長(zhǎng)程表面等離子體共振生物傳感器的制備與應(yīng)用

褚立強(qiáng)，陶 順，王 磊，鄒雪娜

（天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457）

長(zhǎng)程表面等離子體共振生物傳感器的制備與應(yīng)用

褚立強(qiáng)，陶 順，王 磊，鄒雪娜

（天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457）

長(zhǎng)程表面等離子體共振（LRSPR）是超薄金屬膜兩側(cè)的衰逝場(chǎng)發(fā)生耦合后所形成的一種新型表面光學(xué)現(xiàn)象.與傳統(tǒng)的表面等離子體共振（cSPR）相比，LRSPR的表面衰逝場(chǎng)具有更強(qiáng)的表面電磁場(chǎng)強(qiáng)度、更長(zhǎng)的表面?zhèn)鞑ゾ嚯x以及更大的穿透深度.因此，基于 LRSPR現(xiàn)象的生物傳感器被認(rèn)為特別適合細(xì)胞或細(xì)菌等較大生物分子的檢測(cè)及行為研究.為了更好地了解LRSPR生物傳感器的最新研究進(jìn)展，本文總結(jié)了LRSPR的光學(xué)原理、生物傳感芯片的制備以及LRSPR傳感器在生物檢測(cè)領(lǐng)域的最新應(yīng)用.

生物傳感器；長(zhǎng)程表面等離子體共振（LRSPR）；氟碳薄膜；熒光光譜；拉曼光譜

生物傳感器在臨床診斷、生命科學(xué)研究、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品與國(guó)防安全等諸多領(lǐng)域具有十分廣泛的應(yīng)用前景，因此生物傳感器的研究與開(kāi)發(fā)吸引了世界各國(guó)科學(xué)家的普遍關(guān)注.基于表面等離子體共振（SPR）現(xiàn)象的生物傳感器具有無(wú)需標(biāo)記、高靈敏、對(duì)樣品無(wú)損傷、可在液體環(huán)境中動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)檢測(cè)等眾多優(yōu)勢(shì)［1-2］，從而成為過(guò)去30年中發(fā)展最快的一種光學(xué)生物傳感技術(shù)，被廣泛地應(yīng)用于各種生物分子的原位實(shí)時(shí)檢測(cè)［3-6］.

近年來(lái)，隨著對(duì)低濃度（＜1，ng/mL）和低分子質(zhì)量生物分子（MW＜1，000）檢測(cè)的需求不斷擴(kuò)大，人們開(kāi)始探索各種方法提升傳統(tǒng)表面等離子體共振（cSPR）傳感器的檢測(cè)靈敏度［7］.盡管 cSPR已經(jīng)被應(yīng)用于細(xì)胞等生物大分子的研究，但是由于cSPR的衰逝場(chǎng)穿透深度（Lp）大概在 100～150，nm，僅僅能夠檢測(cè)到細(xì)胞的一小部分［8］.針對(duì) cSPR技術(shù)的上述兩個(gè)局限，人們開(kāi)始研究長(zhǎng)程表面等離子體共振（LRSPR）生物傳感器.與cSPR相比，LRSPR生物傳感器是在高折射率棱鏡和貴金屬薄膜之間增加一定厚度的介電緩沖層，金屬薄膜兩側(cè)的表面電磁場(chǎng)發(fā)生相互耦合，所形成的新衰逝場(chǎng)具有更強(qiáng)的表面電磁場(chǎng)強(qiáng)度、更長(zhǎng)的表面?zhèn)鞑ゾ嚯x和更大的穿透深度［9-11］.因此，LRSPR生物傳感器被認(rèn)為特別適合于細(xì)胞或細(xì)菌等較大生物分子的檢測(cè)及行為研究［12-14］. 此外，LRSPR表面衰逝場(chǎng)可以激發(fā)金屬表面更廣和更遠(yuǎn)范圍內(nèi)的熒光或拉曼信號(hào)分子［15-19］，從而提高傳統(tǒng)光學(xué)技術(shù)的檢測(cè)靈敏度.

LRSPR光學(xué)現(xiàn)象在1969年Otto研究cSPR時(shí)就已經(jīng)被討論過(guò)［20］，但是當(dāng)時(shí)并沒(méi)有提出這個(gè)概念.直到20世紀(jì)80年代初，Sarid和Quail等研究組才從理論和實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 LRSPR的激發(fā)原理［21-23］.2001年Nenninger等［24］利用LRSPR傳感器檢測(cè)溶液的折光指數(shù)，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)優(yōu)化的 LRSPR傳感器的檢測(cè)靈敏度是cSPR的7倍，之后LRSPR作為傳感器才開(kāi)始受到關(guān)注.2005年 Wark等［25］首次報(bào)道了LRSPR顯微成像技術(shù)用于生物小分子DNA的檢測(cè)，其檢測(cè)靈敏度與 cSPR相比可以提高 40%，.最近幾年，LRSPR生物傳感器被成功用于各種條件下細(xì)胞或細(xì)菌的行為研究，因此這種新型生物傳感器開(kāi)始獲得越來(lái)越多的認(rèn)可.為了更好地了解 LRSPR生物傳感器技術(shù)，本文從 LRSPR的光學(xué)原理、生物傳感芯片的制備以及其在生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用等幾個(gè)方面述評(píng)該技術(shù).

