慢性間歇性缺氧對大鼠認知功能及腦室旁白質膠質細胞膠質纖維酸性蛋白、S100B表達的影響

許盈盈 黃銀輝 陳雅芳 林有榆 蔡若蔚

(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經內科，福建 泉州 362000)

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慢性間歇性缺氧對大鼠認知功能及腦室旁白質膠質細胞膠質纖維酸性蛋白、S100B表達的影響

許盈盈 黃銀輝1陳雅芳 林有榆1蔡若蔚

(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經內科，福建 泉州 362000)

目的 觀察慢性間歇性缺氧(CIH)對大鼠認知功能、腦室旁白質膠質細胞的形態(tài)結構及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、S100B表達的影響。方法 60只健康雄性SD大鼠隨機選取10只大鼠進行CIH預實驗，每只大鼠缺氧前后均查血氣分析，以判斷是否達到低氧血癥及低氧的程度。造模成功后，將剩余大鼠隨機分為3組，CIH組20只、空白對照組(UC組)15只、空氣模擬對照組(AC組)15只。CIH組每日間歇缺氧8 h，連續(xù)8 w。AC組與CIH組共用控制系統，不同的是所有吹入氣體均為空氣。UC組正常飼養(yǎng)，未加干擾。所有大鼠在實驗結束后進行Morris水迷宮測試，檢測其學習和記憶能力，并用免疫組織化學染色法檢測大鼠腦室旁膠質細胞GFAP和S100B表達水平變化，用光鏡觀察大鼠白質超微結構改變。結果 Morris水迷宮學習成績：定位航行實驗：第5天訓練結束時，CIH組的逃避潛伏期明顯長于同期的UC組和AC組(P值分別為0.009，0.004)，UC組與AC組不存在統計學差異(P=0.803)。空間搜索實驗：CIH組的穿越平臺次數較UC和AC組顯著減少(P分別為0.031，0.010)；CIH組明顯比UC組及AC組穿越平臺次數少(P值分別為0.007，0.004)。而UC組與AC組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。CIH大鼠腦室旁白質區(qū)GFAP、S100B較UC、AC組表達升高(P<0.05)。CIH大鼠腦室旁白質區(qū)GFAP、S100B和認知功能損害程度呈負相關(r=-0.121，-0.015，P=0.028，0.015)。結論 CIH導致的認識功能損害可能與腦室旁白質病變有關。

慢性間歇性缺氧;認知功能;膠質細胞

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)與神經系統疾病關系密切，一方面，許多神經系統疾病，如腦卒中等，其并發(fā)睡眠呼吸暫停的發(fā)生率很高，另一方面，OSAS是導致日間嗜睡、認知功能障礙和某些神經系統疾病的重要原因之一，并可能與阿爾茨海默病(AD)發(fā)病密切相關〔1，2〕。Alchanatis等〔3〕和Zimmer-man等〔4〕應用磁共振波譜(MRS)及神經生物化學方法等研究方法發(fā)現OSAS的患者可出現額葉白質等區(qū)的受損。有研究提示OSAS對腦室旁腦白質的損害有選擇性〔4〕。而許多研究認為，腦白質病變與認知功能下降等密切相關，是血管性癡呆與AD認識功能障礙的主要發(fā)病機制之一〔5，6〕，Hirono等〔7〕甚至認為通過測量腦室旁白質損害容量的大小可以評估癡呆程度。所以OSAS的腦室旁白質損害與認知功能減退的可能機制，成為當前的研究熱點。認知功能屬于腦的高級神經活動，學習主要是指人或動物通過神經系統接受外界環(huán)境信息而影響自身行為的過程，記憶是指獲得的信息或經驗在腦內貯存和再現的神經活動過程，二者密切相關不可分割，均屬于腦的高級功能或高級神經活動〔8〕。慢性間歇性缺氧(CIH)在OSAS患者學習記憶功能下降的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用〔9〕。本研究探討CIH對大鼠學習記憶功能及腦室旁白質膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和S100B表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 間歇性缺氣系統S-450氧氣檢測報警儀加拿大BW.Technologies公司；醫(yī)用壓縮氧氣(濃度 > 99%)、壓縮氮氣(濃度>99%)、壓縮空氣(福州氧氣廠提供)；Atman-6500空氣泵(創(chuàng)星電器公司)；自制密閉有機玻璃箱(預留進出氣孔，出氣孔使用單向活瓣)；自制控制微電腦控制系統(由微電腦芯片、繼電器、電磁閥、顯示器等組成，編寫控制軟件進行程序控制)；Morris水迷宮(福建醫(yī)科大學神經生物學研究室)；鼠抗人GFAP免疫組化單克隆抗體(福州邁新生物技術開發(fā)公司)；鼠抗牛S100B多克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司)；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑(福州邁新生物技術開發(fā)公司)；0.1 mol/L(福州博科生物技術有限公司)；無水乙醇(福州博科生物技術有限公司)；甲醛(福州博科生物技術有限公司)；蘇木素(美國Sigma公司)；10%水合氯醛(福建醫(yī)科大學附屬二院藥劑科)；其他常規(guī)試劑(福建醫(yī)科大學動物實驗中心)；切片機RM2245型(德國Lexica)；電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9023A型(上海精宏實驗設備有限公司)；生物組織攤烤片機JK-5型(武漢俊杰電子有限公司光學)；包埋機(日本櫻花)；光學顯微照相系統(日本東京OlimpusBX51)；醫(yī)用低溫電冰箱(日本日立公司)；HW-2恒溫水浴箱(天津天大天發(fā)科技有限公司)；電子天平(北京賽多利公司)。

