人體宮頸上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定

芮 瑞，洪 穎

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院，江蘇 南京 211100；2.南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210000)

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【女性生殖健康研究】

人體宮頸上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定

芮 瑞1，洪 穎2

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院，江蘇 南京 211100；2.南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210000)

隨著宮頸癌及癌前期疾病發(fā)病率的增加，人們對(duì)其發(fā)病機(jī)制的的研究也越來越深入。自對(duì)人宮頸癌細(xì)胞體外培養(yǎng)獲得成功后，學(xué)者對(duì)不同類型的宮頸細(xì)胞的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也相繼展開研究。通過對(duì)宮頸上皮細(xì)胞特定角蛋白及免疫標(biāo)記物的測(cè)定來鑒定是否為宮頸細(xì)胞，通過觀察培養(yǎng)出的各類型宮頸細(xì)胞的生物學(xué)特性是進(jìn)一步研究宮頸疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律從而找出治療宮頸疾病的最佳途徑。

人體宮頸上皮細(xì)胞；宮頸疾?。惑w外培養(yǎng)；鑒定

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性生殖健康的惡性疾病，美國婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)在2016年發(fā)布的第157號(hào)宮頸癌篩查指南中提出宮頸癌的發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第一位。近年來對(duì)于宮頸癌的研究有以下三方面的成果：①早在1999年，Walboomers 等提出導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的根本原因是人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染。隨后在2002年Zur Hausen指出高危型人乳頭瘤病毒對(duì)人宮頸的持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌發(fā)生的必要條件；②由于各種宮頸癌篩查方法的問世及有效開展，宮頸HPV的檢出率顯著提升，宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)病變的發(fā)生率、宮頸癌發(fā)生率和死亡率均有大幅度下降；③HPV疫苗的問世給人們帶來了福音，并在預(yù)防病毒感染的領(lǐng)域初見成效?；谝陨系难芯炕A(chǔ)，各國學(xué)者紛紛開始嘗試探索快速、有效并簡便的培養(yǎng)宮頸上皮原代細(xì)胞的方法；建立相應(yīng)的體外模型，研究宮頸癌及其上皮內(nèi)病變的生物學(xué)特性，并試圖在治療領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)更多的方法。

所謂原代培養(yǎng)，是指由體內(nèi)取出組織或細(xì)胞進(jìn)行的首次培養(yǎng)，也叫初代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)離體時(shí)間短，其遺傳性狀和體內(nèi)的細(xì)胞相似，適合做細(xì)胞形態(tài)、功能和分化等的研究。目前報(bào)道的宮頸上皮原代細(xì)胞培養(yǎng)分為3個(gè)類別：正常宮頸上皮細(xì)胞(normal cervical epithelial cell，NCC)培養(yǎng)、高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變細(xì)胞(high-grade cervical intraepithelial lesion cells，HSIL)培養(yǎng)及宮頸癌細(xì)胞(cervical cancer cell)培養(yǎng)。

1正常宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

1.1概述

正常宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)是指顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)無病理改變。子宮頸上皮由宮頸陰道部的鱗狀上皮和宮頸管柱狀上皮組成。鱗狀上皮由深至淺可分為基底帶、中層帶和淺表帶3個(gè)帶?；讕в蔁o明顯細(xì)胞增殖表現(xiàn)的基底細(xì)胞和增生活躍的旁基底細(xì)胞構(gòu)成?；准?xì)胞為儲(chǔ)備細(xì)胞，無明顯細(xì)胞增殖表現(xiàn)，在某些因素刺激下可以增生成為不典型鱗狀細(xì)胞或分化為成熟鱗狀細(xì)胞。旁基底細(xì)胞為增生活躍的細(xì)胞，偶見分裂象。中間帶與淺表帶為完全不增生的細(xì)胞，稱為成熟細(xì)胞。由于淺層的宮頸上皮細(xì)胞均為完全不增生的成熟細(xì)胞，很難培養(yǎng)成功，因此相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道很少[1]。根據(jù)文獻(xiàn)，國內(nèi)外很多學(xué)者使用胎兒宮頸上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，但由于與成人宮頸細(xì)胞的生物學(xué)特性存在差異，因而對(duì)細(xì)胞體外模型的研究受到限制。所以，很多學(xué)者想到使用有HPV感染的宮頸上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。病毒感染后細(xì)胞處于分裂增殖狀態(tài)，易于在體外培養(yǎng)成功。1989年英國劍橋大學(xué)的Stanley、1991年美國西北大學(xué)的Mary 分別報(bào)道了W12、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)-612兩種研究最為成熟的帶病毒的細(xì)胞株，為研究HPV感染的特性提供模型。也有研究表明宮頸HPV-DNA陰性的供應(yīng)組織也可以進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)[2]。