1　LRSPR原理

目前LRSPR生物傳感器通常是基于Kretschmann構(gòu)型，即利用高折射率棱鏡在一定光波條件下激發(fā)LRSPR，因此本文主要介紹該種設(shè)計(jì) LRSPR的物理原理.LRSPR是超薄貴金屬膜兩側(cè)金屬/介電質(zhì)界面上的衰逝場(chǎng)發(fā)生耦合后所形成的一種新型表面光學(xué)現(xiàn)象.根據(jù)SPR物理理論，金屬中的電子自由運(yùn)動(dòng)形成所謂的“電子氣體”，受到表面限制形成電荷密度分布，被認(rèn)為是一種“等離子體”.它們?cè)陔姶挪ǖ母蓴_下發(fā)生電荷密度振蕩，具有電磁波的特性，被稱(chēng)為“表面等離子體共振（SPR）”.關(guān)于 cSPR的詳細(xì)物理理論及應(yīng)用，可閱讀其他綜述［2］.

當(dāng)采用較薄的金屬膜并且金屬膜兩側(cè)介電質(zhì)的折光指數(shù)相同或接近時(shí)，金屬膜兩側(cè)的 SPR衰逝場(chǎng)可以透過(guò)金屬膜而發(fā)生耦合作用，進(jìn)而形成一個(gè)新的表面增強(qiáng)電磁場(chǎng)，即所謂的LRSPR［26］.如圖1所示，cSPR中常用的金膜厚度為50，nm，而LRSPR中金膜的厚度多在 15～30，nm.根據(jù)傳統(tǒng)的電磁學(xué)理論，LRSPR本質(zhì)上是一種表面縱向（TM）電磁波，在金屬/介電質(zhì)界面上沿 x方向以衰減諧振波形式傳播，在 z方向 LRSPR的電磁場(chǎng)強(qiáng)度呈指數(shù)衰減，即在 z方向形成衰逝場(chǎng).衰逝場(chǎng)對(duì)于介電質(zhì)的介電常數(shù)變化非常敏感，因此可以利用 LRSPR現(xiàn)象來(lái)檢測(cè)金屬表面的物質(zhì)變化.

圖1　LRSPR和 cSPR的芯片結(jié)構(gòu)及表面衰逝場(chǎng)比較示意圖Fig.1　Schematic comparison between LRSPR and cSPR in their chip structures and evanescent fields

理論模擬計(jì)算獲得的兩種不同介電緩沖層材料構(gòu)建的 LRSPR與 cSPR表面電磁場(chǎng)強(qiáng)度分布如圖2［27］所示.

圖2　理論模擬獲得兩種LRSPR和cSPR的表面電磁場(chǎng)強(qiáng)度分布比較圖Fig.2　Comparison of the simulated electromagnetic field intensity profiles between two LRSPR chips and one cSPR

從圖 2可以發(fā)現(xiàn)，LRSPR衰逝場(chǎng)的表面電磁場(chǎng)強(qiáng)度是入射光強(qiáng)度的約 150倍，即具有表面增強(qiáng)效應(yīng)，可以用于增強(qiáng)拉曼或熒光等光學(xué)信號(hào).另外，圖2也顯示 LRSPR衰逝場(chǎng)在介電質(zhì)中的穿透深度 Lp在484～1，037，nm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于cSPR的約150，nm穿透深度，所以 LRSPR可用于細(xì)胞等較大生物分子的檢測(cè).LRSPR的激發(fā)受入射光波長(zhǎng)和入射角度、棱鏡的折光指數(shù)、金屬膜的厚度與折光指數(shù)、介電緩沖層的厚度與折光指數(shù)、芯片表面粗糙度等多因素的影響.

2　LRSPR芯片的制備

根據(jù)LRSPR的原理及圖1所示，LRSPR芯片的主要組成部分包括介電緩沖層和金屬薄膜.考慮到金屬薄膜的穩(wěn)定性和可修飾性，LRSPR芯片中最常用的是金膜（Au），最近也有報(bào)道用金-銀雙金屬薄膜［28］.金膜通常是通過(guò)熱蒸鍍法或磁控濺射法來(lái)沉積制備，金膜厚度可以通過(guò)沉積時(shí)間來(lái)控制.金膜厚度的細(xì)微誤差對(duì)于LRSPR的激發(fā)及最終檢測(cè)效果都至關(guān)重要.當(dāng)金膜的厚度低于 20，nm時(shí)，由于金的吸收作用顯著增強(qiáng)，所以并不適合于構(gòu)建 LRSPR傳感器［11］.除了厚度，其表面粗糙度對(duì)最終 LRSPR傳感器的性能也有一定影響［11，29］.

構(gòu)建LRSPR芯片的另一個(gè)關(guān)鍵是介電緩沖層的的制備.根據(jù)LRSPR的原理，介電緩沖層需要滿足4個(gè)要求：①介電緩沖層與檢測(cè)環(huán)境的折光指數(shù)盡量接近，這樣才可以在金膜兩側(cè)形成對(duì)稱(chēng)環(huán)境.對(duì)于生物傳感應(yīng)用，分析物通常是水相樣品，因此介電緩沖層的折光指數(shù)要接近于水（nw≈1.33）；②介電緩沖層的厚度要可以調(diào)控，因?yàn)椴煌穸鹊慕鹉ば枰捎貌煌穸鹊慕殡娋彌_層；③介電緩沖層與玻璃基底和金膜都要有很好的黏附性，保證芯片在液體環(huán)境中具有一定穩(wěn)定性；④介電緩沖層要具有較低的表面粗糙度，避免表面粗糙造成的 LRSPR表面衰逝場(chǎng)的減弱.

