牛膝多糖體外對豬外周血淋巴細胞增殖的研究

陳春

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

牛膝多糖體外對豬外周血淋巴細胞增殖的研究

陳春

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

本試驗研究牛膝多糖（ABP）體外對豬外周血淋巴細胞增殖的影響。在培養(yǎng)體系中分別添加不同濃度的ABP（0，100，200，300，400，500ug/mL），采用四唑鹽（MTT）法測定外周血淋巴細胞的增殖。研究結果表明：不同濃度的ABP均能直接顯著促進豬外周血淋巴細胞的增殖（P＜0.05），且其作用有一定的劑量依賴關系。

牛膝多糖；外周血淋巴細胞；豬

牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharide，ABP）是從牛膝根(Achyranthes bidentata B1)中提取、分離、純化得到的一種小分子水溶性的多糖化合物。近年來國際國內對ABP進行大量的研究，結果表明，ABP是一種免疫調節(jié)劑,具有抗腫瘤、抗衰老、抗病毒和多種免疫調節(jié)作用。但是有關ABP對仔豬外周血淋巴細胞增殖的影響報道較少，外周血淋巴細胞增殖是反應動物細胞免疫的一個重要指標，測定淋巴細胞增殖效果是研究機體細胞免疫功能的重要手段之一。通過ABP直接對豬外周血淋巴細胞增殖的影響，為進一步開展ABP提高仔豬免疫功能的機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及材料胎牛血清；淋巴細胞分離液；RPMI-1640培養(yǎng)基；細胞培養(yǎng)板，細胞計數(shù)板，0.22μm微孔濾膜抽濾器；其它試劑均為分析純；牛膝多糖（含多糖97%）。

1.1.2 主要試劑的配制D－Hank’s平衡鹽：分別稱取8.00g NaCl、0.40g KCl、0.06g KH2PO4、0.35gNaHCO3、0.08g Na2HPO4·H2O、1.00g葡萄糖，加入三蒸水1000mL溶解，調pH至7.2～7.4，8磅15 min高壓蒸汽消毒滅菌，冷卻后無菌條件下分裝，4℃冰箱內保存?zhèn)溆酶邏合荆庞?℃冰箱中保存?zhèn)溆弥饌€溶解于800mL蒸餾水中。

肝素抗凝劑：稱取7.15mg肝素鈉粉末，溶于10mL生理鹽水中，抽濾即得10 000U/mL母液。

抗菌素液（雙抗）：稱取青霉素鈉62.5mg（160IU/mg），硫酸鏈霉素鈉100mg，溶于10mL滅菌的Hank’s液中，抽濾，得到含青霉素、鏈霉素分別為10000IU/mL和10000μg/mL的雙抗母液。

4%的臺盼藍母液：稱取4g臺盼藍，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100mL，用濾紙過濾，4℃保存。使用時用PBS稀釋至0.4%。

RPMI-1640完全培養(yǎng)基：87%RPMI-1640+1%雙抗母液＋10%胎牛血清，用5.6%的無菌NaHCO3調其pH至7.2～7.4。

四唑鹽（MTT）溶液（5mg/mL）：50mg MTT，用10mL三蒸水溶解，抽濾；PHA母液（500μg/mL）：5mgPHA，用10mL RPMI-1640溶解，抽濾，分裝備用；甲瓚裂解液：于200mL體積分數(shù)為50%二甲基甲酰胺（DMF）溶液中緩慢加入十二烷基硫酸鈉（SDS）28g，磁力攪拌器充分溶解后，普通濾紙過濾，用pH調節(jié)混合液調pH至4.7。

1.1.3 主要儀器酶聯(lián)免疫檢測儀，倒置顯微鏡, 5%CO2培養(yǎng)箱，立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計隨機選取一頭體重約10kg的健康杜×長×大，前腔靜脈采血，分離淋巴細胞，然后按以下設計進行體外培養(yǎng)。實驗組（100μg/mLABP，200μg/mLABP，300μg/mLABP，400μg/mLABP，500 μg/mLABP，空白組設6個組，每個處理設7個重復。

