PKCα 抑制劑Calphostin C抑制TNF-α 誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移

宋鐵峰，王 楠，王會(huì)琴，袁 穎，黃麗文，莊春雨，張同存

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

PKCα 抑制劑Calphostin C抑制TNF-α 誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移

宋鐵峰，王 楠，王會(huì)琴，袁 穎，黃麗文，莊春雨，張同存

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α ）可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的遷移，但其促進(jìn)遷移機(jī)制尚不清楚.研究使用Calphostin C抑制劑來抑制PKCα 的活性，從而研究TNF-α 誘導(dǎo)MSCs遷移的作用是否通過激活PKCα 來完成.利用50，ng/mL的TNF-α 處理MSCs，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明TNF-α 可以誘導(dǎo)MSCs的遷移.加入PKCα 的抑制劑Calphostin C后，可以抑制TNF-α 對(duì)MSCs遷移或侵襲的誘導(dǎo)，并降低遷移標(biāo)志基因MYL9（Myosin light chain 9，MYL9）、CYR61（Cysteine rich 61，CYR61）的表達(dá).以上結(jié)果表明，PKCα抑制劑Calphostin C可以抑制TNF-α 誘導(dǎo)的MSCs遷移.

MSCs；遷移；TNF-α；PKCα

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化能力的干細(xì)胞［1-3］.間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有多向分化潛能，還能靶向遷移到損傷部位、慢性炎癥部位及腫瘤部位，對(duì)于這些部位起到一定程度的修復(fù)作用［4］.對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞遷移機(jī)制的研究，有助于理解間充質(zhì)干細(xì)胞“歸巢”的分子機(jī)制，為自體修復(fù)和細(xì)胞治療提供理論依據(jù).間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)歸巢和體外遷移也像細(xì)胞的其他生理活動(dòng)一樣由不同因素誘導(dǎo)引發(fā)涉及不同的信號(hào)通路［5-7］.雖然多種誘導(dǎo)因子和信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)參與間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移過程，但是其具體的遷移機(jī)制依然不明確.

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），能引起腫瘤出現(xiàn)壞死，而對(duì)正常組織細(xì)胞無毒性，故稱之為腫瘤壞死因子.腫瘤壞死因子有 3種亞型：TNF-α、TNF-β和 TNF-γ.TNF-α主要由單核細(xì)胞分泌，但在其他細(xì)胞中也有分泌，包括間充質(zhì)干細(xì)胞［8-9］.作為炎癥因子，TNF-α可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移，TNF-α 在MSCs遷移和黏附中均占有重要的作用.

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是1977年在鼠腦的胞質(zhì)成分中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白激酶，屬于多功能絲氨酸和蘇氨酸激酶，是 G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的效應(yīng)物.絲氨酸/蘇氨酸激酶，PKC家族有3個(gè)亞家族：經(jīng)典型 PKCS（α、β和 γ同種型）、新型PKCS（δ、θ、η、ε同種型）以及非典型PKCS（ζ和ι亞型）［10-11］.當(dāng)被激活時(shí)，PKC磷酸化并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，可調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［12］，參與多種細(xì)胞遷移和侵襲過程.有文獻(xiàn)［13］報(bào)道，在肝癌細(xì)胞中 PKCα的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移和侵襲.有研究［14］顯示，TNF-α 通過PKC信號(hào)通路誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞遷移.

研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可促進(jìn)MSCs遷移，但TNF-α影響MSCs遷移的機(jī)制目前仍不清楚.因此，在本研究中，首先用TNF-α誘導(dǎo)MSCs遷移，再采用PKCα的特異性抑制劑Calphostin C，進(jìn)一步研究PKCα 在TNF-α 促進(jìn)MSCs遷移這一過程中的作用.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD（sprague dawley，SD）大鼠，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK-（軍）2012-0004，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn).