考慮到對(duì)折光指數(shù)的特殊要求，可以用于LRSPR芯片制備的緩沖層材料多為含氟化合物或聚合物，包括氟化鎂、共聚物 Teflon AF1600、聚合物Cytop、等離子體沉積氟碳薄膜ppPFOE等，這幾種材料的基本特性列在表1中.氟化鎂是LRSPR領(lǐng)域中使用時(shí)間最長(zhǎng)的一種材料，可以通過(guò)熱蒸鍍法方便地控制膜厚度［30］.氟化鎂的折光指數(shù) nd≈1.38，與水相比略高.氟化鎂具有一定的毒性，并且在水中具有（極低）溶解性，因此限制了這種材料在生物傳感器領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用.

表1　LRSPR芯片中常用介電緩沖層材料的特性比較Tab.1 Comparison of various dielectric buffer materials used for the fabrication of LRSPR chips

Teflon AF1600是美國(guó)杜邦公司生產(chǎn)的一種可溶于特殊溶劑的含聚四氟乙烯共聚物［27］，其折光指數(shù)nd≈1.31，比水的折光指數(shù)低.該材料可通過(guò)旋轉(zhuǎn)涂層法來(lái)制備不同厚度的薄膜.由于其介電常數(shù)與水接近，因此所制備的 LRSPR芯片可以獲得很高的表面電磁場(chǎng)強(qiáng)度和最大的穿透距離（見(jiàn)圖 2）［11，27，23］.不過(guò)，該材料的表面能低，造成其與玻璃基底和金膜之間的黏附性較差，所制備芯片存儲(chǔ)一段時(shí)間后氟碳薄膜會(huì)從玻璃上脫離下來(lái).為了提升Teflon AF1600與玻璃基底的黏附性，在旋涂前要先在玻璃基底上涂一層氟硅烷溶液，形成自組裝層［31］.另一方面，在沉積金膜之前，也需要對(duì)Teflon AF1600進(jìn)行表面處理或者沉積另外一層高表面能薄膜［27］.因此整個(gè)芯片制備過(guò)程非常繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng).

Cytop是日本Asahi公司提供的一種可溶性含氟聚合物，該聚合物與玻璃基底和金膜的黏附性要優(yōu)于Teflon AF1600［27，29］.另外，Cytop的折光指數(shù) nd≈1.34，與細(xì)胞或細(xì)菌的折光指數(shù)接近（nc≈1.35～1.38）［8］.因此，近年來(lái)在研究細(xì)胞行為時(shí)多采用Cytop材料構(gòu)建 LRSPR芯片［11，25］.Cytop和 Teflon AF1600 兩種聚合物均要溶于特定的溶劑，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液濃度和旋轉(zhuǎn)涂層的速度來(lái)控制介電緩沖層膜厚.之后相應(yīng)的溶劑必須采用熱處理等技術(shù)去除.旋轉(zhuǎn)涂層法制備薄膜的厚度并不能連續(xù)可調(diào)，另外該方法也不適合于大規(guī)模生產(chǎn).

2015年，本課題組提出利用等離子體聚合法沉積ppPFOE氟碳薄膜來(lái)構(gòu)建LRSPR芯片［32］.以十七氟-1-癸烯為單體（PFOE），通過(guò)調(diào)節(jié)射頻等離子體反應(yīng)器的操作參數(shù)和沉積時(shí)間，直接在玻璃基底上沉積各種厚度的 ppPFOE薄膜.該薄膜的折光指數(shù)nd≈1.38，與傳統(tǒng)的氟化鎂基本一致.考慮等離子體聚合過(guò)程的特點(diǎn)，ppPFOE薄膜具有交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，與玻璃基底和金膜具有很好的黏附性，而且在水中和乙醇中都具有很好的穩(wěn)定性.

圖 3是本課題組利用光學(xué)波導(dǎo)譜（OWS）來(lái)檢測(cè)1，678，nm厚 ppPFOE膜在水中時(shí)的厚度和折光指數(shù)變化［32］.可以看出其折光指數(shù) nd在 8，h內(nèi)變化僅為0.000，9，而膜厚在8，h內(nèi)的變化也僅為23.7，nm（即總膜厚度的1.4%，），基本保持穩(wěn)定.利用ppPFOE膜來(lái)構(gòu)建 LRSPR芯片過(guò)程步驟簡(jiǎn)單（見(jiàn)圖 4），等離子體聚合操作容易，無(wú)需溶劑，膜厚容易控制，所構(gòu)建芯片具有較好的檢測(cè)效果.考慮該方法適合于大規(guī)模生產(chǎn)，因此該方法對(duì)于未來(lái)實(shí)現(xiàn) LRSPR芯片的大規(guī)模制備及應(yīng)用具有重要意義.

