分子標記PM19-A1對1 015份小麥抗穗發(fā)芽基因型的篩選及其有效性驗證

曹雪連，張 衡，姜 昊，吳曾云，曹佳佳，朱玉磊，王升星，常 成，張海萍，馬傳喜

(安徽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/農(nóng)業(yè)部黃淮南部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，安徽合肥 230036)

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分子標記PM19-A1對1 015份小麥抗穗發(fā)芽基因型的篩選及其有效性驗證

曹雪連，張 衡，姜 昊，吳曾云，曹佳佳，朱玉磊，王升星，常 成，張海萍，馬傳喜

(安徽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/農(nóng)業(yè)部黃淮南部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，安徽合肥 230036)

為了解與穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因 PM19-A1在我國小麥品種資源中的分布及其分子標記PM19-A1的有效性，并篩選抗穗發(fā)芽等位基因組合，利用標記PM19-A1對1 015份小麥品種資源(包括我國253份微核心種質(zhì)、603份全國主要麥區(qū)品種資源以及153份國外引進材料)進行檢測，于2015年測定其中540份材料的種子萌芽指數(shù)(GI)和田間自然降雨整穗發(fā)芽率(FS)，驗證該基因標記的有效性；結(jié)合 TaVp-1B的基因型，篩選 PM19-A1/TaVp-1B抗穗發(fā)芽等位基因組合；并以大白皮和六月黃(攜帶 PM19-A1a等位基因類型)通過后熟的種子為材料，進行高溫(38.5 ℃)、不同濃度ABA(50 μmol·L-1和125 μmol·L-1)以及GA(1 mmol·L-1)處理，分析該基因的表達特性。結(jié)果表明， PM19-A1基因存在兩種等位基因類型( PM19-A1a和 PM19-A1b)，等位基因類型為 PM19-A1a的材料，其平均GI和FS均顯著低于等位基因類型為 PM19-A1b的材料，為抗穗發(fā)芽等位類型； PM19-A1a在我國微核心種質(zhì)、全國主要麥區(qū)品種資源和國外引進材料中的分布頻率分別是17.4%、7.7%和31.8%；篩選出抗穗發(fā)芽等位基因組合 PM19-A1a/TaVp-1Bc；高溫和ABA處理均能誘導 PM19-A1基因表達上調(diào)，GA處理則抑制其表達上調(diào)；不同抗穗發(fā)芽品種中 PM19-A1基因?qū)BA(P<0.01)以及GA(P<0.05)的敏感性反應存在顯著差異。

小麥；收獲前穗發(fā)芽；種子休眠； PM19-A1； TaVp-1B

小麥籽粒臨近收獲時田間遭遇降雨或雨后長時間高濕天氣容易發(fā)生穗發(fā)芽現(xiàn)象[1]。小麥穗發(fā)芽屬于一種世界性自然災害，嚴重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)，如美國、加拿大、澳大利亞等以小麥種植為主的國家均遭受穗發(fā)芽危害[2]。在我國，長江中下游、西南冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)是收獲季節(jié)易降雨的地區(qū)，也是穗發(fā)芽危害頻繁地區(qū)，黃淮和北部冬麥區(qū)也時有發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計，受穗發(fā)芽危害的麥區(qū)約占全國小麥總面積的83%[3]。

研究表明，種子休眠性是穗發(fā)芽抗性的主要遺傳因素，其他因素如穗部形態(tài)(穗子疏密和大小、彎曲程度和蠟質(zhì)等)、籽粒性狀(種皮色澤、種皮厚度和籽粒吸水速率等)、以及穎殼內(nèi)發(fā)芽抑制物質(zhì)等對穗發(fā)芽抗性起修飾作用[4]。植物激素(主要為ABA和GA)和溫度是影響種子休眠形成的主要因素。ABA抑制種子萌芽，誘導種子休眠，GA則打破種子休眠，促進萌芽。此外，種子休眠的誘導不僅依賴于ABA的水平，而且還決定于種子/離體胚對ABA的敏感性[5]。籽粒發(fā)育期間，尤其是發(fā)育后期的高溫(26 ℃以上)不利于種子深休眠的形成，低溫(15 ℃以下)則有利于種子深休眠的形成[6]。成熟收獲的種子在浸潤期間，高溫(35 ℃、4 h)抑制其萌發(fā)，而低溫(15 ℃以下)則可以增加吸漲種子的萌發(fā)能力，提高萌芽率[7]。隨著全球氣溫的升高，使得小麥籽粒發(fā)育中后期的溫度偏高，造成種子休眠/穗發(fā)芽抗性水平下降，加大了小麥收獲前穗發(fā)芽的潛在風險。鑒定種子休眠性相關(guān)基因，開發(fā)功能標記，將有助于加快抗穗發(fā)芽小麥新品種的培育進程。