1.1.2主要試劑

DMEM/LG培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；重組大鼠TNF-α，Peprotech公司；Calphostin C、MYL9抗體、CYR61抗體、β-actin抗體，Santa Cruz公司；DAPI、dNTP，北京索萊寶科技有限公司；IRDye?800，CW山羊抗鼠抗體、IRDye?680 山羊抗兔抗體，LI-COR公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Trizol裂解液，上海英俊生物技術(shù)有限公司；隨機(jī)引物 B0043，上海生工生物工程有限公司；Bestar?SybGreen qPCR Mastermix，DBI?Bioscience公司.

1.2方法

1.2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及體外擴(kuò)增培養(yǎng)

SD大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的提取采用全骨髓貼壁法.選健康80～90，g的 SD大鼠，雄性，頸椎脫臼法處死.剪刀剪去皮毛，無菌條件下取股骨和脛骨，剔除骨表面肌肉.吸取含15%，胎牛血清的DMEM/LG放入已滅菌玻璃離心管中.剪開股骨、脛骨關(guān)節(jié)兩端，用 5，mL一次性注射器吸取培養(yǎng)基沖洗骨髓腔.將帶有骨髓懸浮物的培養(yǎng)液用移液器吹散后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，置于37，℃、5%， CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng).本研究所用的是第 3～7代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞.

1.2.2細(xì)胞加藥處理

將MSCs以1×105，mL-1的密度接種于6孔板，分為4組：對(duì)照組，2%，血清DMEM/LG處理細(xì)胞；TNF-α 組，加 TNF-α（終質(zhì)量濃度 50，ng/mL）于 2%，血清的 DMEM/LG中，處理細(xì)胞 24，h；Calphostin C組，用含Calphostin C（終濃度0.1，μmol/L）的2%，血清的DMEM/LG處理細(xì)胞24，h；Calphostin C+TNF-α組，先用含Calphostin C（終濃度0.1，μmol/L）的2%，血清的DMEM/LG處理細(xì)胞1，h，再加入終質(zhì)量濃度為50，ng/mL的 TNF-α處理細(xì)胞 24，h.加藥處理 24，h后，收集上述細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將MSCs以1×105，mL-1的密度接種于6孔板，12～16，h后用 10，μL槍頭在細(xì)胞間按“十”字型劃出痕跡，同時(shí)加藥處理，24，h后在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，觀察細(xì)胞的彌合修復(fù)能力.

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)

在 24孔板中加入 500，μL 10%，血清 DMEM/ LG（含所加的藥 TNF-α），然后在小孔內(nèi)放入小室，使小室下膜與培養(yǎng)基完全契合.在小室的上室中加入 5×104個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng).16，h后將Transwell的小室取出，用棉簽輕輕擦去上室的細(xì)胞，PBS洗2次，每次5，min.4%，多聚甲醛室溫固定下室細(xì)胞20，min，PBS洗2次，每次5，min.無水甲醇浸泡下室膜20，min，PBS洗2次，每次5，min.用DAPI染細(xì)胞核，室溫放置 15，min，PBS洗 2次，每次5，min.共聚焦顯微鏡下照相.

1.2.5RNA的提取

用 0.5，mL Trizol裂解液在冰上裂解細(xì)胞15，min，重復(fù)吹懸使細(xì)胞充分裂解，加入0.1，mL的氯仿，劇烈振蕩 15，s，靜置 5，min，4，℃、12，000，r/min離心 10，min.取上層水相到另一 EP管中，加入等體積的異丙醇，混勻，-20，℃放置 30，min.12，000，r/min離心 10，min，棄掉上清液，加入 75%，乙醇 1，mL，洗滌RNA，離心棄掉上清液，室溫晾干 RNA.加入 20，μL DEPC水溶解RNA，放于-80，℃保存.

1.2.6RNA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Real-time PCR）

將提取的RNA用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄.RNA 2，μg、隨機(jī)引物（B0043）5，μL，70，℃水浴5，min；迅速冰??；10，mol/L dNTPs 5，μL、5×buffer 5，μL、RNAse inhibitor 0.625，μL、M-MLVRT 1，μL混勻，37，℃反應(yīng)1，h；70，℃保持10，min終止反應(yīng).