圖3　OWS測(cè)試ppPFOE薄膜在水中的厚度和折光指數(shù)變化Fig.3 Evolution of the thickness and the refractive index of a ppPFOE film in water as measured using OWS

圖4　等離子聚合沉積法制備LRSPR芯片的過(guò)程示意圖Fig.4 Schematic representation of the preparation of LRSPR chip by using plasma polymerization technique

3　LRSPR生物傳感器的應(yīng)用

過(guò)去十多年中LRSPR生物傳感器已經(jīng)被用于檢測(cè)各種生物分子，其中包括 DNA［25］、病毒［33-34］、細(xì)胞［35-36］、細(xì)菌等［37-38］.與 cSPR類(lèi)似，LRSPR生物傳感器需要固定不同的生物分子識(shí)別體系（BIE），讓待測(cè)樣品流過(guò)傳感器表面，若樣品中有物質(zhì)能夠與芯片表面的 BIE發(fā)生特異性結(jié)合，就會(huì)引起反射光信號(hào)的變化［39］.

Wong等［33］報(bào)道了利用LRSPR生物傳感器來(lái)直接檢測(cè)人體血液中的登革熱病毒.他們比較了兩種BIE固定方法對(duì)傳感器檢測(cè)性能的影響.結(jié)果表明LRSPR生物傳感器完全可以實(shí)現(xiàn)對(duì)血液中的登革熱病毒的有效檢測(cè).表面血漿固定法相比于傳統(tǒng)的抗原固定法，減少了非特異性結(jié)合的發(fā)生，提高了檢測(cè)儀器的靈敏度與準(zhǔn)確度.前者所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以和酶聯(lián)免疫法（ELISA）所測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相媲美，進(jìn)一步印證了LRSPR傳感器的可靠性。

2015年Beland等［14］利用LRSPR生物傳感器對(duì)尿液中的致病菌進(jìn)行檢測(cè).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均具有良好的選擇性，且濃度檢測(cè)限可以低至1×105mL-1（國(guó)際認(rèn)可的對(duì)尿路感染診斷的濃度閾值）.Krupin等［35］利用LRSPR生物傳感器檢測(cè)人血液中紅細(xì)胞.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，經(jīng)抗 A型血免疫球蛋白修飾的傳感器表面，可以對(duì) A型、AB型紅細(xì)胞選擇性識(shí)別，檢測(cè)限可以低至 3×105mL-1.

B型淋巴細(xì)胞白血病的病人血清溶液中免疫 G蛋白的κ/λ 值會(huì)出現(xiàn)異常.如果能對(duì)血清中免疫G蛋白的κ/λ值進(jìn)行檢測(cè)，就可以實(shí)現(xiàn)B型淋巴細(xì)胞白血病的快速診斷.Krupin等［36］利用LRSPR生物傳感器直接檢測(cè)樣品中免疫 G蛋白的κ/λ值.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在對(duì)High Lambda、High Kappa、Normal 3種類(lèi)型血清溶液的檢測(cè)中，反向法得到的κ/λ 值和目前醫(yī)療診斷時(shí)用的密度計(jì)法得到的值在趨勢(shì)上保持一致，且在對(duì)High Lambda血清溶液的檢測(cè)上，反向法得到的結(jié)果比密度計(jì)法所得結(jié)果值還要高.這說(shuō)明 LRSPR生物傳感器可以有效分辨 G蛋白成分的區(qū)別，并能快速得到樣本中免疫G蛋白的κ/λ值.

細(xì)胞的形態(tài)變化反映著細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)骨架重組、運(yùn)動(dòng)能力、浸潤(rùn)性等生物信息.LRSPR生物傳感器的衰逝場(chǎng)具有較大的穿透深度，因此可以穿過(guò)細(xì)胞膜深入到細(xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)高折射指數(shù)區(qū)域內(nèi)的成分（如肌動(dòng)蛋白纖維等）變化進(jìn)行跟蹤檢測(cè).Vala等［13］以 Cytop為介電緩沖層構(gòu)建 LRSPR生物傳感器，并將其用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鼠腎部上皮細(xì)胞在不同滲透壓環(huán)境下的形態(tài)變化.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LRSPR傳感器能夠有效地反映出細(xì)胞體積的變化，并且比cSPR生物傳感器的響應(yīng)更快，強(qiáng)度更高，檢測(cè)信號(hào)更準(zhǔn)確.

2012年Chabot等［40］以Teflon AF1600為介電緩沖層構(gòu)建LRSPR生物傳感器，之后研究HEK-293細(xì)胞對(duì)不同濃度脂多糖（LPS）的毒性反應(yīng).結(jié)果表明其檢測(cè)靈敏度比 cSPR要高 50%，.最近，Yang等［12］利用LRSPR生物傳感器對(duì)纖維原細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞的微移動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè).研究發(fā)現(xiàn)，LRSPR生物傳感器對(duì)于由細(xì)胞的微移動(dòng)導(dǎo)致的光學(xué)波動(dòng)能夠產(chǎn)生很強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)，而cSPR生物傳感器的檢測(cè)信號(hào)在整個(gè)變化過(guò)程中始終很弱.

