天麻素注射液對(duì)帕金森病大鼠的保護(hù)作用

席 晅 任小瓊

(甘肅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部生理學(xué)教研室，甘肅 平?jīng)?744000)

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天麻素注射液對(duì)帕金森病大鼠的保護(hù)作用

席 晅 任小瓊1

(甘肅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部生理學(xué)教研室，甘肅 平?jīng)?744000)

目的 觀察天麻素注射液對(duì)帕金森病(PD)大鼠的保護(hù)效應(yīng)及探討其部分機(jī)制。方法 將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、天麻組及模型組，各20只。其中天麻組及模型組接受紋狀體內(nèi)多位點(diǎn)注射6-羥基多巴胺(OHDA)以建立PD模型，造模成功后模型組接受0.2 g·kg-1·d-1生理鹽水肌肉注射，天麻組接受0.2 g·kg-1·d-1天麻素注射液肌肉注射，持續(xù)干預(yù)14 d直至處死。比較各組干預(yù)前后行為學(xué)變化，紋狀體組織中 Bcl-2、Bax 蛋白及mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果 ①接受PD模型造模后的大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)明顯較假手術(shù)組增多(P<0.05)，經(jīng)過(guò)天麻素注射液治療后大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)明顯減少(P<0.05)。②接受造模的大鼠紋狀體內(nèi)Bcl-2蛋白/mRNA水平低于假手術(shù)組，Bax蛋白/mRNA水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，經(jīng)過(guò)干預(yù)后天麻素組紋狀體內(nèi)Bcl-2蛋白/mRNA水平較模型組明顯升高(P<0.05)，Bax蛋白/mRNA水平明顯下降(P<0.05)。結(jié)論 天麻素可明顯改善PD模型大鼠的臨床癥狀，其機(jī)制可能與通過(guò)升高紋狀體Bcl-2降低Bax含量有關(guān)。

帕金森??；天麻素注射液；Bcl-2；Bax

帕金森病(PD)發(fā)病原因目前尚未有統(tǒng)一的定論，以靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩為主要臨床表現(xiàn)，以黑質(zhì)紋狀體多巴胺(DA)神經(jīng)元漸進(jìn)性數(shù)量減少或者變性為病理改變〔1〕。目前針對(duì)PD的發(fā)病機(jī)制有學(xué)者提出“凋亡”假說(shuō)，他們認(rèn)為PD疾病發(fā)展的最終階段均表現(xiàn)為DA能神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡〔2〕。Bcl-2及Bax兩個(gè)因子廣泛參與調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡過(guò)程。目前治療方法雖可以發(fā)揮一定的治療作用，但仍無(wú)法阻止DA神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)一步紊亂。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)天麻素具有清除自由基、保護(hù)神經(jīng)元等作用，日本早已將天麻素運(yùn)用于各類(lèi)肢體震顫的治療中。本研究通過(guò)檢測(cè)PD大鼠紋狀體Bcl-2及Bax因子的表達(dá)變化，以探討天麻素治療PD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康成年 SD大鼠，清潔級(jí)，60只，平均體質(zhì)量(275±25)g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(許可證號(hào)碼：SCXX(滬)2007-0005)。SPF級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度(60±10)%，定時(shí)通風(fēng)換氣，模擬標(biāo)準(zhǔn)晝夜系統(tǒng)即12 h光照+12 h黑夜，可提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在該恒溫恒濕環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，給予自由飲食和飲水。隨機(jī)分為假手術(shù)組、天麻組和模型組各20只。

1.2 主要試劑及儀器 Bc1-2、Bax、β-actin 一抗、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔(CST 公司，美國(guó))；預(yù)染蛋白彩虹 Marker(Promega 公司，美國(guó))；Trizol(Invitrogen 公司，美國(guó))；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)免疫組化試劑盒(ZYMH 公司，美國(guó))，PCR 引物(生工生物工程有限公司，上海)，大鼠顱鉆(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，6-羥基多巴(美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品)。

