胡玲玲,湯德元,曾智勇,黃 濤,李 達,韋冠東,龍冬梅
( 貴州大學動物科學學院,貴州 貴陽 550025)
豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型及鏈球菌混合感染的診斷
胡玲玲,湯德元*,曾智勇,黃 濤,李 達,韋冠東,龍冬梅
( 貴州大學動物科學學院,貴州 貴陽 550025)
2016年3月貴州省某規(guī)?;i場的保育豬相繼出現(xiàn)四肢無力,趴地不能站立,叫聲嘶啞,死亡率高。經(jīng)臨床檢查和實驗室診斷確診為豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型和鏈球菌混合感染。現(xiàn)將診斷結(jié)果報道如下:
該規(guī)?;i場存欄豬1 000余頭,2016年3月中旬開始在2~3月齡保育豬出現(xiàn)發(fā)病,呈叫聲嘶啞、體溫升高、眼緣腫大、四肢無力、趴地不能站立,并不斷出現(xiàn)死亡現(xiàn)象;截止3月下旬共31頭豬發(fā)病,死亡18頭,另外13頭表現(xiàn)出相同的癥狀。
發(fā)病豬精神沉郁、食欲減退,消瘦,皮膚蒼白,叫聲嘶啞,體溫升高至40~41 ℃,四肢無力,走路搖晃,趴在地上不愿站立,外陰腫大,大腿內(nèi)側(cè)及腹部皮膚出現(xiàn)針尖狀出血點。發(fā)病特點為:發(fā)病急、病程短、死亡率高。初步懷疑為病毒性疾病和細菌性疾病混合感染。
無菌剖檢病死豬的病理變化為:剖檢腹腔可見腸道嚴重充氣(圖1),腸系膜淋巴結(jié)部分腫大及充血,肝臟邊緣梗死(圖2),脾臟有大量瘀斑、邊緣呈鋸齒狀(圖3),胃底黏膜有出血、潰瘍灶(圖4)、心臟包膜有積液,肺部可見大量嚴重壞死病、嚴重充血、淤血(圖5),腸道黏膜出、充血現(xiàn)象明顯(圖6),膀胱黏膜有針尖大的出血點。
圖1 腸道充氣
圖2 肝臟邊緣梗死
圖3 脾臟邊緣鋸齒狀
圖4 胃黏膜潰瘍灶
圖5 肺部可見明顯充血、壞死
圖6 腸道出血
4.1 細菌分離鑒定
4.1.1 細菌分離培養(yǎng)
無菌條件下將病豬的血液、肺臟和肝分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基上,于37 ℃條件下需氧/厭氧培養(yǎng)24~72 h觀察。結(jié)果培養(yǎng)基在需氧和厭氧環(huán)境下均有菌落生成長,判定分離菌為兼性厭氧菌。細菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長貧瘠,培養(yǎng)24 h后有針尖大小的單個菌落出現(xiàn)。然后挑取單個菌落進行純培養(yǎng),同時對細菌進行涂片、革蘭氏染色后經(jīng)1 000倍油鏡鏡檢有大量藍紫色圓形、雙球形或短鏈狀革蘭陽性球菌(圖7)。
圖7 10x100倍油鏡下可見單個或成鏈狀的球菌
4.1.2 生化鑒定
用杭州百思生物技術(shù)有限公司的BS7009球菌生化試劑盒檢測,結(jié)果表明:厭氧條件下培養(yǎng)的細菌對葡萄糖、蔗糖、果糖、覃糖、麥芽糖、甘露糖、蜜二糖、山梨醇以及N-乙酰葡胺試驗呈陽性;木糖醇及硝酸鹽還原試驗呈陰性;需氧條件下培養(yǎng)的細菌對蔗糖、蜜二糖、果糖試驗呈陽性;麥芽糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、木糖醇、山梨醇、覃糖、N-乙酰葡胺及硝酸鹽還原試驗呈陰性;鑒定結(jié)果符合鏈球菌的生化特性。
表1 擴增目的片段的引物
4.2??病毒核酸檢測
4.2.1 病料處理及DNA/RNA的提取
將送檢的死豬解剖分離各個器官,分別將心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及淋巴結(jié)進行取樣研磨,反復凍融3次,再用勻漿器進行勻漿收集其勻漿液,再取其血液,10 000 r/min離心10 min取其上清液進行DNA/RNA的提取,嚴格按照TaKaRa MinBEST Vira1 RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0說明書一步法提取DNA/RNA。
4.2.2 引物設(shè)計與合成
根 據(jù)GenBank中 登 錄 的PRV gB(AF257079)、PRVgE(JX417716)、PCV2 ORF2(NC_005148)、CSFV C(AY805221)、PRRSV ORF6(NC_001961)、PPV NS1(NC_001718) 和 SIV M(GU086140)等 基 因 序 列, 應(yīng) 用DNAStar、O1igo、MPprimer各設(shè)計了1對引物,用于擴增目的基因片段,引物均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。引物序列見表1。
4.2.3 PCR/RT-PCR反應(yīng)
