mTOR/VEGF信號通路與鼻息肉關(guān)系的研究

王梟維，白偉良，徐婷婷，譚海燕

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽 110004）

mTOR/VEGF信號通路與鼻息肉關(guān)系的研究

王梟維，白偉良，徐婷婷，譚海燕

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽 110004）

目的研究哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）B蛋白在鼻息肉組織中的表達(dá)情況，探討mTOR/VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在鼻息肉發(fā)病過程中的作用。方法采用免疫組化SP法檢測33例鼻息肉及12例鼻竇非炎性黏膜組織標(biāo)本中mTOR及VEGFB的表達(dá)情況。結(jié)果在鼻息肉組中mTOR蛋白及VEGFB蛋白陽性表達(dá)率分別為78.79%及82.61%，免疫陽性細(xì)胞數(shù)及著色強(qiáng)度明顯高于對照組（P＜0.05）。Spearman等級相關(guān)分析顯示VEGFB與mTOR表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.837，P＜0.01）。結(jié)論在人鼻息肉組織中，mTOR及VEGFB蛋白表達(dá)明顯增高，表達(dá)呈正相關(guān)，提示了在鼻息肉的發(fā)生發(fā)展中，mTOR被激活，引起下游VEGFB表達(dá)增高，為研究鼻息肉的發(fā)生機(jī)制以及防治鼻息肉的臨床工作提供新思路。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；鼻息肉

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鼻息肉是臨床上常見的慢性鼻黏膜炎癥性疾病，目前以手術(shù)治療為主，結(jié)合糖皮質(zhì)激素等藥物治療，但手術(shù)復(fù)發(fā)率較高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，部分鼻息肉對糖皮質(zhì)激素治療有抵抗，保守治療效果也不理想。雷帕霉素靶蛋白（mammalian ra?pamycin target protein，mTOR）是目前的研究熱點(diǎn)，有研究［1］表明，活化的mTOR信號通路在缺乏Foxp3+ Tregs的鼻息肉組織中發(fā)揮重要作用。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）B基因是VEGF家族的成員之一，廣泛存在于各種組織中。動物實(shí)驗(yàn)研究［2?4］表明VEGFB能促進(jìn)血管生成，可能與激活內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶有關(guān)。mTOR相關(guān)基因的表達(dá)與年齡增長有關(guān)，其中VEGFB作為下游基因，與年齡增長呈負(fù)相關(guān)［5］，而mTOR/VEGF信號通路在鼻息肉中的作用機(jī)制，目前尚不清楚。本研究采用免疫組化SP法分析檢測mTOR及VEGFB在鼻息肉中的表達(dá)情況。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料：隨機(jī)選取2011年至2013年在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科住院行鼻內(nèi)鏡手術(shù)，且經(jīng)術(shù)后病理診斷為鼻息肉的33例患者作為實(shí)驗(yàn)組，鼻腔鼻竇非炎性疾病患者正常黏膜12例為對照組。全部入組病例排除變應(yīng)性鼻炎、哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病，排除高血壓及糖尿病等慢性病史，近期無下呼吸道感染性疾病。

1.1.2主要試劑：兔抗人p?mTOR，VEGFB多克隆抗體（一抗）分別購自Santa cruz及Abcom公司，抗原修復(fù)液購自武漢博士德生物工程有限公司，內(nèi)源性生物素阻斷試劑盒，SP超敏試劑盒（山羊抗兔IgG，二抗）和DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

所有標(biāo)本常規(guī)做石蠟切片，經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，用免疫組織化學(xué)SP法染片，采用微波修復(fù)進(jìn)行抗原修復(fù)。血清及生物素阻斷劑封閉。一抗4℃條件下孵育過夜，VEGFB及p?mTOR一抗工作液濃度分別為1∶160及1∶80。按試劑盒操作進(jìn)行DAB染色。用已知陽性表達(dá)切片做陽性對照。PBS代替一抗做陰性對照。根據(jù)在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野中細(xì)胞的染色比例與染色強(qiáng)度進(jìn)行評價：不著色記0分，著淺黃色記1分，著棕黃色記2分，著棕褐色及3分；染色面積＜5%記0分，5%～25%記1分，25%～＜50%記2分，50%～＜75%記3分，≥75%記4分，兩者相乘為最終評分，0～2分為染色陰性，3～4分為弱陽性，5～8分為陽性，9～12分為強(qiáng)陽性［6］。每張切片的閱讀是由2位獨(dú)立的觀察者在不知道病例資料具體情況下完成的，最終結(jié)果由病理科醫(yī)生審核。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料的差異比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析行Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1VEGFB在鼻息肉中的表達(dá)

VEGFB主要在細(xì)胞質(zhì)呈陽性表達(dá)，部分位于細(xì)胞核，為棕黃色或棕褐色顆粒，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮、黏膜上皮和腺上皮，見圖1A。VEGFB陽性表達(dá)率為82.61%，免疫陽性細(xì)胞數(shù)及著色強(qiáng)度明顯高于對照組，見圖1B，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2mTOR在鼻息肉中的表達(dá)

圖1　免疫組化方法檢測VEGFB的表達(dá) ×400Fig.1　Immunohistochemistry staining of VEGFB protein×400

表1　VEGFB蛋白在鼻息肉和正常鼻黏膜組織中的表達(dá)Tab.1　The expression of VEGFB protein in nasal polyps and normal tissues

mTOR在細(xì)胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)，為棕黃色或棕褐色顆粒，主要表達(dá)于黏膜上皮、腺上皮和炎性細(xì)胞，見圖2A。mTOR陽性表達(dá)率為78.79%，免疫陽性細(xì)胞數(shù)及著色強(qiáng)度明顯高于對照組，見圖2B，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3mTOR與VEGFB表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman等級相關(guān)分析顯示，VEGFB與mTOR表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.837，P＜0.01）。

