Skp2和PTEN在上皮性卵巢腫瘤組織中的表達及臨床意義

張 芳，唐 密，王建輝

(湖南省婦幼保健院，湖南 長沙 410008)

?

Skp2和PTEN在上皮性卵巢腫瘤組織中的表達及臨床意義

張 芳，唐 密，王建輝

(湖南省婦幼保健院，湖南 長沙 410008)

目的 研究S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)和PTEN蛋白在上皮性卵巢腫瘤組織中表達，探討其臨床病理學意義及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用。方法 收集129例上皮性卵巢腫瘤石蠟標本(良性35例、交界性32例、惡性62例)，免疫組化法檢測Skp2 及PTEN蛋白的表達水平，分析兩者表達、臨床病理參數(shù)關(guān)系及其相互關(guān)系。結(jié)果 ①Skp2在良性及交界性腫瘤中表達陰性，分別為(0/35，0/32)，在卵巢癌中陽性率40.32%(25/62)，其在卵巢癌表達水平明顯高于良性和交界性腫瘤(χ2值分別為8.25、6.72，均P<0.05)；②PTEN蛋白在良性及交界性腫瘤陽性率分別為82.86%(29/35)、59.38%(19/32)，在卵巢癌陽性率40.32%(25/62)，明顯低于良性和交界性腫瘤(χ2值分別為11.15、9.23，均P<0.05)；③Skp2、PTEN蛋白在卵巢癌的表達在不同年齡、是否絕經(jīng)及不同組織學類型中無顯著性差異(χ2值分別為1.01、0.04、0.21，P>0.05)。Skp2在卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2值分別為10.05、11.21、8.54，均P<0.05)，PTEN在卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達低于Ⅰ～Ⅱ期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2值分別為8.23、12.15、7.65，均P<0.05)；④Skp2和PTEN蛋白在卵巢癌中的表達呈負相關(guān)(r=-0.321，P<0.05)。結(jié)論 Skp2表達上調(diào)與PTEN下調(diào)可能在上皮性卵巢腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。檢測Skp2和PTEN表達水平可能對卵巢癌預后分析有一定指導意義。

S期激酶相關(guān)蛋白2；PTEN蛋白；上皮性卵巢癌組織；免疫組化

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官最常見腫瘤之一，由于病因不明，缺乏早期癥狀及特異性腫瘤標志物，故難以早發(fā)現(xiàn)、早治療，死亡率一直高居婦科惡性腫瘤之首。近年隨著腫瘤分子遺傳學和分子生物學的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)基因變異、蛋白表達異常是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。本實驗應(yīng)用免疫組化方法研究S期激酶相關(guān)蛋白2(s.phaseklnase-associatedprotein-2，Skp2)和PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen，PTEN)蛋白在卵巢上皮性腫瘤(良性、交界性、惡性)的表達，分析其表達水平與卵巢癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，探討兩者在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相互間關(guān)系。

1材料與方法

1.1臨床資料

選取湖南省婦幼保健院2008年1月至2013年9月上皮性卵巢腫瘤標本存檔蠟塊129例，患者年齡21～71歲，中位年齡54歲，術(shù)前未行化療、放療，術(shù)后經(jīng)病理確診。其中良性腫瘤35例(漿液性囊腺瘤21例，粘液性囊腺瘤14例)，交界性腫瘤32例(交界性漿液性囊腺瘤23例，交界性粘液性囊腺瘤9例)，上皮性卵巢癌62例。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(international fedration of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO)分期世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)分化標準：Ⅰ期9例，Ⅱ期10例，Ⅲ期36例，Ⅳ期7例，其中漿液性囊腺癌39例(G1：19例，G2：16例，G3或G 4： 4例)，粘液性囊腺癌10例(G1：4例，G2：4例，G3或G 4：2例)，子宮內(nèi)膜樣癌7例(G1：2例，G2：3例，G3或G 4： 2例)， 透明細胞癌6例(G1：2例，G2：3例，G3或G 4：1例)，常規(guī)固定、包埋，行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)和免疫組織化學染色。