目前，已鑒定的與小麥種子休眠/穗發(fā)芽抗性相關(guān)的基因主要有 TaVp-1[8]、 Tamyb10-1[9]、TaMFT[10]、TaSdr[11]、TaDFR[12]和 PM19-A1[13]。其中， PM19-A1基因所在的4AL染色體區(qū)域最初由Mares等[14-16]在澳大利亞白皮抗穗發(fā)芽品種Halberd以及南非白皮抗穗發(fā)芽地方品種AUS1408和SW95-50213中初步定位，隨后被不同學者共同驗證[17-19]，且靠近該區(qū)域的分子標記(Xbarc170、DuPw004、Xwmc650和gpw2279)在穗發(fā)芽抗性育種中的有效性也被Hickey等[20]和Singh等[21]所證實。2015年，Barrero等[13]利用多親本高代自交群體衍生的多重近等基因系，結(jié)合RNA測序克隆了位于該區(qū)域的抗穗發(fā)芽候選基因 PM19-A1，并開發(fā)了功能標記，該基因存在兩種等位變異類型，即117 bp和99 bp擴增片段，前者與種子的強休眠性相關(guān)，后者與種子的弱休眠性相關(guān)。

PM19基因編碼一種質(zhì)膜類蛋白，早在2002年，Ranford等[22]在大麥中就克隆了該基因，并證明該基因參與大麥胚的發(fā)育以及胚休眠的形成與維持過程，即 PM19基因在大麥胚發(fā)育的中后期特異性表達，在休眠胚中其表達水平較高，伴隨胚的萌發(fā)，其表達水平顯著下降；此外，該基因表達受植物激素ABA、氯化鈉以及山梨醇所誘導。李永春等[23]利用RACE技術(shù)從綜合抗逆性強的小麥品種洛旱2號中克隆了 TaPM19-1基因，該基因同樣僅在發(fā)育中后期的種子中表達，在根系和葉片中其表達也受植物激素 ABA、干旱、高鹽以及高溫所誘導。

相對于目的基因緊密連鎖的分子標記來說，利用基因本身開發(fā)的功能標記進行育種輔助選擇無疑更準確高效。目前我國小麥品種資源中 PM19-A1基因的分布情況，及其與 TaVp-1B不同等位類型組合對穗發(fā)芽抗性的影響還不清楚。本試驗利用Barrero等[13]報道的 PM19-A1基因標記，檢測我國253份小麥微核心種質(zhì)、全國主要麥區(qū)608份品種資源以及154份國外引進材料；結(jié)合其中部分供試材料的穗發(fā)芽抗性表型，分析其與 TaVp-1B基因不同等位類型組合的分布情況，及其與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系；并利用定量RT-PCR技術(shù)分析小麥種子中該基因?qū)τ诩に?ABA和GA)和高溫的敏感性反應。本研究結(jié)果將有助于進一步深入理解小麥種子休眠/穗發(fā)芽抗性的分子調(diào)控機理，同時可以為小麥抗穗發(fā)芽分子聚合育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及其種植

用于 PM19-A1基因分子檢測的材料共計1 015份，包括253份中國小麥微核心種質(zhì)資源、608份全國主要麥區(qū)品種資源以及154份國外引進材料。選取上述608份品種資源中親緣關(guān)系相對較遠且穗發(fā)芽抗性不同的287份材料(Population 1, 簡稱Pop1)以及253份中國小麥微核心種質(zhì)(Population 2, 簡稱Pop2)用于分析 PM19-A1基因與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系以及篩選抗穗發(fā)芽等位基因組合。選取穗發(fā)芽抗性強、等位基因類型為 PM19-A1a的小麥地方品種六月黃和大白皮用于分析 PM19-A1基因?qū)τ贏BA、GA和高溫的敏感性反應。