對提取的核酸分別進行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV和SIV的病原檢測,各反應(yīng)體系及條件如下:CSFV、PRRSV和PCV2反應(yīng)體系:2×1 Step Buffer 12.5 μL,Prime Script One Step Enzyme Mix 1 μL,上下游引物各1 μL,RNA模板2 μL,RNase Free H2O 7.5 μL, 總 體 積25 μL。反應(yīng)程序50 ℃ 40 min;94 ℃5 min;94 ℃30 s,56 ℃30 s,72 ℃30 s,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。PRV反應(yīng)體系: 2×GC Buffer 12.5 μL,dNTPs (10 mmo1/L) 1.0 μL,上下游引物各1.0 μL,模板各2.0 μL, Taq DNA聚 合 酶 1.0 μL,RNase Free H2O 6.5 μL,總體積25 μL。反應(yīng)程序為:94℃ 5 min;94 ℃ 1 min; 58 ℃ 1 min;72 ℃ 45 s; 35個循環(huán);72 ℃10 min。PPV和SIV反應(yīng)體系: 2×1 step buffer 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,模板3 μL,Prime Script One Step Enzyme Mix 1 μL,RNase Free H20 6.5 μL,總體積25 μL。PPV反應(yīng)程序95 ℃5 min;95 ℃30 s,57 ℃30 s,72 ℃30 s,35個循環(huán);72 ℃10 min。SIV反應(yīng)程序50 ℃40 min;95 ℃5 min;95 ℃30 s,57 ℃30 s,72 ℃30 s,35個 循 環(huán);72 ℃10 min。
圖8 PCR/RT-PCR檢測結(jié)果
4.2.4 PCR/RT-PCR檢測結(jié)果
各取5 μL PCR/RT-PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。檢測結(jié)果如圖8所示:
如圖8所示檢測出豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型特異性病原核酸陽性條帶,測序結(jié)果與預期相符,確診為豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型感染。
根據(jù)臨床典型癥狀,結(jié)合流行特點、病理剖檢和實驗室細菌分離鑒定以病毒及PCR/RT-PCR檢測,確診該豬場豬發(fā)病原因為豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型和鏈球菌混合感染引起的發(fā)病死亡。
隨著我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?;⒓s化的不斷發(fā)展及治療豬病手段的不斷進步,隨之而來的疾病的種類也產(chǎn)生了變化,由以往的單一病原致病發(fā)展到多種病原混合感染和繼發(fā)感染。雖然藥物治療手段和效果越來越好,但隨之豬病的復雜程度及其危害也與日俱增。這對我們獸醫(yī)工作人員是一個極大的挑戰(zhàn)。CSFV和PRRSV是病毒性疫病的重要病原,CSFV、PRRSV能夠損傷機體的免疫系統(tǒng),降低豬群對外界環(huán)境的抵抗力,使得豬群發(fā)生疾病時多種病原混合感染和繼發(fā)感染的情況越來越普遍,由于這些病毒給機體造成相似臨床癥狀,導致疾病的診斷十分困難,難以及時給予相應(yīng)的防治。目前在臨床上多見CSFV與其他病毒或細菌的混合感染使病情復雜,臨床上或不呈現(xiàn)典型癥狀,增大了臨床診斷的難度,同時也增大了豬群的發(fā)病率和死亡率,應(yīng)引起重視。
鏈球菌病是由鏈球菌感染引起的,我國部分省區(qū)時有發(fā)生。鏈球菌不僅可以侵入血液循環(huán)系統(tǒng),而且可以穿過血腦屏障和胎盤屏障導致腦膜炎及母畜流產(chǎn)。在健康豬的體內(nèi)、血液循環(huán)系統(tǒng)、肝臟、腎臟、脾臟、腦脊液等器官和體腔內(nèi)是無病原體存在的,只有與外界相通的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等有大量的微生物存在,當豬所在環(huán)境條件差,如夏季溫度過高,濕度大,通風不暢;冬天寒冷潮濕,溫差大;飼養(yǎng)管理不善,沒有規(guī)范的消毒措施,沒有嚴格的免疫程序,缺乏保健措施;以及飼料營養(yǎng)不平衡,有發(fā)霉變質(zhì)現(xiàn)象等,使豬機體處于應(yīng)激狀態(tài),特異性、非特異性免疫反應(yīng)就會受到抑制,機體防御屏障被打破,從而容易受到病原體侵入,疾病進入潛伏期或者表現(xiàn)出臨床癥狀,如果沒有及時改善不利因素同時做出對病情的診斷和治療,病原體會大量增殖,進入血液循環(huán)系統(tǒng),到達各臟器并造成損傷。
建議豬場做好環(huán)境衛(wèi)生消毒工作,首先對發(fā)病豬進行隔離飼養(yǎng);對檢測有PCV2感染的豬進行淘汰;對病死豬進行深埋或焚燒處理;對污染的圈舍和四周環(huán)境用2%的燒堿液進行嚴格消毒。針對該規(guī)?;i場出現(xiàn)PCV2的感染嚴重并出現(xiàn)仔豬死亡現(xiàn)象,該規(guī)?;i場健康豬應(yīng)緊急接種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗。待疫情穩(wěn)定1個月后,對豬場內(nèi)所有豬進行豬瘟和豬藍耳病的常規(guī)免疫。
2016-09-08)
貴州省科學技術(shù)基金項目資助(黔科合J字[2013]2110號);貴州省2014年農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目資助(黔科合NY字[2014]3055號)
胡玲玲(1993-),女,碩士研究生,主要從事動物傳染病病原分子生物學的科研學習
*通訊作者:湯德元(1964-),男,教授,博士,碩士生導師,主要從事動物傳染病病原分子生物學和中西獸醫(yī)結(jié)合的教學科研工作。E-mail:tdyuan@163.com