1.2主要試劑

一抗Skp2鼠抗人單克隆抗體(濃度為1：50)購自美國Zymed公司， PTEN鼠抗人單克隆抗體(濃度為1：100)、DAB顯色液購自上海瑞奇生物科技有限公司。

1.3方法

采用S-P 免疫組化，操作嚴格按說明書進行。陰性對照以PBS代替一抗作空白對照，陽性對照用己知陽性片為對照。判斷標準為Skp2和PTEN均以細胞核出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性。病變處隨機選取至少5；(+)：陽性細胞數(shù)5%～49%；(++)：陽性細胞數(shù)≥50%，由兩位有經(jīng)驗病理醫(yī)師雙盲法進行評估。

1.4統(tǒng)計學方法

使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。率的比較采用χ2檢驗和Fisher精確概率法，相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1S期激酶相關(guān)蛋白2、PTEN蛋白在良性、交界性、上皮性卵巢癌組織中表達

Skp2在良性及交界性腫瘤中表達陰性，在卵巢癌中陽性率40.32%(25/62)，表達水平顯著高于良性(χ2=8.25，P<0.05)和交界性腫瘤(χ2=6.72，P<0.05)。良性、交界性及卵巢癌組中PTEN蛋白陽性表達率分別為82.86%(29/35)、59.38%(19/32)和40.32%(25/62)?？ǚ綑z驗組間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.626，P=0.00)，見圖1、圖2和表1。

組織類型例數(shù) Skp2 陰性陽性陽性率(%)P PTEN 陰性陽性陽性率(%)P良性3535000.169①62982.860.008①交界性3232000.041②131959.380.029②惡性62372540.30.035③372540.320.041③

注：①表示良性卵巢腫瘤與交界性上皮性卵巢腫瘤比較；②表示交界性上皮性卵巢腫瘤和卵巢上皮性癌比較；③表示卵巢上皮性癌與良性卵巢腫瘤比較。

2.2 S期激酶相關(guān)蛋白2、PTEN蛋白表達與上皮性卵巢癌臨床病理關(guān)系

Skp2、PTEN在卵巢癌中表達與患者年齡、是否絕經(jīng)及組織類型無明顯關(guān)系(χ2值分別為1.01、0.04、0.21，均P>0.05)，而與分期、組織分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(χ2值分別為12.05、9.65、7.98，均P<0.05)，Skp2在Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率分別(55.81%，74.29%，68.75%)，明顯高于I～II期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(21.05%，37.03%，47.73%)(χ2值分別為10.05、11.21、8.54，均P<0.05)。而PTEN則相反，在Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率(39.53%，31.43%，43.75%)明顯低于Ⅰ～Ⅱ期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(68.42%，44.44%，59.09%)(χ2值分別為8.23、12.15、7.65，均P<0.05)，見表2。

表2 Skp2 PTEN蛋白表達與上皮性卵巢癌臨床病理的關(guān)系(n)

Table 2 Expressions of Skp2 and PTEN and their clinicopathologic relationship with epithelial ovarian cancer(n)

臨床指標例數(shù) Skp2 陰性陽性陽性率(%)P PTEN 陰性陽性陽性率(%)P年齡(歲)0.0610.070 ≥5042202252.38231945.24 <502011945.0091155.00是否絕經(jīng)0.0580.052 是44242045.45271738.64 否1810844.4412633.33臨床分期0.0340.039 Ⅰ～Ⅱ期1915421.0561368.42 Ⅲ～Ⅳ期43192455.81261739.53組織學類型0.0580.062 漿液性囊腺癌39192048.72192048.72 粘液性囊腺癌105550.006440.00 子宮內(nèi)膜樣癌74342.863457.14 透明細胞癌64233.333350.00組織分化0.0260.036 高分化27171037.03151244.44 中低分化3592674.29241131.43淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.0380.029 無44232147.73182659.09 有1651168.759743.75

2.3 S期激酶相關(guān)蛋白2、PTEN蛋白表達在卵巢上皮性癌中的相關(guān)性

對62例卵巢上皮性癌中Skp2和PTEN的表達率進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示Skp2與PTEN的表達呈顯著負相關(guān)(r=-0.321，P<0.05)。

3討論

隨著分子生物學、細胞信號傳導通路的深入研究，認為腫瘤發(fā)生均為細胞周期調(diào)控機制紊亂，細胞惡性克隆。本研究通過免疫組化方法，檢測卵巢上皮性腫瘤的Skp2和PTEN蛋白表達，分析兩者與臨床病理因素間關(guān)系及表達相關(guān)性，探討其在卵巢癌發(fā)生進展過程中的作用。