1.2早期宮頸細(xì)胞培養(yǎng)方法

宮頸上皮細(xì)胞的培養(yǎng)分為組織塊培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)，F(xiàn)reshney等在2002年提出細(xì)胞培養(yǎng)法又分為借助絲裂霉素處理的消化直接培養(yǎng)法與鈷源照射后的小鼠成纖維細(xì)胞-3T3飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法兩種。早期多采用組織塊法培養(yǎng)，由于上皮細(xì)胞貼壁困難且混有成纖維細(xì)胞以致很難培養(yǎng)出數(shù)量多、純度高的宮頸上皮細(xì)胞。1977年，Rheinwald和Green在Nature雜志上公開發(fā)表了在新生兒包皮角化上皮細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入表皮生長因子及霍亂毒素可以延遲細(xì)胞分化并促進(jìn)克隆細(xì)胞形成，使得角質(zhì)細(xì)胞可以在體外進(jìn)行分離和培養(yǎng)。該研究將人們的思路轉(zhuǎn)移到關(guān)注細(xì)胞培養(yǎng)基的改進(jìn)中去，同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。目前通用的宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法是在細(xì)胞培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)中添加氫化可的松和霍亂毒素，借助3T3細(xì)胞飼養(yǎng)層，培養(yǎng)宮頸上皮細(xì)胞。該方法細(xì)胞貼壁及生長較快，并可促進(jìn)細(xì)胞分化。眾所周知，上皮細(xì)胞在有正常濃度(10%)血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，成纖維細(xì)胞的生長速度超過了所培養(yǎng)的細(xì)胞，抑制了上皮細(xì)胞的生長，因此有人嘗試使用無血清培養(yǎng)基如角朊細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(keratin cells in serum free medium，K-SFM)或角朊細(xì)胞生長培養(yǎng)基(keratin cell growth medium，KGM)培養(yǎng)宮頸細(xì)胞。由于成纖維細(xì)胞該培在養(yǎng)基中無法很好地生長，因此培養(yǎng)出的上皮細(xì)胞純度較高，但細(xì)胞的貼壁生長較慢。Ian Freshney等在2002年的研究中發(fā)現(xiàn)，如果不利用其它介質(zhì)，很難在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)出理想的細(xì)胞。國內(nèi)江靜等(2014年)研究卻發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞在專用無血清培養(yǎng)基中不能生長[2]，但Stanley 等在2002年的研究中認(rèn)為，血清包被的培養(yǎng)瓶可以促進(jìn)細(xì)胞的貼壁。基于以上兩種觀點(diǎn)，不同培養(yǎng)基的選擇開始成為人們研究細(xì)胞培養(yǎng)的熱點(diǎn)問題。

1.3近期宮頸細(xì)胞培養(yǎng)方法

近期報(bào)道的宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)中，均選取因子宮肌瘤或子宮腺肌瘤等良性病變行全子宮切除，且宮頸細(xì)胞學(xué)檢查陰性者的宮頸組織。培養(yǎng)方法：①將組織處理后置入K-SFM培養(yǎng)基中，使用diapase II酶將宮頸上皮層與真皮層分離，取上皮組織采用胰蛋白酶消化法，得到細(xì)胞懸液，棄上清后加入K-SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所得到人宮頸上皮細(xì)胞數(shù)量多、純度高；②采用Ⅰ型膠原酶分解宮頸上皮，置入含低濃度(5%)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)至鼠膠原包被的培養(yǎng)瓶中[2]，也得到了易貼壁、純度高的宮頸細(xì)胞；③使用diapase Ⅱ酶及胰酶聯(lián)合消化后得到細(xì)胞懸液，棄上清，加入K-SFM培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)至FBS包被的培養(yǎng)瓶，另加入DMEM或1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入K-SFM培養(yǎng)基+含F(xiàn)BS培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的成功率高于DMEM或1640培養(yǎng)基。