608份全國主要麥區(qū)品種資源材料中，205份來自黃淮海冬麥區(qū)，185份來自北方冬麥區(qū)，78份來自長江中下游冬麥區(qū)，62份來自西南冬麥區(qū)，31份來自西北春麥區(qū)，30份來自東北春麥區(qū)，15份來自新疆冬春麥區(qū)，2份來自北方春麥區(qū)。154份國外引進材料中，15份來自阿根廷，12份來自澳大利亞，6份來自加拿大，41份來自法國，10份來自德國，4份來自匈牙利，8份來自日本，5份來自墨西哥，18份來自挪威，9份來自羅馬尼亞，8份來自俄羅斯，4份來自土耳其，11份來自美國，2份來自意大利，1份來自英國。608份全國主要麥區(qū)品種資源中的321份材料以及154份國外引進材料由中國農(nóng)科院作科所夏先春研究員提供，其余287份材料由本課題組收集。253份小麥微核心種質(zhì)由中國農(nóng)科院作物所賈繼增研究員提供。

上述Pop1和Pop2試驗材料于2014-2015年度種植于安徽農(nóng)業(yè)大學合肥大楊店試驗基地，每份材料種植2行，每行40粒，行長2 m，行寬20 cm，采用常規(guī)大田管理。

1.2 穗發(fā)芽抗性表型測定

采用種子萌芽指數(shù)(germination index, GI)以及田間自然降雨整穗發(fā)芽率(field sprouting, FS)來綜合評價小麥穗發(fā)芽抗性。室內(nèi)種子GI測定參照張海萍等[24]的方法；2015年小麥收獲期間遭遇陰雨天氣，田間自然降雨整穗發(fā)芽率(FS)測定參考朱玉磊等[25]的方法。

1.3 PM19-A1基因和 TaVp-1B基因的分子檢測

PM19-A1基因的PCR擴增體系為10 μL，包括2.0 μL模板DNA (50～60 ng·μL-1)、1.0 μL 10×Buffer (含有2.0 mmol·L-1Mg2+)、0.8 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、0.11 μL 5 U·μL-1TaqDNA聚合酶、10 μmol·L-1引物各0.4 μL和5.29 μL ddH2O。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。引物序列為：

TaPM19-A1-5F: 5′-GAAACAGCTACCGT GTAAAGC-3′; TaPM19-A1-5R:5′-TGGTGAA GTGGAGTGTAGTGG-3′。

TaVp-1B基因的PCR擴增體系為10 μL，包括2.0 μL模板DNA (50～60 ng·μL-1)、1.0 μL 10×Buffer (含有2.0 mmol·L-1Mg2+)、0.8 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、0.1 μL 5 U·μL-1TaqDNA聚合酶、10 μmol·L-1引物各0.4 μL和5.3 μL ddH2O。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。引物序列為：

TaVp-1B3-F:5′-TGCTCCTTTCCCAATTG G-3′；TaVp-1B3-R：5′-ACCCTCCTGCAGCTCA TTG-3′。

用于擴增 PM19-A1基因和 TaVp-1B基因的引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR擴增產(chǎn)物均采用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 PM19-A1基因的表達分析

將攜帶 PM19-A1a等位基因類型的材料六月黃和大白皮的種子通過后熟，以水處理為對照(CK)，同時進行不同濃度ABA(50 μmol·L-1和125 μmol·L-1)以及高溫(38.5 ℃)處理，然后對125 μmol·L-1ABA處理后仍未萌動種子進行GA(1 mmol·L-1)處理，分析 PM19-A1基因在不同濃度ABA、高溫以及GA處理后的表達水平的變化。人工氣候培養(yǎng)箱參數(shù)為20 ℃恒溫，14 h光照，濕度80%(高溫38.5 ℃處理除外)。當水處理18 h的所有種子均出現(xiàn)萌動(以胚部破裂露白為準)，高溫和125 μmol·L-1ABA處理的所有種子未出現(xiàn)萌動，而50 μmol·L-1ABA 處理的種子中大部分出現(xiàn)萌動時進行第一次取樣，繼續(xù)對125 μmol·L-1ABA處理的種子進行GA處理，待所有種子出現(xiàn)萌動時進行第二次取樣。取樣樣品用液氮速凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取采用TRIzol試劑盒，利用NanoVue plus儀器測定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TransGen，其他試劑均購于北京全式金公司。QPCR體系為50 μL，包括25 μL 2×GoTaqqPCR Master Mix、2 μL Forward Primer (10 μmol·L-1)、2 μL Reverse Primer (10 μmol·L-1)、2 μL模板cDNA和9 μL ddH2O。反應程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45個循環(huán)。內(nèi)參為GAPDH基因。采用2-ΔΔCt方法計算目標基因的相對表達量[26]。所用引物序列如下：