2014年 Mejard等［41］系統(tǒng)地比較了 LRSPR和cSPR兩種生物傳感器檢測(cè)3T3小鼠成纖維細(xì)胞在表面的吸附和擴(kuò)展過(guò)程.在不同細(xì)胞吸附密度時(shí)測(cè)量的cSPR和LRSPR譜圖，以及不同密度下的細(xì)胞光學(xué)圖片如圖5［41］所示.，結(jié)果顯示，盡管在這個(gè)研究中LRSPR與cSPR的靈敏度沒(méi)有很大區(qū)別，但是LRSPR傳感器的分辨率要高于cSPR.作者認(rèn)為L(zhǎng)RSPR可能更適合檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的變化.

圖5　不同密度3T3細(xì)胞條件下的cSPR和LRSPR譜圖以及不同密度下光學(xué)圖片F(xiàn)ig.5 Experimental spectra recorded for cSPR and LRSPR sensor at different cell coverage values and the optical micrographs at three different cell coverage of 3T3 cells

4　LRSPR增強(qiáng)熒光或拉曼光譜

LRSPR的表面增強(qiáng)電磁場(chǎng)可以激發(fā)其穿透深度內(nèi)熒光或拉曼信號(hào)分子［42-43］.2006年 Kasry等［42］發(fā)現(xiàn)在 LRSPR增強(qiáng)熒光生物傳感器中，隨著入射角的變化，熒光信號(hào)的強(qiáng)度也會(huì)相應(yīng)改變，在共振角附近達(dá)到最大值.因此，可以通過(guò)反射性光譜調(diào)節(jié)熒光增強(qiáng)的最佳角度，然后以此角度進(jìn)行相應(yīng)的熒光檢測(cè). 2007年 Dostalek等［11］系統(tǒng)比較了 LRSPR和 cSPR兩種傳感器激發(fā)熒光分子的性能與熒光分子到金膜的距離之間的關(guān)系.當(dāng)熒光分子距離金膜表面為460，nm時(shí)，LRSPR由于具有大的穿透深度，因此依然可以激發(fā)熒光信號(hào).而 cSPR則不能有效激發(fā)熒光，這個(gè)結(jié)果表明 LRSPR增強(qiáng)熒光將獲得更高的檢測(cè)靈敏度.當(dāng)熒光分子分布在 LRSPR衰逝場(chǎng)全部范圍內(nèi)時(shí)，LRSPR增強(qiáng)熒光的信號(hào)強(qiáng)度是cSPR的12倍.之后 Huang等［44］將水凝膠波導(dǎo)層（HOW）引入到LRSPR增強(qiáng)熒光傳感器芯片上，以提高表面捕捉熒光信號(hào)分子的能力.圖6［44］是Huang等設(shè)計(jì)芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，利用LRSPR和HOW共同作用來(lái)提高熒光檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)免疫球蛋白分子的檢測(cè)極限可達(dá)到 20，fmol.

圖6　LRSPR與HOW結(jié)合增強(qiáng)熒光檢測(cè)芯片結(jié)構(gòu)示意圖Fig.6　Schematic representation of fluorescence detection chips through combining LRSPR and HOW

LRSPR增強(qiáng)熒光光譜也被應(yīng)用于精液中的前列腺游離特異抗原［45］和牛奶中的黃曲霉毒素［19］的檢測(cè).前者的抗原識(shí)別采用夾心型模式［45］，即先在芯片表面固定過(guò)量的抗體 Ab，然后加入一定量的未標(biāo)記抗原 Ag，免疫反應(yīng)后，再加入已標(biāo)記熒光物質(zhì)的抗體L-Ab.熒光強(qiáng)度越大表明抗原Ag的濃度越大.后者的抗原識(shí)別采用競(jìng)爭(zhēng)型模式［19］，即先在芯片表面固定一定濃度的抗體 Ab和標(biāo)記抗原 L-Ag，隨后被加入的未標(biāo)記抗原Ag和標(biāo)記抗原L-Ag競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體 Ab.熒光強(qiáng)度越小表明未標(biāo)記抗原 Ag的濃度越大.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該LRSPR增強(qiáng)熒光生物傳感器對(duì)精液中前列腺游離特異抗原的檢測(cè)限低至 34，fmol，對(duì)牛奶中黃曲霉毒素的檢測(cè)限低至 1，pg/mL.相比于普通的熒光分析，檢測(cè)限降低了至少三個(gè)數(shù)量級(jí)，且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需要不到1，h就能完成.Huang等［46］研究LRSPR增強(qiáng)熒光生物傳感器對(duì)溶液中大腸桿菌的檢測(cè)能力.結(jié)果表明，該傳感器對(duì)于大腸桿菌的濃度變化非常靈敏，檢測(cè)過(guò)程不超過(guò) 40，min，檢測(cè)限低至10，mL-1.之后Huang等［16］還系統(tǒng)研究了溶液流動(dòng)等對(duì)細(xì)菌檢測(cè)的影響.