3　討論

鼻息肉是臨床上常見的慢性鼻黏膜炎性疾病，發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，普遍認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果，如感染性因素、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子釋放、變態(tài)反應(yīng)因素以及基因調(diào)控［7］等，不同患者的致病因素可能不同。

圖2　 免疫組化方法檢測mTOR的表達(dá) ×400Fig.2　Immunohistochemistry staining of mTOR protein　×400

表2　mTOR蛋白在鼻息肉和正常鼻黏膜組織中的表達(dá)Tab.2　The expression of mTOR protein in nasal polyps and normal tissues

mTOR是雷帕霉素的靶分子，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶（phosphatidylinositol kinase?relat?ed protein kinase，PIKK）家族成員，是PI3K/Akt信號通路下游的重要底物。mTOR的Ser 2448位點(diǎn)可被Akt直接磷酸化，PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活，使得下游包括mTOR、caspase9、NF?κB等一系列底物，從而抑制細(xì)胞凋亡［8］。該通路在過敏性呼吸道疾病的發(fā)展中起到顯著的刺激作用［9］，而與鼻息肉相關(guān)的報道較少。本研究應(yīng)用免疫組化SP法研究mTOR在鼻息肉中的表達(dá)，結(jié)果顯示在黏膜上皮、腺上皮及炎性細(xì)胞有陽性表達(dá)，表達(dá)率為78.79%，免疫陽性細(xì)胞數(shù)及著色強(qiáng)度明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示了mTOR被激活后，鼻腔黏膜上皮細(xì)胞、黏膜下腺體內(nèi)皮細(xì)胞以及炎性細(xì)胞凋亡受到抑制，黏膜上皮細(xì)胞增生，腺體擴(kuò)大，炎性細(xì)胞浸潤生長，趨化嗜酸粒細(xì)胞，減緩炎癥消退，導(dǎo)致一種慢性炎性反應(yīng)［10］，而VEGF作為PI3K/Akt/ mTOR的下游基因，其表達(dá)及活性有可能受到影響。文獻(xiàn)報道鼻息肉中存在VEGFA的表達(dá)，可促使黏膜血管通透性增高，加重黏膜水腫，促進(jìn)息肉組織內(nèi)的血管增殖和炎性細(xì)胞聚集，促進(jìn)鼻息肉的形成、生長及復(fù)發(fā)，使正常鼻黏膜向息肉組織轉(zhuǎn)化。在患有哮喘的生物個體的多種組織樣本中檢測到高表達(dá)的VEGFA［11］，且VEGF的表達(dá)高低與哮喘患者病情程度密切相關(guān)［12］，可能是過敏性呼吸道疾病關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子［9］。而VEGFB在過敏性呼吸道疾病及鼻息肉中的表達(dá)情況，國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本研究應(yīng)用免疫組化SP法研究VEGFB在鼻息肉的表達(dá)，結(jié)果顯示VEGFB蛋白在黏膜上皮、腺上皮、血管內(nèi)皮及炎性細(xì)胞有陽性表達(dá)，表達(dá)率為82.61%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示了VEGFB被激活后，血管內(nèi)皮細(xì)胞加強(qiáng)分裂增殖、新生血管增多，黏膜水腫加重，炎性細(xì)胞聚集，使正常鼻黏膜向息肉組織轉(zhuǎn)化。

本研究還發(fā)現(xiàn)mTOR及VEGFB兩者間表達(dá)呈正相關(guān)，有協(xié)同表達(dá)關(guān)系，提示在各種因素作用下，mTOR/VEGF信號通路激活，mTOR及VEGFB表達(dá)均增高，鼻腔黏膜細(xì)胞凋亡受到抑制，同時組織內(nèi)的血管增殖和炎性細(xì)胞聚集，促進(jìn)鼻息肉的形成、生長及復(fù)發(fā)，最終形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致鼻息肉的形成。深入研究mTOR/VEGF信號通路對于鼻息肉的治療及防止復(fù)發(fā)具有重要意義。

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（編輯于溪）

Expression of mTOR/VEGFB Signal Transduction Pathway in Nasal Polyps

WANG Xiaowei，BAI Weiliang，XU Tingting，TAN Haiyan
（Department of Otorhinolaryngology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTostudytheexpressionofmammalianrapamycintargetprotein（mTOR）andvascularendothelialgrowthfactor（VEGF）B in nasal polyps，so as to explore the role ofmTOR/VEGFsignal pathway in the process of the formation of nasal polyps.MethodsTotally 33 nasal polyps tissues and 12 normal tissues were collected.Immunohistochemistry were used to detect the expression of VEGFB and mTOR in tissues of both group，and the expression differences were compared.ResultsImmunohistochemistry results showed that the number of positive stained cells and staining intensity of VEGFB and mTOR in nasal polyp tissues were higher than those of controls group（P＜0.05）.The positive expres?sion rates of mTOR and VEGFB were 78.79%and 82.61%，respectively.Spearman correlation test showed that there was a close correlation among VEGFB and mTOR expression in nasal polyp tissues（r=0.837，P＜0.01）.ConclusionThe expressions of VEGFB and mTOR are up?regulat?ed in nasal polyps，and there is a close correlation between them.

mammalianrapamycintargetprotein；vascularendothelialgrowthfactor；nasal polyps

R765.2

A

0258-4646（2016）11-0992-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.11.009

遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金（2013001010）；沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃（F11?264?1?07，F(xiàn)13?220?9?21）

王梟維（1987-），女，醫(yī)師，碩士.

白偉良，E-mail：baiwl@sj?hospital.org

2015-12-07

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