Ta-PM19-F:5′-CATGTACTAGTGCACGG ATG-3′, Ta-PM19-R: 5′-CTGCGCTAGTTTC ACTACAC-3′; Ta-GAPDH-1F: 5′-TTAGACT TGCGAAGCCAGCA-3′，Ta-GAPDH-1R:5′-A AATGCCCTTGAGGTTTCCC-3′。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，相關(guān)性分析采用Pearson模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 GI和FS表型統(tǒng)計及兩者的相關(guān)性

在Pop1中，GI平均值為0.55，變化范圍為0.01～0.98，變異系數(shù)為0.57；FS平均值為0.28，變化范圍為0～0.96，變異系數(shù)為0.29。在Pop2中，GI平均值為0.32，變化范圍為0～0.99，變異系數(shù)為0.32；FS平均值為0.10，變化范圍為0～0.82，變異系數(shù)為0.13。相關(guān)性分析表明，GI和FS在Pop1和Pop2中均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.531和0.686(表1)。說明種子休眠性是影響整穗發(fā)芽抗性的主要因素，但穗子形態(tài)以及穎殼等種子以外的其他因素對整穗發(fā)芽抗性的作用也不容忽視，采用GI和FS能夠全面準確地評價小麥穗發(fā)芽抗性。

表1 GI和FS表型在Pop1和Pop2兩類群體中的統(tǒng)計描述以及兩者相關(guān)性

**：P<0.01.

2.2 PM19-A1基因的分子檢測及其分布頻率

PM19-A1基因在供試材料中共擴增到117 bp和99 bp 兩種片段類型，即存在2種等位類型，分別命名為 PM19-A1a和 PM19-A1b。在253份小麥微核心種質(zhì)中，44份(17.4%)攜帶 PM19-A1a，209份(82.6%)攜帶 PM19-A1b；608份全國主要麥區(qū)小麥品種資源中，47份(7.7%)攜帶 PM19-A1a，561份(92.3%)攜帶 PM19-A1b；154份國外引進材料中，49份(31.8%)攜帶 PM19-A1a，105份(68.2%)攜帶 PM19-A1b(表2)。上述結(jié)果表明，相對國外材料，與高水平種子休眠相關(guān)的 PM19-A1a類型在我國小麥品種資源中分布頻率相對較低，尤其在我國現(xiàn)代品種中更低。

2.3 PM19-A1與 TaVp-1B基因不同等位類型組合與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系

TaVp-1B基因在Pop1和Pop2群體中共存在4種等位類型，分別為 TaVp-1Ba、 TaVp-1Bb、 TaVp-1Bc和 TaVp-1Bd。在Pop1中， PM19-A1與 TaVp-1B共存在5種組合類型， PM19-A1b/TaVp-1Bc分布頻率最高， PM19-A1a/TaVp-1Ba分布頻率最低；在Pop2中， PM19-A1與 TaVp-1B共存在8種組合類型， PM19-A1b/TaVp-1Ba分布頻率最高， PM19-A1a/TaVp-1Bb分布頻率最低(表2)。

進一步對 PM19-A1不同等位類型及其與 TaVp-1B 不同等位類型組合平均GI和FS進行差異顯著性分析，結(jié)果(表2)表明， PM19-A1a在Pop1和Pop2中的平均GI(0.39和0.37)和平均FS(0.24和0.08)均顯著低于 PM19-A1b(P<0.05)，說明等位基因類型 PM19-A1a與抗穗發(fā)芽相關(guān)，驗證了Barrero等[13]的結(jié)果； PM19-A1a/TaVp-1Bc在Pop1和Pop2群體中平均GI(0.38和0.28)和平均FS(0.19和0.08)均顯著低于其他組合(P<0.05)，屬于抗穗發(fā)芽等位基因組合類型，攜帶該組合的材料見表3；此外， PM19-A1a/TaVp-1Bd平均GI(0.31)和平均FS(0.03)均表現(xiàn)較低，因其僅存在于Pop2中，且分布頻率較低，有待進一步驗證。

表2 Pop1和Pop2群體中 PM19-A1及其與 TaVp-1B基因不同等位類型組合的描述統(tǒng)計以及差異顯著性分析

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示同一群體中不同類型材料間差異顯著(P<0.05)。

Different letters following dates mean significant difference among different types of materials in a population at 0.05 level.