表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）經(jīng)過(guò)40多年的發(fā)展，已經(jīng)在材料分析、生物、醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)和國(guó)家安全等領(lǐng)域獲得了實(shí)際應(yīng)用.SERS技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)包括無(wú)需標(biāo)記，可直接獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，靈敏度高，不受水干擾等.2011年Liu等［17］首先報(bào)道了利用LRSPR表面衰逝場(chǎng)來(lái)增強(qiáng)SERS信號(hào).他們以氟化鎂為介電緩沖層制備了LRSPR芯片，檢測(cè)4-巰基吡啶在銀膜表面的拉曼光譜.由于 LRSPR具有更強(qiáng)的表面電磁場(chǎng)，信號(hào)是傳統(tǒng)SPR增強(qiáng)拉曼散射的15倍以上.之后該研究組進(jìn)一步在 LRSPR模式上引入了單層AgNPs［18］，理論模擬顯示在銀膜與AgNPs之間將產(chǎn)生 2.1×104倍的電磁場(chǎng)增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SERS信號(hào)提高了 40倍，這種條件下增強(qiáng)因子（EF）達(dá)到 9.2×108.該技術(shù)還允許通過(guò)調(diào)節(jié)入射光角度來(lái)調(diào)節(jié)衰逝場(chǎng)的穿透深度，進(jìn)而調(diào)節(jié)被激發(fā)信號(hào)分子的范圍［47］.

5　結(jié)論與展望

LRSPR生物傳感器的制備與應(yīng)用是一個(gè)涉及生物、物理、化學(xué)、材料、醫(yī)學(xué)等多學(xué)科交叉的研究領(lǐng)域.過(guò)去限制 LRSPR生物傳感器發(fā)展的主要困難是制備過(guò)程繁瑣及芯片穩(wěn)定性低，因此人們對(duì) LRSPR芯片的制備技術(shù)進(jìn)行了不斷的優(yōu)化與完善.以Cytop為原料，通過(guò)旋轉(zhuǎn)涂層法制備的 LRSPR芯片完全可以滿足實(shí)驗(yàn)室研究的需要.最近，本課題組提出使用ppPFOE氟碳薄膜來(lái)構(gòu)建芯片，盡管其折光指數(shù)偏高，但是可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，相信可以促進(jìn)本領(lǐng)域的發(fā)展.

經(jīng)過(guò)20多年的研究，人們對(duì)于LRSPR芯片的結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系已經(jīng)有了一定的認(rèn)識(shí).其中最關(guān)鍵的一個(gè)問(wèn)題是貴金屬薄膜的制備.很多研究組（包括我們）都發(fā)現(xiàn)金膜厚度的細(xì)微變化對(duì)于LRSPR的譜圖影響非常大，不同厚度金膜又需要用不同厚度的介電緩沖層與之匹配.目前常用的熱蒸鍍法和磁控濺射法制備金膜時(shí)對(duì)厚度的控制并不準(zhǔn)確，因此未來(lái)還需要重點(diǎn)研究超薄金膜的制備技術(shù).

近年來(lái) LRSPR生物傳感器在生物檢測(cè)領(lǐng)域獲得了越來(lái)越多的關(guān)注.盡管有些報(bào)道顯示其靈敏度等要優(yōu)于cSPR，不過(guò)也有些研究顯示其優(yōu)勢(shì)并不明顯.最新的研究報(bào)道顯示，LRSPR生物傳感器在研究細(xì)胞或細(xì)菌的動(dòng)態(tài)行為時(shí)具有一定的優(yōu)勢(shì)，不僅可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的吸附、分散、微移動(dòng)和體積形態(tài)變化，而且可以跟蹤細(xì)胞對(duì)外界刺激或物質(zhì)的反應(yīng)過(guò)程.LRSPR生物傳感器穿透深度大，使其可能用于檢測(cè)細(xì)胞間相互作用或細(xì)胞內(nèi)部反應(yīng)過(guò)程.

不過(guò)，當(dāng)利用LRSPR生物傳感器檢測(cè)細(xì)胞的折光指數(shù)變化時(shí)，并不能區(qū)分細(xì)胞中不同成分的變化.將 LRSPR與熒光或拉曼光譜技術(shù)聯(lián)用可以進(jìn)一步增強(qiáng)靈敏性，而且可以通過(guò)標(biāo)記分子或直接利用拉曼特征峰來(lái)區(qū)分細(xì)胞內(nèi)不同成分.相信聯(lián)用技術(shù)在未來(lái)會(huì)有更大的發(fā)展前景.到目前為止還沒(méi)有將LRSPR和拉曼聯(lián)用技術(shù)用于生物檢測(cè)方面的報(bào)道，本課題組未來(lái)將嘗試這方面的研究.

總之，關(guān)于LRSPR生物傳感器的制備與應(yīng)用研究才剛剛開(kāi)始，對(duì)于LRSPR芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)還需要優(yōu)化和完善.相信隨著LRSPR芯片制備技術(shù)、光學(xué)檢測(cè)裝置、數(shù)據(jù)模擬分析等方面的發(fā)展，LRSPR生物傳感器在復(fù)雜樣品實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、細(xì)胞功能調(diào)控、藥物篩選等領(lǐng)域?qū)@得越來(lái)越廣泛的應(yīng)用.

［1］ Homola J. Surface plasmon resonance sensors for detection of chemical and biological species［J］. Chemical Reviews，2008，108（2）：462-493.

［2］ Knoll W. Interfaces and thin films as seen by bound electromagnetic waves［J］. Annual Review of Physical Chemistry，1998，49（1）：569-638.

［3］ Zeidan E，Kepley C L，Sayes C，et al. Surface plasmon resonance：A label-free tool for cellular analysis［J］. Nanomedicine，2015，10（11）：1833-1846.