3.1 S期激酶相關(guān)蛋白2在卵巢上皮性癌中的表達及意義

F-box蛋白Skp2由zhang等1995年首次克隆，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)注射P45抗體或反義寡核酸能阻斷P45功能，阻止細胞進入S期，因其可與細胞周期蛋白CyclinA相互作用，從而被命名為Skp2。Skp2基因定位于人5號染色體短臂上，由436個氨基酸殘基構(gòu)成。

細胞周期指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為五期：即G0期(靜息期)，G1(DNA合成前期)，S(DNA合成期)，G2(DNA合成后期)，M(有絲分裂期)?？刂萍毎至堰^程主要有兩個限制點，即G1/S點(控制細胞從G1期進入S期，)和G2/M點(細胞一分為二的控制點)。Skp2正常表達時，細胞在分裂時的G1/S期CKI-P27kipl泛素化降解過程可正常進行[1-2]。但若Skp2蛋白過度表達，則細胞無限制通過G1/S期“限制點”，導致細胞無限制分裂， 最終形成惡性克隆。因此，Skp2過度表達與癌發(fā)生密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示在卵巢良性、交界性腫瘤組中，Skp2表達均為陰性，而在惡性組中卻有不同程度的表達(25/62)，兩者比較有顯著差異。其次，Skp2表達與年齡、組織學分型無顯著性相關(guān)(P>0.05)，卻與卵巢癌的病理分級、臨床分期有密切關(guān)系。在不同臨床分期、組織分化及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。提示臨床期別越晚，組織分化越差，Skp2過度表達，細胞分裂無限制通過“限制點”，形成惡性增殖，最終促進卵巢癌的發(fā)生與進展。

3.2PTEN在上皮性卵巢癌中的表達及意義

Li等于1997年研究原發(fā)性乳腺癌第10q23染色體的同源性丟失區(qū)，分離得到一種新的基因，命名為PTEN。PTEN全長約200kb，含有9個外顯子和8個內(nèi)含子。研究發(fā)現(xiàn)PTEN可使PIP3脫3`磷酸，喪失PIP3第二信使作用，抑制PI3K/AKT信號傳導通路，使細胞有絲分裂阻滯在Gl期，因此與腫瘤發(fā)生、進展關(guān)系密切[3]。Schondorf等2003年對20例原發(fā)卵巢癌及復發(fā)病例進行研究，結(jié)果顯示，PTEN隨卵巢癌病理分級、臨床分期，表達水平逐漸下降，提示PTEN表達與細胞分化程度密切相關(guān)。Martins等[4]研究也得出同樣結(jié)論。本實驗通過測定PTEN表達，發(fā)現(xiàn)正常卵巢組織中陽性表達率顯著高于癌組織。推測這種表達缺失可能是卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)。本實驗顯示PTEN在Ⅲ～Ⅳ期、中低分化組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率(39.53%，31.43%，43.75%)明顯低于I～II期、高分化組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(68.42%，44.44%，59.09%)(P<0.05)，考慮與PTEN對腫瘤細胞增殖抑制作用有關(guān)，說明PTEN基因表達降低使其抑制細胞惡性克隆的能力下降，從而促進卵巢癌的發(fā)生。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌組織中PTEN蛋白陽性表達率顯著降低，顯示PTEN表達水平下降與腫瘤細胞浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

3.3卵巢上皮性癌中S期激酶相關(guān)蛋白2與PTEN蛋白表達的相關(guān)性

Lotan 等[5]對108例前列腺癌進行研究，發(fā)現(xiàn)抑癌基因PTEN與Skp2明顯負相關(guān)，推測PTEN對Skp2表達有負調(diào)節(jié)作用。本實驗中卵巢癌Skp2與PTEN表達呈負相關(guān)(P<0.05)，研究結(jié)論與上述文獻一致，Skp2表達越高，則PTEN表達相應(yīng)降低，推測卵巢癌Skp2表達升高與PTEN表達缺失及突變有關(guān)，可能Skp2過度表達促進了p27的泛素化降解，使p27表達降低，從而失去對細胞周期的調(diào)控，二者共同作用促進了卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。

總之，Skp2高表達和PTEN的低表達在卵巢上皮性癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PTEN和Skp2蛋白聯(lián)合檢測有助于臨床判斷卵巢癌惡性程度。但Skp2與PTEN的表達之間是否還存在分子細胞水平調(diào)控還有待深入研究。近年有學者提出，可將抑制Skp2、同時上調(diào)PTEN蛋白表達作為腫瘤治療的新靶點，但其能否有效用于臨床治療還有待于進一步探索、研究。

[1]Chan C H,Morrow J K,Li,C F,etal.Pharmacological inactivation of Skp2 SCF ubiquitin ligase restricts cancer stem cell traits and cancer progression[J].Cell,2013,154(3):556-568.