表3 攜帶 PM19-A1a/TaVp-1Bc抗穗發(fā)芽等位類型組合的品種名稱、GI和FS表型值

2.4 PM19-A1基因的表達特性

利用定量RT-PCR分析 PM19-A1基因?qū)τ诩に谹BA和GA以及高溫的敏感性反應，結(jié)果顯示，以水處理為對照，高溫(38.5 ℃)處理大白皮和六月黃浸潤種子， PM19-A1基因的表達水平均明顯升高；經(jīng)50 μmol·L-1和125 μmol·L-1ABA處理后，大白皮中 PM19-A1基因的表達水平明顯提高，而六月黃中的表達水平變化不明顯?？傮w上， PM19-A1基因經(jīng)高濃度ABA處理后表達水平明顯較低濃度ABA處理提高。繼續(xù)對高濃度ABA處理后未萌動的種子用GA(1 mmol·L-1)處理，大白皮中 PM19-A1基因的表達水平明顯降低，而六月黃中變化不明顯(圖1)。上述結(jié)果表明，高溫和ABA均能誘導 PM19-A1基因表達上調(diào)，而GA抑制其表達，導致表達下調(diào)，不同抗性品種中該基因?qū)BA(P<0.01)以及GA(P<0.05)的敏感性反應存在顯著差異，但對高溫的敏感性反應差異不顯著。

*和**分別表示兩品種間差異在0.05和0.01水平上顯著。

* and ** represent significant difference between Liuyuehuang and Dapaipi at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

圖1 大白皮和六月黃后熟種子浸潤期間經(jīng)ABA、GA和高溫處理后 PM19-A1基因的表達變化

Fig.1 Expression changes of PM19-A1 gene treated with ABA, GA and high temperature during seeds incubation of Dabaipi and Liuyuehuang

3 討 論

小麥4AL染色體上的種子休眠主效QTL被不同學者重復鑒定，臨近分子標記在穗發(fā)芽抗性育種輔助選擇中的有效性也被進一步驗證[20-21]。Barrero等[13]克隆出該區(qū)段的候選基因 PM19-A1/A2，認為117 bp擴增片段(對應 PM19-A1a等位類型)與抗穗發(fā)芽相關(guān)，99 bp擴增片段(對應 PM19-A1b等位類型)與感穗發(fā)芽相關(guān)。本文利用該基因標記檢測了我國微核心種質(zhì)以及全國主要麥區(qū)的小麥品種資源，并結(jié)合GI和FS表型數(shù)據(jù)，進一步驗證了 PM19-A1a等位類型與抗穗發(fā)芽的關(guān)系，但其在我國小麥品種資源中的分布頻率較低，尤其在現(xiàn)代品種中分布更低，這也可能是近年來我國小麥生產(chǎn)上穗發(fā)芽抗性偏低的原因之一。

TaVp-1B基因是參與調(diào)控小麥種子休眠形成的重要轉(zhuǎn)錄因子，存在多種等位變異類型，其中 TaVp-1Ba屬于感穗發(fā)芽類型， TaVp-1Bb和 TaVp-1Bc屬于抗穗發(fā)芽類型， TaVp-1Bd與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系還不清楚[27-28]。本文利用兩類群體分析了 PM19-A1和 TaVp-1B基因不同組合類型與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系，篩選出抗穗發(fā)芽等位基因組合類型 PM19-A1a/TaVp-1Bc，且該組合中的兩種等位基因先前已分別被報道為抗穗發(fā)芽類型，更提高了本文篩選的抗穗發(fā)芽等位基因組合的可靠性。然而， PM19-A1a/TaVp-1Bb同樣屬于兩種抗穗發(fā)芽等位基因的組合，但其平均GI和平均FS均較高，說明簡單的抗穗發(fā)芽等位基因的聚合可能并不一定能得到理想中的優(yōu)異性狀，基因間的互作及其與環(huán)境的互作對于性狀的表現(xiàn)影響較大。此外， PM19-A1a/TaVp-1Bd組合的平均GI和平均FS均表現(xiàn)較低，可能屬于抗穗發(fā)芽類型，然而該組合分布頻率較低，且 TaVp-1Bd與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系先前未有相關(guān)報道，所以還需要更多材料和多年數(shù)據(jù)進一步驗證。