［4］ Couture M，Zhao S S，Masson J F. Modern surfaceplasmon resonance for bioanalytics and biophysics［J］. Physical Chemistry Chemical Physics，2013，15（27）：11190-11216.

［5］ ?ípová H，Homola J. Surface plasmon resonance sensing of nucleic acids：A review［J］. Analytica Chimica Acta，2013，773：9-23.

［6］ Safina G. Application of surface plasmon resonance for the detection of carbohydrates，glycoconjugates，and measurement of the carbohydrate-specific interactions：A comparison with conventional analytical techniques. A critical review［J］. Analytica Chimica Acta，2012，712：9-29.

［7］ Shalabney A，Abdulhalim I. Sensitivity-enhancement methods for surface plasmon sensors［J］. Laser & Photonics Reviews，2011，5（4）：571-606.

［8］ Méjard R，Griesser H J，Thierry B. Optical biosensing for label-free cellular studies［J］. TrAC Trends in Analytical Chemistry，2014，53：178-186.

［9］ Isaacs S，Abdulhalim I. Long range surface plasmon resonance with ultra-high penetration depth for selfreferenced sensing and ultra-low detection limit using diverging beam approach［J］. Applied Physics Letters，2015，106（19）：193701.

［10］ Berini P. Long-range surface plasmon polaritons［J］. Advances in Optics and Photonics，2009，1（3）：484-588.

［11］ Dostalek J，Kasry A，Knoll W. Long range surface plasmons for observation of biomolecular binding events at metallic surfaces［J］. Plasmonics，2007，2（3）：97-106.

［12］ Yang C T，Méjard R，Griesser H J，et al. cellular micromotion monitored by long-range surface plasmon resonance with optical fluctuation analysis［J］. Analytical Chemistry，2015，87（3）：1456-1461.

［13］ Vala M，Robelek R，Bocková M，et al. Real-time labelfree monitoring of the cellular response to osmotic stress using conventional and long-range surface plasmons［J］. Biosensors and Bioelectronics，2013，40（1）：417-421.

［14］ Beland P，Krupin O，Berini P. Selective detection of bacteria in urine with a long-range surface plasmon waveguide biosensor［J］. Biomedical Optics Express，2015，6（8）：2908-2922.

［15］ Bauch M，Toma K，Toma M，et al. Plasmon-enhanced fluorescence biosensors：A review［J］. Plasmonics，2014，9（4）：781-799.

［16］ Huang C J，Knoll W，Sessitsch A，et al. SPR bacterial pathogen biosensor：The importance of fluidic conditions and probing depth［J］. Talanta，2014，122：166-171.

［17］ Liu Y，Xu S，Xuyang X，et al. Long-range surface plasmon field-enhanced raman scattering spectroscopy based on evanescent field excitation［J］. The Journal of Physical Chemistry Letters，2011，2（17）：2218-2222.

［18］ Xuan X，Xu S，Liu Y，et al. A long-range surface plasmon resonance/probe/silver nanoparticle（LRSPR-PNP）nanoantenna configuration for surface-enhanced raman scattering［J］. The Journal of Physical Chemistry Letters，2012，3（19）：2773-2778.

［19］ Wang Y，Dostálek J，Knoll W. Long range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy for the detection of aflatoxin M1in milk［J］. Biosensors and Bioelectronics，2009，24（7）：2264-2267.

［20］ Otto A. Excitation by light of ω+and ω-surface plasma waves in thin metal layers［J］. Zeitschrift für Physik，1969，219（3）：227-233.

［21］ Sarid D. Long-range surface-plasma waves on very thin metal films［J］. Physical Review Letters，1981，47（26）：1927-1930.

［22］ Craig A E，Olson G A，Sarid D. Experimental observation of the long-range surface-plasmon polariton［J］. Optics Letters，1983，8（7）：380-382.

［23］ Quail J C，Rako J G，Simon H J. Long-range surfaceplasmon modes in silver and aluminum films［J］. Optics Letters，1983，8（7）：377-379.

［24］ Nenninger G G，Tobi?ka P，Homola J，et al. Long-range surface plasmons for high-resolution surface plasmon resonance sensors［J］. Sensors and Actuators B：Chemical，2001，74（1）：145-151.

［25］ Wark A W，Lee H J，Corn R M. Long-range surface plasmon resonance imaging for bioaffinity sensors［J］. Analytical Chemistry，2005，77（13）：3904-3907.

［26］ Kessler M A，Hall E A H. Multilayered structures exhibiting long-range surface exciton resonance［J］. Thin Solid Films，1996，272（1）：161-169.

［27］ Méjard R，Dostálek J，Huang C J，et al. Tuneable and robust long range surface plasmon resonance for biosensing applications［J］. Optical Materials，2013，35（12）：2507-2513.

［28］ Zekriti M，Nesterenko D V，Sekkat Z. Long-range surface plasmons supported by a bilayer metallic structure for sensing applications［J］. Applied Optics，2015，54（8）：2151-2157.

［29］ Huang C J，Dostalek J，Knoll W. Optimization of layerstructure supporting long range surface plasmons for surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensors［J］. Journal of Vacuum Science & Technology B，2010，28（1）：66-72.