用Bestar?SybGreen qPCR Mastermix進(jìn)行Realtime PCR.擴(kuò)增程序：95，℃ 2，min；95，℃ 10，s，60，℃30，s，72，℃ 30，s，40個(gè)循環(huán).融解曲線：95，℃ 1，min，55，℃ 1，min，95，℃ 10，s.目的基因引物：GAPDH上游5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，GAPDH下游5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′；CYR61上游5′-GAAGAAATACCGGCCCAAAT-3′，CYR61下游5′-CAGACTGTAGAGGCGAAACGAC-3′；MYL9上游5′-ATGAGGAGGTGGACGAGATGT-3′，MYL9下游5′-CGTGCTTGAGGATGCGAG-3′.

1.2.7免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）

收集各組細(xì)胞，PBS洗1次，SDS細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞，100，℃變性10，min，12%， SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至 NC膜.5%，的脫脂奶粉室溫封閉1，h后，分別用β-actin抗體（1∶500）、CYR61抗體（1∶500）、MYL9抗體（1∶500）4，℃孵育過夜，PBS洗3次，每次10，min；IRDye?800，CW 山羊抗鼠抗體（1∶5，000）、IRDye?680 山羊抗兔抗體（1∶5，000）室溫孵育 2，h后，PBS洗 3次，每次 10，min，Odyssey成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜成像.

1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.用t檢驗(yàn)顯著性，*表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異（P＜0.05）.

2　結(jié)果與分析

2.1劃痕檢測(cè)加入 Calphostin C后對(duì) TNF-α 誘導(dǎo)MSCs遷移作用的影響

利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果如圖 1所示.加入TNF-α 的MSCs細(xì)胞的愈合程度大于沒有處理的MSCs細(xì)胞的愈合程度，證明 TNF-α 可以促進(jìn)MSCs細(xì)胞的遷移.而加入Calphostin C+TNF-α 組的 MSCs細(xì)胞愈合程度小于加入 TNF-α 組的MSCs細(xì)胞愈合程度，證明 PKCα 的活性被抑制后，TNF-α 促進(jìn)MSCs細(xì)胞的遷移作用也被抑制.

圖1　Calphostin C抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 MSCs細(xì)胞遷移能力Fig.1　Calphostin C inhibits MSC migration induced by TNF-α

2.2Transwell檢測(cè)加入Calphostin C后對(duì)TNF-α促侵襲作用的影響

利用 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果如圖2所示.

圖2　Calphostin C抑制TNF-α 誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞侵襲能力Fig.2　Calphostin C inhibits MSC invasion induced by TNF-α

加入TNF-α的MSCs細(xì)胞的侵襲能力大于沒有處理的 MSCs細(xì)胞的侵襲能力，證明 TNF-α可以促進(jìn)MSCs細(xì)胞的侵襲.而加入Calphostin C+TNF-α組的 MSCs細(xì)胞侵襲能力小于加入 TNF-α 組的MSCs細(xì)胞侵襲能力，證明 PKCα的活性被抑制后，TNF-α促進(jìn)MSCs細(xì)胞的侵襲作用也被抑制.

2.3檢測(cè)遷移marker的表達(dá)變化

細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 CYR61、細(xì)胞骨架蛋白 MYL9與細(xì)胞遷移有直接的關(guān)系［15-16］.利用 Real-time PCR的方法檢測(cè)遷移maker MYL9、CYR61，mRNA水平的變化，結(jié)果如圖3所示.TNF-α可以促進(jìn)MYL9、CYR61，mRNA 表達(dá)的升高，而加入 Calphostin C抑制 PKCα 的活性后，TNF-α 的這種上調(diào)遷移 marker表達(dá)的能力被抑制.

圖3　Calphostin C抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 MSCs細(xì)胞遷移maker mRNA表達(dá)水平Fig.3 Calphostin C inhibits the mRNA levels of migration markers induced by TNF-α in MSCs cells

利用Western blot檢測(cè)這兩種基因蛋白水平的變化，如圖4所示.結(jié)果與mRNA水平的變化一致，進(jìn)一步證明了TNF-α 促進(jìn)MSCs細(xì)胞的遷移能力是通過激活PKCα.