據(jù)資料報道，植物激素ABA和GA以及溫度對于種子休眠性的影響涉及到相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平上的變化。如Nakamura等[29]將攜帶3AS上抗穗發(fā)芽基因TaMFT的深休眠小麥品種Norin61(N61)在種子發(fā)育期間分別置于不同溫度條件下(13 ℃和25 ℃)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13 ℃時TaMFT基因的表達量比25 ℃高約4倍，N61的休眠性顯著增強，種子發(fā)芽率幾乎為0；將TaMFT基因?qū)氩怀墒斓碾x體胚瞬時表達可抑制其早熟發(fā)芽，說明種子發(fā)育期間的低溫通過誘導TaMFT基因的表達來最終增強種子休眠水平。Lei等[30]對抗穗發(fā)芽品種2174進行種子萌發(fā)期間低溫(4 ℃)、常溫(25 ℃)以及高溫(37 ℃)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫下TaMFT基因表達水平較常溫下顯著提高，而低溫下表達水平下降，說明種子萌發(fā)期間的高溫誘導TaMFT基因的表達，低溫抑制其表達，這種趨勢與高溫誘導種子休眠、低溫促進種子萌芽的趨勢相吻合。Barrero等[13]分析了 PM19-A1基因在種子發(fā)育期間(花后15、25、35和45 d)的表達特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴隨籽粒成熟以及休眠的獲得， PM19-A1基因的表達水平增加；種子發(fā)育期間的高溫抑制 PM19-A1基因表達，導致種子休眠水平下降；利用100 μmol·L-1ABA處理后，發(fā)現(xiàn)該基因表達受ABA誘導。本文利用兩個攜帶 PM19-A1a基因的載體材料大白皮和六月黃的后熟種子，分析了該基因在種子浸潤期間經(jīng)高溫以及不同濃度的ABA和GA處理后的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫和ABA同樣誘導該基因上調(diào)表達，而GA則抑制其表達上調(diào)，高濃度ABA較低濃度ABA效果更明顯；且不同抗性材料中 PM19-A1a基因?qū)τ贏BA以及GA的敏感性反應存在顯著差異，大白皮中 PM19-A1a基因?qū)BA以及GA的敏感性顯著強于六月黃，但對高溫的敏感性反應差異不顯著。該結(jié)果不僅驗證了 PM19-A1a基因是種子休眠的正調(diào)控因子這一觀點；同時也可以看出，同屬于編碼質(zhì)膜蛋白類的抗穗發(fā)芽相關(guān)基因TaMFT與 PM19-A1對于植物激素(ABA和GA)和溫度的反應特性較相似，說明溫度以及ABA對于種子休眠性的影響可能具有部分相似的調(diào)控機理。

[1]GROOS C,GAY G,PERRETANT R M,etal.Study of the relationship between pre-harvest sprouting and grain color by quantitative trait loci analysis in a white red grain bread-wheat cross [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2002,104:39.

[2]DERERA N F,BHATT G M,MCMASTER G J.On the problem of pre-harvest sprouting of wheat [J].Euphytica,1977,26(2):299.

[3]XIAO S H,ZHANG X Y,YAN C S,etal.Germplasm improvement for preharvest sprouting resistance in Chinese white-grained wheat:An overview of the current strategy [J].Euphytica,2002,126(1):35.

[4]孫果忠,肖世和.脫落酸與種子休眠[J].植物生理學通訊,2004,40(1):115.

SUN G Z,XIAO S H.Abscisic acid and seed dormancy [J].PlantPhysiologyCommunications,2004,40(1):115.

[5]WALKER-SIMMONS M K,GOLDMARK P J.ABA levels and sensitivity in developing wheat embryos of sprouting resistant and susceptible cultivars [J].PlantPhysiology,1987,84:61.

[6]UENO K.Effects of desiccation and a change in temperature on germination of immature grains of wheat (TriticumaestivumL.) [J].Euphytica,2002,126:107.

[7]趙同芳.成熟度與收獲后各種處理對小麥休眠的影響[J].植物學報,1957,6(1):80.