1.2.2 采用MTT法測定外周血淋巴細胞增殖

1.2.2.1 分離外周血淋巴細胞取肝素抗凝血（含肝素20U/mL）10mL，與等量的D-Hank’s液混勻，按1:1緩慢加于淋巴細胞分離液上，25℃2500r/min離心20min，吸取中間白細胞層，然后按1mL血加5 mL紅細胞裂解液，靜置5min，1500r/min離心10 min，棄上清，再用D-Hank’s洗滌2次，棄上清，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%雙抗）洗滌1次，離心，棄上清，最后用RPMI-1640完全培養(yǎng)基吹打成懸液。

1.2.2.2 淋巴細胞成活率測定及細胞計數(shù)

（1）計數(shù)板：用無水酒精或95%酒精清潔計數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。把蓋玻片覆蓋在計數(shù)板上，使之微微移向一側，露出計數(shù)板面少許，以滴加細胞懸液。

（2）染色：取吸管1支，深入淋巴細胞懸液中，輕輕反復吹打淋巴細胞懸液，使淋巴細胞重懸均勻后，立即吸取淋巴細胞懸液少許，向另一干凈離心管內滴入細胞懸液9滴，再滴入0.4%臺盼藍染液1滴，混勻，放置2～3min。

（3）加懸液：把計數(shù)板平放在顯微鏡臺上，立即從計數(shù)板邊緣輕輕滴入1～2滴已染色的細胞懸液，使之充滿計數(shù)板和蓋玻片間隙。

（4）計數(shù)：在顯微鏡下，用10×物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)，細胞壓中線時，只計左側和上方，不計右側和下方。

（5）計算：原細胞懸液的細胞濃度（個/mL）=

（6）鏡下觀察細胞對臺盼藍染液的排斥情況：細胞胞體透亮的，表明其活力良好；細胞胞體藍染的，則視為死亡。在鏡下數(shù)200個細胞，計算活力良好的百分比，細胞活力大于95%者用于細胞培養(yǎng)。

1.2.2.3 淋巴細胞的接種培養(yǎng)及MTT法測定通過計數(shù)得知懸液中淋巴細胞數(shù)后，用完全培養(yǎng)基調整細胞數(shù)為2×106/mL，除空白組外，每孔加入淋巴細胞懸液50μL，然后按試驗設計每孔分別加入含不同濃度ABP，即每孔最終體積為100μL，最終細胞濃度為1×106個/mL，空白調零其它每孔加入100μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基。置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)44h。每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h，然后每孔加入100μL 14%SDS-50%DMF溶液，繼續(xù)孵育2h，選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，即OD570。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS（V8）統(tǒng)計軟件進行了單因子方差分析，經單因子方差分析差異性顯著的再利用LSD法進行多重比較，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

表1 ABP對豬外周血淋巴細胞增殖的影響

通過MTT試驗測出外周血淋細胞在5種不同濃度牛膝多糖中的吸光度值如表1，各濃度組與對照組比較,可以看出細胞中添加牛膝多糖均不同程度的促進外周血淋細胞的增值（P＜0.0001）。5個牛膝多糖組除了200μg/mLABP組外，基本上是隨著ABP的增加，外周血淋巴細胞增殖加強。

3 討論

淋巴細胞增殖是機體細胞免疫水平的一個重要評判指標，大量的研究表明ABP能促進淋巴細胞的增殖，李宗楷等研究發(fā)現(xiàn)ABP能提高老年鼠T淋巴細胞的增殖。陳清華等研究ABP添加在飼糧中，可以顯著提高仔豬外周血淋巴細胞轉化率。季敬璋等發(fā)現(xiàn)ABP能誘導人T細胞分泌γ干擾素（IFN-γ），并有一定的量效和時效關系。邱妍等研究報道ABP能促進雛雞外周血T淋巴細胞的增殖。本試驗結果表明，5個試驗組有4個組隨著ABP量的增加（P＜0.05），外周淋巴細胞的增殖逐漸加大。但除第2組例外，沒有顯著變化，需進一步研究。表明ABP能促進豬外周血淋巴細胞的增殖，提高免疫力作用。并存一定的劑量關系。

4 結論

本試驗結果表明，牛膝多糖對外周血淋細胞增殖具有明顯的促進作用，且呈非典型的劑量依賴關系；最佳的劑量關系需待進一步的研究。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．01.006

陳春（1985～），廣西人，主要從事實驗動物管理