1.4宮頸上皮細(xì)胞鑒定

一般對(duì)培養(yǎng)出的宮頸細(xì)胞采取免疫組織化學(xué)和細(xì)胞免疫熒光的方法來證實(shí)其為宮頸上皮細(xì)胞。在上述培養(yǎng)方法①中，進(jìn)行細(xì)胞免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞角蛋白(keratin，K)陽性率(見圖1和圖2)與波形蛋白(vimentin)陰性率均高于90%。方法②中采用測(cè)定宮頸上皮基層角蛋白的方式進(jìn)行鑒定。K5和K19主要表達(dá)于增生活躍的體外培養(yǎng)的細(xì)胞中[1]，Stanley等在2002年的研究中發(fā)現(xiàn)K5和K14在正常宮頸細(xì)胞中均有表達(dá)。通過免疫熒光的手段測(cè)出K5弱陽性，K14、K19陽性(見圖3)[2]。方法③中行免疫組化，測(cè)鼠抗人E-鈣黏蛋白(E-cadherin)陽性和波形蛋白陰性(見圖4和圖5)。

圖1 角蛋白陽性的宮頸上皮細(xì)胞(200×)

圖2 角蛋白陽性的宮頸上皮細(xì)胞(400×)

注：5A：K5弱陽性；5B：K14強(qiáng)陽性；5C：K19強(qiáng)陽性

圖3 宮頸上皮角蛋白免疫熒光染色[2]

Fig.3 Immunofluorescence staining of cervical epithelial keratin

圖4 原代宮頸細(xì)胞E-cadherin染色陽性(400×)

Fig.4 Primary cervical cell E-cadherin staining was positive

圖5 原代宮頸細(xì)胞vimentin染色陽性 (400×)

Fig.5 Primary cervical cell vimentin staining was positive

2高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

2.1概述

CIN是與子宮頸浸潤癌密切相關(guān)的一組子宮頸病變，包括鱗狀上皮和腺上皮，分為Ⅰ～Ⅲ級(jí)。其中CINⅠ為低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變(low-grade cervical intraepithelial lesions cells，LSIL)，約60%會(huì)自然消退。CINⅡ～Ⅲ為高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變(HSIL)。對(duì)CINⅡ的最新認(rèn)識(shí)指出它不是CINⅠ和CINⅢ的中間類型，而似乎反映了低級(jí)別和高級(jí)別病變共同混合作用的結(jié)果[3]。在一組未經(jīng)治療的CINⅢ患者隊(duì)列中，跟蹤隨訪30年發(fā)現(xiàn)浸潤癌累計(jì)發(fā)生率為30.1%，證明CINⅢ有進(jìn)展為癌的明確風(fēng)險(xiǎn)[3]。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)

在現(xiàn)有的文獻(xiàn)中報(bào)道，目前對(duì)于高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變細(xì)胞培養(yǎng)的研究并不成熟。到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)有為數(shù)不多的文獻(xiàn)對(duì)CIN細(xì)胞的分離和培養(yǎng)進(jìn)行了描述。根據(jù)文獻(xiàn)，培養(yǎng)的細(xì)胞來源于宮頸上皮內(nèi)病變的細(xì)胞，其中HPV的感染率較高。2002年報(bào)道的Stanley的“組織塊培養(yǎng)法”，是對(duì)整塊病變組織在顯微鏡下分割后放入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，收集長出的角質(zhì)細(xì)胞接種到滅活的3T3飼養(yǎng)層上。Coolen 等在2007年研究中指出，該方法培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)量較多，但培養(yǎng)時(shí)間長，有病毒感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。2012年，Bononi等將宮頸上皮內(nèi)病變組織用diapase Ⅱ酶消化后接種到含有10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中，與成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)，稱之為“消化酶”法[1]。此種方法的不足之處在于過程復(fù)雜、易污染、時(shí)間長。在其文章中提出細(xì)胞的二次收集和接種是有效增加細(xì)胞貼壁率的方法[1]。Liu等[4]報(bào)道了采用鼠尾膠原包被培養(yǎng)瓶及低濃度濃度血清培養(yǎng)基(K-SFM+5%FBS)方法培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞純化，其培養(yǎng)方法同正常宮頸細(xì)胞。消化后的CIN組織不需要使用篩網(wǎng)過濾，因此得到的細(xì)胞數(shù)量多于正常宮頸細(xì)胞[4]。