ZHAO T F.The influences of the maturity and various treatment after harvest on wheat seed dormancy [J].JournalofIntegrativePlantBiology,1957,6(1):80.

[8]張海萍,常 成,馮繼明,等.小麥籽粒休眠 Vp1-B1基因的等位變異檢測與分離[J].分子植物育種,2009,7(2):297.

ZHANG H P,CHANG C,FENG J M,etal.Isolation and detection of allelic variations of Vp1-B1 gene associated with seed dormancy in Chinese wheat varieties [J].MolecularPlantBreeding,2009,7(2):297.

[9]李 婷,陳 杰,陳 鋒,等.黃淮麥區(qū)地方小麥品種子粒顏色相關(guān)基因 Tamyb10-1等位變異檢測[J].植物遺傳資源學報,2014,15(5):1089.

LI T,CHEN J,CHEN F,etal.Molecular identification of the Tamyb10-1 gene controlling the grain color in landrace wheat cultivars from Huanghuai wheat region [J].JournalofPlantGeneticResources,2014,15(5):1089.

[10]LIU S B,SEHGAL S K,LI J R,etal.Cloning and characterization of a critical regulator for pre-harvest sprouting in wheat [J].Genetics,2013,195:263.

[11]ZHANG Y J,MIAO X L,XIA X C,etal.Cloning of seed dormancy genes(TaSdr) associated with tolerance to pre-harvest sprouting in common wheat and development of a functional marker [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2014,127:855.

[12]BI H H,SUN Y W,XIAO Y G,etal.Characterization of DFR allelic variations and their associations with pre-harvest sprouting resistance in a set of red-grained Chinese wheat germplasm [J].Euphytica,2014,195:197.

[13]BARRERO J M,CAVANAGH C,VERBYLA K L,etal.Transcriptomic analysis of wheat near-isogenic lines identifies PM19-A1 and A2 as candidates for a major dormancy QTL [J].GenomeBiology,2015,16:93.

[14]MARES D J,MRVA K.Mapping quantitative trait loci associated with variation in grain dormancy in Australian wheat [J].AustraliaJournalAgriculturalResearch,2001,52:1257.

[15]MARES D J,MRVA K,TAN M K,etal.Dormancy in white-grained wheat:Progress towards identification of genes and molecular markers [J].Euphytica,2002,126:47.

[16]MARES D J,MRVA K,CHEONG J,etal.A QTL located on chromosome 4A associated with dormancy in white- and red-grained wheat of diverse origin [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2005,111:1357.

[17]TORADA A,IKEGUCHI S,KOIKE M.Mapping and validation of PCR-based markers associated with a major QTL for seed dormancy in wheat [J].Euphytica,2005,143:251.

[18]OGBONNAYA F C,IMTIAZ M,YE G,etal.Genetic and QTL analysis of seed dormancy and preharvest sprouting resistance in the wheat germplasm CN10955 [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2008,116:891.

[19]CHEN C X,CAI S B,BAI G H,etal.A major QTL controlling seed dormancy and pre-harvest sprouting resistance on chromosome 4A in a Chinese wheat landrace [J].MolecularBreeding,2008,21:351.

[20]HICKEY L T,DIETERS M J,DELACY I H,etal.Screening for grain dormancy in segregating generations of dormant 3 non-dormant crosses in white-grained wheat (TriticumaestivumL.) [J].Euphytica,2010,172:183.

[21]SINGH R,HUCL P,BAGA M,etal.Validation of molecular markers for pre-harvest sprouting resistance in bread wheat R [J].CerealResearchCommunications,2012,40(2):194.

[22]RANFORD J C,BRYCE J H,MORRIS P C. PM19,a barley(HordeumvulgareL.) gene encoding a putative plasma membrane protein,is expressed during embryo development and dormancy [J].JournalofExperimentalBotany,2002,53:147.

[23]李永春,張春艷,張 寧,等.小麥質(zhì)膜蛋白基因 TaPM19-1的克隆及其對非生物脅迫的響應[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2012,45(12):2502.

LI Y C,ZHANG C Y,ZHANG N,etal.Cloning of a plasma membrane protein gene TaPM19-1 and its response to abiotic stresses in wheat [J].ScientiaAgriculturaSinica,2012,45(12):2502.

[24]張海萍,常 成,游光霞,等.中國小麥微核心種質(zhì)及地方品種籽粒休眠特性的分子標記鑒定[J].作物學報,2010,36(10):1649.

