、48，h和72，h后，與對(duì)照組細(xì)胞相比，經(jīng)藥物作用后的細(xì)胞體積明顯增大，表面凸起明顯，貼壁面積明顯增大，褶皺增加，并有部分偽足出現(xiàn).以上結(jié)果表明，當(dāng)用 80，μg/mLEXGFP-A作用于細(xì)胞 48，h時(shí)，細(xì)胞活化特征最為明顯.

圖6　EXGFP-A作用RAW264.7細(xì)胞的掃描電鏡圖Fig.6 SEM images of RAW264.7 cells treated with EXGFP-A

3　結(jié) 論

灰樹(shù)花胞外多糖 EXGFP-A是一種主要含有葡萄糖的吡喃型中性多糖，并對(duì) RAW264.7的細(xì)胞增殖和吞噬活性具有明顯的促進(jìn)作用.EXGFP-A能夠促進(jìn)細(xì)胞的形態(tài)變化，使細(xì)胞呈現(xiàn)出激活狀態(tài)，說(shuō)明EXGFP-A可以激活RAW264.7細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫活性，證實(shí)了灰樹(shù)花胞外多糖EXGFP-A具有體外免疫活性.但是，多糖所引起的免疫效應(yīng)可歸因于細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相互作用，因此，可從分子、受體水平通過(guò)免疫印跡等方法深入研究多糖激活細(xì)胞的作用機(jī)制，為灰樹(shù)花胞外多糖的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù).

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責(zé)任編輯：郎婧

The Isolation，Purification and Immunomodulatory Activity of Extracellular Polysaccharide from Grifola frondosa

HAN Lirong，CHENG Dai，MENG Meng，WANG Lirui，WANG Chunling
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

An extracellular polysaccharide（EXGFP）was obtained by submerged culture of Grifola frondosa，and its property and immunomodulatory activity were investigated.The final purified fraction，EXGFP-A，was obtained by using alcohol for precipitation，enzymes-sevag for deproteinization and Sephadex G-100，gel column for further isolation and purification.The purity of EXGFP-A was tested with Sepharose 4B gel column and HPLC.The results show that EXGFP-A is a homogeneous polysaccharide，and its purity is about 92.68%，.Tests of its physicochemical properties indicate that EXGFP-A is a non-starch neutral polysaccharide，excludes uronic acid and polyphenols，and contains α-D-glucoside bond and pyranose ring.The result of MTT assay shows that the cell proliferation index reached a maximum of 137.5%， when EXGFP-A was at a concentration of 80，μg/mL and the treatment time was 48，h.The neutral red phagocytosis experiment indicates that the phagocytic activity of RAW264.7，cells was significantly enhanced by EXGFP-A.According to scanning electron microscope，the activation of RAW264.7，cells could also be promoted by adding EXGFP-A.

Grifola frondosa；extracellular polysaccharide；purification；mouse macrophage RAW264.7；immunomodulatory activity

R979.5

A

1672-6510（2016）04-0025-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150117

2015-09-08；

2015-12-03

國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012BAD33B04）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（13JCZDJC29800）

韓麗榮（1990—），女，內(nèi)蒙古人，碩士研究生；通信作者：王春玲，教授，wangchunling@tust.edu.cn.