2.3細(xì)胞鑒定

在培養(yǎng)前后采用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)對(duì)高危型HPV進(jìn)行分型檢測(cè)，以判斷培養(yǎng)出的細(xì)胞是否來源于宮頸上皮。同時(shí)采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)K14、K19，方法同NCC細(xì)胞。高級(jí)別CIN細(xì)胞和Hela細(xì)胞的特殊標(biāo)記物K17和P63在NCC細(xì)胞中均表達(dá)陰性結(jié)果，因此很容易鑒定細(xì)胞的符合情況[6]。

3宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

3.1概述

相對(duì)于前兩種宮頸細(xì)胞而言，宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng)已經(jīng)是一項(xiàng)非常成熟的技術(shù)，很多實(shí)驗(yàn)室都已經(jīng)生產(chǎn)出不同類型的宮頸癌細(xì)胞株，用于宮頸癌體外模型的研究。人子宮頸癌細(xì)胞(Hela)是第一個(gè)來自人體組織經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)獲得的非整倍體上皮樣細(xì)胞系。65年前，Gey等從31歲女性黑人的宮頸癌組織建中獲得建立。經(jīng)原始組織切片重新觀察，Jones等將其診斷為腺癌。已知該細(xì)胞系含有HPV18序列，該細(xì)胞角蛋白陽性，p53表達(dá)量較低，但表達(dá)正常水平的pRB。人子宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa建自一個(gè)日本病人的外科手術(shù)的原位組織樣品，癌基因：PRB和p53陽性。

3.2培養(yǎng)方法

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各個(gè)國家都有對(duì)于宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行改進(jìn)，以便探索一種簡單、重復(fù)性好的培養(yǎng)方式。其中我國近期張璐(2012年)報(bào)道的培養(yǎng)方法是將宮頸癌組織經(jīng)胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶消化，加入10%FBS血清的DMEM，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶。另一種方法在上述基礎(chǔ)上再加入15%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，后接種至培養(yǎng)瓶中免疫。兩種方法熒光染色宮頸癌細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CK17表達(dá)呈陽性從而鑒定該細(xì)胞為宮頸癌細(xì)胞。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，S期細(xì)胞比率可以作為監(jiān)測(cè)一些惡性腫瘤生物學(xué)行為的有效指標(biāo)，在診斷及預(yù)后中有重要的價(jià)值[5-7]。因此Liu等[4]采用流式細(xì)胞技術(shù)監(jiān)測(cè)NCC細(xì)胞、CIN細(xì)胞及宮頸癌Caski細(xì)胞各DNA周期的相應(yīng)指標(biāo)：增殖指數(shù)(proliferative index，PI)和S期細(xì)胞比率(S-phase fraction，SPF)，最終發(fā)現(xiàn)可能S期細(xì)胞比率較增殖指數(shù)意義更加重要。馮定慶等(2010年)宮頸癌干細(xì)胞的培養(yǎng)中將消化好的宮頸癌組織置于腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng)液，也就是DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液，也得到了很好的貼壁及傳代。由于宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相對(duì)成熟，實(shí)際上對(duì)于體外宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的研究多于不同培養(yǎng)方法的研究。胰蛋白酶與I型膠原酶聯(lián)合消化的方式已經(jīng)成為不同宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)的共同步驟，不同之處在于培養(yǎng)基的選擇有些區(qū)別。