圖4　Calphostin C抑制 TNF-α誘導(dǎo)的 MSCs細(xì)胞遷移maker蛋白表達(dá)水平Fig.4 Calphostin C inhibits the protein expression of migration markers induced by TNF-α in MSCs cells

3　討 論

腫瘤壞死因子 TNF-α 分泌前體是跨膜蛋白，然后經(jīng)過 TNF-α 轉(zhuǎn)化酶的剪切修飾轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄誀顟B(tài).每一種可溶性的亞型均有生理活性，TNF-α 的主要生理作用都是通過TNFR1，將信號(hào)傳達(dá)到細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)一系列的生理反應(yīng).作為炎癥因子，TNF-α 促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移已有相關(guān)研究.有研究［5］顯示，TNF-α 可以增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力，增加ERK的磷酸化和p38蛋白的磷酸化；加入 p38的抑制劑 SB203580后，細(xì)胞間黏附分子 1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）表達(dá)升高，抑制了TNF-α 引起的間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移.在 Ponte等［17］的研究中，發(fā)現(xiàn) TNF-α 可以大大增強(qiáng)趨化因子RANTES（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted facyor，RANTES）和SDF-1（stromal-cell derived factor-1，SDF-1）誘導(dǎo) MSCs遷移的能力.PKCα 是信號(hào)傳導(dǎo)PKC的大家族成員之一，在肝癌細(xì)胞中，PKCα 激活A(yù)KT/MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［13］.研究［14］顯示，在人的肺腺癌細(xì)胞中，TNF-α 誘導(dǎo)的 CLDN1（claudin-1，CLDN1）表達(dá)及細(xì)胞遷移通過 PKC信號(hào)通路.同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，MSCs的遷移與PKC信號(hào)通路相關(guān)，Lin等［18］發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）通過 PKC信號(hào)通路激活肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK），從而誘導(dǎo)MSCs遷移.Tang等［19］發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿通過PKC信號(hào)通路誘導(dǎo)MSCs遷移.

本文發(fā)現(xiàn)TNF-α 可以促進(jìn)MSCs細(xì)胞遷移和侵襲，并且通過加入PKCα 特異性抑制劑Calphostin C證實(shí) TNF-α 誘導(dǎo) MSCs細(xì)胞遷移通過 PKCα 通路.接下來可以通過RNA干擾技術(shù)敲低PKCα ，進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論作出補(bǔ)充.雖然多種誘導(dǎo)因子和信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)參與間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移過程，但是其具體的遷移機(jī)制依然不明確.在 TNF-α 誘導(dǎo)的MSCs遷移過程中是否還存在其他分子參與其中，激活PKCα 從而促進(jìn)TNF-α 誘導(dǎo)MSCs遷移是不是唯一的途徑，這些問題還有待于進(jìn)一步研究.

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責(zé)任編輯：郎婧

Inhibiting the Migration of Mesenchymal Stem Cells Induced by TNF-α with PKCα Inhibitor Calphostin C

SONG Tiefeng，WANG Nan，WANG Huiqin，YUAN Ying，HUANG Liwen，ZHUANG Chunyu，ZHANG Tongcun
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Inflammatory cytokine TNF-α can induce the migration of MSCs，but the mechanism of migration remains unclear.This study used PKCα inhibitor Calphostin C to inhibit PKCα activity，in order to know whether the migration of MSCs induced by TNF-α was accomplished by activating PKCα.MSCs were treated with 50，ng/mL of TNF-α.Wound heal assay and Transwell assay confirmed that TNF-α could induce the migration of MSCs.PKCα inhibitor Calphostin C inhibited TNF-α-induced MSC migration or invasion and reduced the expression of migration marker genes MYL9，and CYR61.In conclusion，PKCα inhibitor Calphostin C can inhibit the migration of MSCs induced by TNF-α.

MSCs；migration ability；TNF-α；PKCα

Q28

A

1672-6510（2016）04-0015-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150148

2015-10-08；

2015-12-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31171303）

宋鐵峰（1990—），女，黑龍江人，碩士研究生；通信作者：張同存，教授，tony@tust.edu.cn.