［30］ Shi H，Liu Z，Wang X，et al. A symmetrical optical waveguide based surface plasmon resonance biosensing system［J］. Sensors and Actuators B：Chemical，2013，185：91-96.

［31］ Slavík R，Homola J. Ultrahigh resolution long range surface plasmon-based sensor［J］. Sensors and Actuators B：Chemical，2007，123（1）：10-12.

［32］ Wang L，Liu X J，Hao J，et al. Long-range surface plasmon resonance sensors fabricated with plasma polymerized fluorocarbon thin films［J］. Sensors and Actuators B：Chemical，2015，215：368-372.

［33］ Wong W R，Krupin O，Sekaran S D，et al. Serological diagnosis of dengue infection in blood plasma using longrange surface plasmon waveguides［J］. Analytical Chemistry，2014，86（3）：1735-1743.

［34］ Wong W R，Sekaran S D，Adikan F R M，et al. Detection of dengue NS1 antigen using long-range surface plasmon waveguides［J］. Biosensors and Bioelectronics，2016，78：132-139.

［35］ Krupin O，Wang C，Berini P. Selective capture of human red blood cells based on blood group using long-range surface plasmon waveguides［J］. Biosensors and Bioelectronics，2014，53：117-122.

［36］ Krupin O，Wang C，Berini P. Detection of leukemia markers using long-range surface plasmon waveguides functionalized with Protein G［J］. Lab on a Chip，2015，15（21）：4156-4165.

［37］ Vala M，Etheridge S，Roach J A，et al. Long-range surface plasmons for sensitive detection of bacterial analytes［J］. Sensors and Actuators B：Chemical，2009，139（1）：59-63.

［38］ 王慧，蔣冬梅，黃小林，等. 長(zhǎng)程表面等離子體共振技術(shù)在檢測(cè)大腸桿菌濃度中的應(yīng)用研究［J］. 功能材料，2011，42（S5）：817-820.

［39］ Wijaya E，Lenaerts C，Maricot S，et al. Surface plasmon resonance-based biosensors：From the development of different SPR structures to novel surface functionalization strategies［J］. Current Opinion in Solid State and Materials Science，2011，15（5）：208-224.

［40］ Chabot V，Miron Y，Grandbois M，et al. Long range surface plasmon resonance for increased sensitivity in living cell biosensing through greater probing depth［J］. Sensors and Actuators B：Chemical，2012，174：94-101.

［41］ Mejard R，Thierry B. Systematic study of the surface plasmon resonance signals generated by cells for sensors with different characteristic lengths［J］. PloS One，2014，9（10）：e107978.

［42］ Kasry A，Knoll W. Long range surface plasmon fluorescence spectroscopy［J］. Applied Physics Letters，2006，89（10）：101106.

［43］ Liu Y，Xu S，Tang B，et al. Note：Simultaneous measurement of surface plasmon resonance and surfaceenhanced Raman scattering［J］. Review of Scientific Instruments，2010，81（3）：036105.

［44］ Huang C J，Dostalek J，Knoll W. Long range surface plasmon and hydrogel optical waveguide field-enhanced fluorescence biosensor with 3D hydrogel binding matrix：On the role of diffusion mass transfer［J］. Biosensors and Bioelectronics，2010，26（4）：1425-1431.

［45］ Wang Y，Brunsen A，Jonas U，et al. Prostate specific antigen biosensor based on long range surface plasmonenhanced fluorescence spectroscopy and dextran hydrogel binding matrix［J］. Analytical Chemistry，2009，81（23）：9625-9632.

［46］ Huang C J，Dostalek J，Sessitsch A，et al. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157：H7［J］. Analytical Chemistry，2011，83（3）：674-677.

［47］ Liu Y，Xu S，Li H，et al. Localized and propagating surface plasmon co-enhanced Raman spectroscopy based on evanescent field excitation［J］. Chemical Communications，2011，47（13）：3784-3786.

責(zé)任編輯：周建軍

Preparation and Applications of Long-range Surface Plasmon Resonance Biosensors

CHU Liqiang，TAO Shun，WANG Lei，ZOU Xuena
（College of Chemical Engineering and Materials Science，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Long-range surface plasmon resonance（LRSPR）is a novel surface optical phenomenon by coupling the evanescent fields on the opposite interfaces of an ultrathin metallic film embedded between two dielectric layers with same/similar refractive indices.In contrast to conventional surface plasmon resonance（cSPR），LRSPR exhibits a stronger surface electromagnetic field，a longer propagation length，as well as a larger penetration depth.Consequently，LRSPR-based biosensors are believed to be particularly suitable for the detection of large biomolecules（e.g.，cells，bacteria，etc）and the real-time monitoring of cellular behavior.In order to better understand the state of the art in LRSPR biosensors，we herein summarize the physical principles behind the LRSPR，the fabrication of LRSPR chips and their biosensing applications.

biosensors；long-range surface plasmon resonance（LRSPR）；fluorocarbon thin films；fluorescence spectroscopy；Raman spectroscopy

O657.3

A

1672-6510（2016）04-0001-08

10.13364/j.issn.1672-6510.20160105

2016-03-24；

2016-05-06

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目（NCET-12-1064）

褚立強(qiáng)（1974—），男，遼寧綏中人，教授，chuliqiang@tust.edu.cn.