1.3 模型制備 室溫 22℃ 條件下，大鼠稱(chēng)重后，以 3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行完全麻醉后固定于腦立體定位儀上，前囟部位充分消毒后備皮，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》確定左側(cè)紋狀體坐標(biāo)，以微量進(jìn)樣器頭分別于兩個(gè)注射點(diǎn)進(jìn)行6-OHDA溶液注射：①正中線(xiàn)左旁開(kāi)3 mm，于前囟平行處，硬膜下5.5 mm；②正中線(xiàn)左旁開(kāi)3 mm，于前囟嘴側(cè)0.7 mm，硬膜下4.5 mm。藥物劑量3 μg/μl，注射速度1 μl/min。注射完畢后緩慢退出微量進(jìn)樣器針頭，縫合皮膚，碘伏局部消毒。造模成功后模型組接受0.2 g·kg-1·d-1生理鹽水肌肉注射，天麻組接受0.2 g·kg-1·d-1麻素注射液肌肉注射。比較各組干預(yù)前后行為學(xué)變化，紋狀體組織中Bcl-2、Bax蛋白及mRNA的表達(dá)變化。假手術(shù)組用等量生理鹽水替代6-OHDA，操作方法同上。

1.4 Western印跡法檢測(cè)相關(guān)因子蛋白的表達(dá) 取各組紋狀體組織50 mg 剪碎，用勻漿器勻漿后置于冰上，加入 0.25 ml 含蛋白酶抑制劑(PMSF)裂解緩沖液后再進(jìn)行研磨至完全裂解后充分混勻，14 000 r/min，4℃，離心5 min，取上清液100 μl，EP 管分裝后備用。將樣本依次逐漸上樣至事先將配制好的 SDS-PAGE 膠中，先用 80 V的電壓跑濃縮膠，當(dāng)樣品跑至分離膠時(shí)則改用100 V電壓，待溴酸藍(lán)跑至膠底部即可停止電泳，再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、封閉孵育后分別加入按照1∶1 000稀釋的Bc1-2、Bax一抗。4℃ 搖床孵育過(guò)夜后以洗滌緩沖液(TBST)漂洗3次，每次10 min。再按說(shuō)明書(shū)加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗，放入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫，搖床孵育2 h。二抗孵育完成后，將PVDF膜取出用TBST清洗3次，每次10 min，最后再將用TBST浸洗15 min。將PVDF取出，用濾紙吸去液體，置于平鋪保鮮膜的工作臺(tái)上，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑(A液與B液等體積混合)，放入暗室中，靜置反應(yīng)1 min。運(yùn)行Bio-Rad Image軟件生物圖像分析處理。

1.5 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)因子mRNA的表達(dá) 將各組紋狀體組織50 mg移至1.5 ml EP管中加入0.25 ml Trizol研磨，再加入300 ml Trizol吹打均勻，加入0.2 ml氯仿，將管蓋閉合后劇烈震蕩15 s后室溫靜置3 min。在低溫離心機(jī)上4℃，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心15 min，輕輕將上層水相移至新EP管中，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水30 μl溶解RNA，根據(jù)RNA濃度計(jì)算上樣量，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在如下體系擴(kuò)增：預(yù)變性95℃，3 min；變性95℃，30 s→退火55℃～60℃，30 s→延伸72℃，30 s；從變性至延伸持續(xù)35個(gè)循環(huán)；終止延伸72℃，10 min。DNA Marker 及各組待測(cè)樣本各取5 μl上樣，用0.5×Tris硼酸(TBE)溶液作為電泳液，電壓90～100 V，電泳30 min。④所得DNA條帶用Model Gel 2 000凝膠成像分析儀進(jìn)行成像。以β-actin作為內(nèi)部參照，用Bio-Image圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及協(xié)方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)變化 造模后各組頸部皮下注射阿樸嗎啡(APO)，注射1～5 min后大鼠開(kāi)始出現(xiàn)以健側(cè)后肢為支點(diǎn)的旋轉(zhuǎn)，順時(shí)針?lè)较?，首尾相接。假手術(shù)組注射后并未出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，而模型組均出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為；模型組(15.61±2.62)和天麻組(14.5±2.96)干預(yù)前旋轉(zhuǎn)圈數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，經(jīng)過(guò)治療后天麻組旋轉(zhuǎn)圈數(shù)(5.51±2.72)較模型組(14.45±2.55)明顯下降(P<0.05)。