3.3鑒定

細(xì)胞黏附分子CD44和子宮頸干細(xì)胞分子標(biāo)志物CK17陽性已經(jīng)成為體外宮頸癌細(xì)胞的統(tǒng)一鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，根據(jù)文獻(xiàn)，宮頸細(xì)胞培養(yǎng)方法的研究主要在于正常宮頸上皮細(xì)胞、HPV感染的宮頸細(xì)胞及高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變細(xì)胞。標(biāo)本使用酶消化后接種于正常血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、鼠膠原包被瓶其中的一種或兩種。測(cè)定細(xì)胞特定角蛋白來鑒定為宮頸細(xì)胞。而對(duì)宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng)已經(jīng)成熟，使用DMEM或DMEM-F12培養(yǎng)基，測(cè)定CD44和CK17進(jìn)行鑒定?，F(xiàn)階段不同類型的體外宮頸細(xì)胞培養(yǎng)模型建立，方便了人們了解宮頸癌發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，為研究宮頸癌及其上皮內(nèi)病變提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，若單一HPV感染宮頸細(xì)胞培養(yǎng)成功并能大量傳代而不改變其生物學(xué)特性，則對(duì)抗HPV藥物的研究起到關(guān)鍵的作用，同時(shí)也給基因治療帶來希望。由于減少了病患依從性差而導(dǎo)致的數(shù)據(jù)偏差，利于進(jìn)一步研究其預(yù)防措施及分析預(yù)后，為宮頸疾病的研究及治療提供切實(shí)可行的理論依據(jù)。

[1]Bononi I, Bosi S, Bonaccorsi G,etal. Establishment of keratinocyte colonies from small-sized cervical intraepithelial neoplasia specimens[J].J Cell Physiol,2012,227(12):3787-3795.

[2]Liu Y Z, Lü X P, Pan Z X,etal.Establishment of a novel method for primary culture of normal human cervical keratinocytes[J].Chin Med J (Engl),2013,126(17):3344-3347.

[3]American College of Obstetricians and Gynecologists.Practice Bulletin No. 157: Cervical Cancer Screening and Prevention[J].Obstet Gynecol,2016,127(1):e1-e20.

[4]Liu Y Z,Wang T T,Zhang Y Z.A modified method for the culture of naturally HPV-infected high-grade cervical intraepithelial neoplasia keratinocytes from human neoplastic cervical biopsies[J].Oncol Lett,2016,11(2):1457-1462.

[5]Pinto A E,Silva G L,Pereria T,etal.S-phase fraction and ploidy as predictive markers in primary disease and recurrence of papillary thyroid carcinoma[J].Clin Endocrinol(Oxf),2012,77(2):302-309.

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[7]Pinto A E,Pires A,Sliva G,etal.Ploidy and S-phase fraction as predictive markers of response to radiotherapy in cervical cancer[J].Pathol Res Pract,2011,207(10):623-627.

[專業(yè)責(zé)任編輯：安瑞芳]

Culture and identification of human cervical epithelial cells in vitro

RUI Rui1, HONG Ying2

(1. Nanjing Medical University Affiliated Sir Run Run Hospital, Jiangsu Nanjing 211100, China;2. Nanjing University Affiliated Drum Tower Hospital, Jiangsu Nanjing 210000, China)

With increasing of the incidence of cervical cancer and precancerous diseases, the researches on their pathogenesis become more and more deeply. Since the successful culture of human cervical cancer cell in vitro, researchers have studied on culture of different types of cervical cells in vitro one after another. Specific keratin and immune markers of cervical epithelial cells are valuated to determine whether they are cervical cells. Observing the biological characteristics of different kinds of cultured cervical cells is the best way to explore the pathogenesis of cervical diseases and then to cure cervical diseases.

human cervical epithelial cells, cervical disease; in vitro culture; identification

2016-10-11

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展資助項(xiàng)目(YKK14079)；江蘇省科技廳科技支撐計(jì)劃-社會(huì)發(fā)展資助項(xiàng)目(BE2012606)；國家衛(wèi)生計(jì)生委科教司2015年公益性行業(yè)科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(201502004)。

芮 瑞(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事HPV感染人宮頸上皮細(xì)胞的研究。

洪 穎，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.040

R711.7

A

1673-5293(2016)10-1286-04