[2]Nogueira V,Sundararajan D,Kwan J M,etal.Akt-dependent Skp2 mRNA translation is required for exiting contact inhibition,oncogenesis,and adipogenesis[J].EMBO J,2012,31(5):1 134-1 146.

[3]Wu K L,Wu C A,Wu C W,etal.Redox-sensitive oxidation and phosphorylation of PTEN contribute to enhanced activation of PI3K/Akt signaling in rostral ventrolateral medulla and neurogenic hypertension in spontaneously hypertensive rats[J].Antioxid Redox Signal,2013,18(1):36-50.

[4]Martins F C,Santiago Id, Trinh A,etal.Combined image and genomic analysis of high-grade serous ovarian cancer reveals PTEN loss as a common driver event and prognostic classifier[J].Genome Biol,2014,15(12): 526.

[5]Lotan T L, Gurel B, Sutcliffe S,etal.PTEN protein loss by immunostaining: analytic validation and prognostic indicator for a high risk surgical cohort of prostate cancer patients[J].Clin Cancer Res,2011,17(20):6563-6573.

[專業(yè)責任編輯：張冠軍]

Expressions of Skp2 and PTEN in epithelial ovarian tumors and their clinical significance

ZHANG Fang, TANG Mi, WANG Jian-hui

(Maternal and Child Health Hospital of Hunan Province, Hunan Changsha 410008, China)

Objective To investigate the expressions of Skp2 and PTEN in epithelial ovarian tumors and explore their clinicopathologic significance as well as the role in genesis of tumor. Methods Skp2 and PTEN protein expressions were examined by immunohistochemistry in 129 epithelial ovarian tumors (35 cases of adenomas, 32 cases of tumors of borderline, and 62 cases of denocarcinomas. The expressions of two, clinicopathologic parameters and their relationship were analyzed. Results Positive rate of Skp2 both in ovarian adenoma and borderline adenoma was 0 (0/35, 0/32), and the positive rate in ovarian adenocarcinoma was 40.32% (25/62), which was significantly higher than in ovarian adenoma and borderline adenoma (χ2value was 8.25 and 6.72, respectively, bothP<0.05). Positive rate of PTEN in ovarian adenoma and borderline adenoma was 82.86% (29/35) and 59.38% (19/32), respectively, and that in ovarian adenocarcinoma was 40.32% (25/62), which was significantly lower than in ovarian adenoma and borderline adenoma (χ2value was 11.15 and 9.23, respectively, bothP<0.05). The expression levels of Skp2 and PTEN were independent of age, menopause and histological type (χ2value was 1.01, 0.04 and 0.21, respectively, allP>0.05). The expression of Skp2 was remarkably higher in ovarian cancer at Ⅲ-Ⅳ stage, moderately and poorly differentiated group and lymph node metastasis group than in ovarian cancer at Ⅰ-Ⅱ stage, higher differentiated group and no lymph node metastasis group (χ2value was 10.05, 11.21 and 8.54, respectively, allP<0.05), but PTEN was lower (χ2value was 8.23, 12.15 and 7.65, respectively, allP<0.05). The expression of Skp2 was negatively correlated with that of PTEN (r=-0.321,P<0.05). Conclusion Up-regulation of Skp2 and down-regulation of PTEN may play an important role in the genesis and development of epithelial ovarian tumors. Detecting the expression levels of Skp2 and PTEN might have value on analyzing the prognosis of ovarian cancer.

s.phaseklnase-associatedprotein-2 (Skp2); phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen (PTEN); epithelial ovarian cancer; immunohistochemistry

2016-08-22

張 芳(1973-)，女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事婦科臨床工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.017

R711.7

A

1673-5293(2016)10-1217-04