2.2 各組Bcl-2及Bax mRNA的表達(dá) 各組內(nèi)參GAPDH mRNA擴(kuò)增條帶亮度強(qiáng)弱相似。以與GAPDH同比例的模板量加入，各組Bcl-2 mRNA與Bax mRNA RT-PCR的擴(kuò)增條帶亮度具有明顯差異，與假手術(shù)組比較，Bcl-2 mRNA擴(kuò)增條帶亮度顯著減弱，Bax mRNA擴(kuò)增條帶亮度明顯增強(qiáng)(P<0.05)，其中模型組與天麻組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后，與模型組比較，天麻組紋狀體Bcl-2 mRNA擴(kuò)增條帶亮度明顯增強(qiáng)，Bax mRNA擴(kuò)增條帶亮度明顯減弱(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 各組Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組及天麻組紋狀體Bcl-2明顯降低，Bax明顯升高(P<0.05)。干預(yù)前模型組與天麻組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后，與模型組比較，天麻組紋狀體Bcl-2表達(dá)明顯增加，Bax水平明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的表達(dá)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.01

圖1 3組Western印跡結(jié)果比較

3 討 論

APO誘發(fā)PD模型大鼠的旋轉(zhuǎn)行為是目前被視為較客觀的評(píng)價(jià)手段〔3～5〕，APO屬于DAD2受體激動(dòng)劑，DAD2受體多存在于DA能神經(jīng)元突出后膜，DA能神經(jīng)元數(shù)量減少是PD的主要病理改變之一，有研究表明當(dāng)灰質(zhì)紋狀體DAD2受體減少超過(guò)70%時(shí)動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)動(dòng)作僵硬遲緩等癥狀。隨著APO注射后，DAD2受體數(shù)量增多，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)去神經(jīng)超敏現(xiàn)象，從而出現(xiàn)APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為。天麻素是天麻的有效成分，具有明顯的鎮(zhèn)靜、抗驚厥效應(yīng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)天麻素可明顯擴(kuò)張椎基底動(dòng)脈系統(tǒng)，從而增加腦血流量，發(fā)揮保護(hù)腦神經(jīng)、促進(jìn)心肌細(xì)胞能量代謝的作用〔6～8〕。Bcl-2和Bax是目前較為公認(rèn)的處于動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控基因組，其中Bcl-2可抑制細(xì)胞的凋亡，Bax可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此Bcl-2和Bax的表達(dá)量是抑制/誘發(fā)細(xì)胞凋亡的重要因素〔9〕。天麻注射液可調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的活性，抑制細(xì)胞凋亡蛋白 Bcl-2 發(fā)揮抗凋亡作用，還可以使促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白 Bax 磷酸化而失活，從而抑制細(xì)胞凋亡。推測(cè)，天麻素抗DA能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡很可能是其對(duì)PD動(dòng)物模型保護(hù)作用的主要機(jī)制之一，天麻素如何實(shí)現(xiàn)其抗凋亡值得研究。

1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)運(yùn)動(dòng)障礙及帕金森病學(xué)組.中國(guó)帕金森病治療指南(第 2 版)〔J〕.中華神經(jīng)科雜志，2009；42(5)：352-5.

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〔2015-01-19修回〕

(編輯 苑云杰)

席 晅(1966-)，男，副教授，主要從事生理學(xué)研究。

R965.1

A

1005-9202(2016)20-4996-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.023

1 甘肅醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科