ZHANG H P,CHANG C,YOU G X,etal.Identification of molecular markers associated with seed dormancy in mini core collections of Chinese wheat and landraces [J].ActaAgronomicaSinica,2010,36(10):1649.

[25]朱玉磊,王升星,趙良俠,等.以關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘小麥整穗發(fā)芽抗性基因分子標記[J].作物學報,2014,40(10):1725.

ZHU Y L,WANG S X,ZHAO L X,etal.Exploring molecular markers of preharvest sprouting resistance gene using wheat intact spikes by association analysis [J].ActaAgronomicaSinica,2014,40(10):1725.

[26] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ctmethod [J].Methods,2001,25(4):402.

[27]YANG Y,ZHAO X L,XIA L Q.Development and validation of a Viviparous-1 STS marker for pre-harvest sprouting tolerance in Chinese wheats [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2007,115:971.

[28]XIA L Q,GANAL M W,SHEWRY P R,etal.Exploiting the diversity of Viviparous-1 gene associated with pre-harvest sprouting tolerance in European wheat varieties [J].Euphytica,2008,159:411.

[29]NAKAMURA S,ABE F,KAWAHIGASHI H,etal.A wheat homolog of MOTHER OF FT AND TFL1 acts in the regulation of germination [J].ThePlantCell,2011,23:3215.

[30]LEI L,ZHU X K,WANG S W,etal. TaMFT-A1 is associated with seed germination sensitive to temperature in winter wheat [J].PLoSOne,2013,8(9):e73330.

Detection and Validation of Molecular Marker PM19-A1 Associated With Pre-harvest Sprouting Resistance in 1 015 Wheat Varieties

CAO Xuelian, ZHANG Heng, JIANG Hao, WU Zengyun, CAO Jiajia, ZHU Yulei,WANG Shengxing, CHANG Cheng, ZHANG Haiping, MA Chuanxi

(College of Agronomy, Anhui Agricultural University/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Improvement on Southern Yellow & Huai River Valley,Ministry of Agriculture,Hefei,Anhui 230036, China)

To investigate the distribution of PM19-A1 gene associated with pre-harvest sprouting resistance in wheat germplasm resources and select excellent allele combination conferring pre-harvest sprouting resistance,1 015 wheat varieties, including 253 Chinese mini-core collections, 608 wheat varieties from major wheat regions, and 154 foreign varieties, were detected by using molecular marker PM19-A1.Seed germination index (GI) and field sprouting (FS) were tested in 540 of the 1 015 wheat varieties to validate the effectiveness of molecular marker PM19-A1 in 2015.Combined with TaVp-1B genotypes, the excellent allele combination associated with PHS resistance was selected. To investigate sensitive response of PM19-A1 gene to plant hormone ABA,GA,and high temperature, after-ripened seeds collected from wheat landraces Dahuangpi and Liuyuehuang carrying PM19-A1a allele were treated with high temperature (38.5 ℃), ABA (50 μmol·L-1and 125 μmol·L-1), and GA (1 mmol·L-1). The results showed that PM19-A1 gene contains two allelic variations ( PM19-A1a and PM19-A1b), and the average GI and FS of the varieties carrying PM19-A1a allele, associated with PHS resistance, were significantly lower than those of the varieties carrying PM19-A1b (P<0.05). The distribution frequency of PM19-A1a was 17.4%,7.7% and 31.8% in Chinese mini-core collections, wheat varieties from major wheat regions, and foreign varieties, respectively. The allelic variation combination PM19-A1a/TaVp-1Bc was significantly associated with PHS resistance. The expression level of PM19-A1 gene was significantly up-regulated by ABA and high temperature, but down-regulated by GA. The sensitive response of PM19-A1 gene to ABA (P<0.01) and GA (P<0.05) was significant in diverse wheat varieties with different levels of PHS resistance.

Wheat; Pre-harvest sprouting; Seed dormancy; PM19-A1; TaVp-1B

時間：2016-10-08

2016-03-20

2016-09-18

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-3-1)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科技專項(201203033-04)；國家自然科學基金項目(31401372)；安徽省自然科學基金項目(1408085MC60)；安徽省小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(AHCYTX-02)

E-mail：294514864@qq.com

張海萍(E-mail: zhhp20@163.com)

S512.1；S332.2

A

1009-1041(2016)10-1283-08

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