1.2 實驗動物 清潔級健康雄性8周齡SD大鼠60只，體重 180～200 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(滬)2007-0005。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物及分組 隨機選取10只大鼠進行CIH預實驗，每只大鼠缺氧前后均抽血查血氣分析，以判斷是否達到低氧血癥及低氧的程度。造模成功后，按照隨機數字法，將大鼠分為以下3組：空白對照組(UC組，n=15)，CIH組(n=20)，空氣模擬對照組(AC組，n=15)。

1.3.2 大鼠CIH預實驗 為了驗證慢性間歇缺氧艙的效果，測定10只大鼠在此間歇低氧條件下動脈血氧飽和度變化情況，參照文獻〔10，11〕方法：先將大鼠用苯巴比妥鈉100 mg/kg腹腔注射麻醉，將其腹部朝上固定在缺氧艙內解剖臺上，局部消毒后，切開腹部皮膚，分離腹主動脈，其中5只在缺氧艙內氧濃度最低點30 s內直視下抽取腹主動脈血行血氣分析，另外 5只大鼠在循環(huán)充氣過程中當缺氧艙內氧濃度恢復至21%時按同樣方法抽取。在缺氧循環(huán)中，當氧濃度達到8.3%左右時，大鼠動脈血氧飽和度(SaO2)為36.4%～60.5%，血氧分壓23.9～32.6 mmHg，當氧濃度達到21%左右時，大鼠SaO2為93.2%～97.4%，動脈血氧分壓為74.7～108.4 mmHg，其SaO2符合人類重度OSAS(SaO2<80%)的診斷標準。

1.3.3 CIH動物模型制作 參照文獻〔10，11〕方法對CIH的動物模型加以改進。①自制CIH艙：自制密閉有機玻璃箱，預留多個操作孔，由透明薄膜密封進出氣孔，其中出氣孔使用單向活瓣。使用醫(yī)用塑料導管連接密閉箱與控制系統。實驗過程中，箱內氣體不斷流動，以避免二氧化碳潴留。②氣體控制通路：氧氣和氮氣分別有不同的通氣管道，均由程序控制的電磁閥開關進行控制。通過調整進入氣孔的位置，保證缺氧艙內各個位置的氧氣氮氣濃度大致一致。通過控制程序及設定各種氣體的吹入時間及流量，調控箱內氧濃度。設定每一間斷性缺氧循環(huán)時間為4 min，其中各種氣體吹入時間順序為：氮氣120 s；靜息30 s；氧氣60 s；空氣30 s；各種氣體流入狀態(tài)可通過控制程序經顯示器讀出。箱內氧濃度由箱內氧氣檢測報警儀讀出，在進行動物實驗前，連續(xù) 20個循環(huán)每隔20s記錄箱內的氧濃度，取平均值，作循環(huán)中箱內氧濃度變化趨勢圖。每一次循環(huán)間歇缺氧艙內最低氧濃度達(8.29±0.31)%，最高氧濃度(23.30±0.47)%。③CIH實驗：每日8：00至16：00時將慢性間斷性缺氧組大鼠置于間斷缺氧系統的密閉箱中進行間歇性缺氧，16:00時以后使大鼠生活于大氣環(huán)境中。缺氧過程中，大鼠自由活動，不進食水及食物。AC組與CIH組共用控制系統，使用相同的密閉箱，以造成相似環(huán)境，不同的是所有吹入氣體均為空氣。UC組未加干擾。大鼠在CIH實驗完成后立即進行下一步的實驗。

1.3.4 Morris水迷宮試驗 ①定位航行試驗：共5 d，每天訓練4次。將大鼠面向池壁分別從四個象限的入水點放入水中，記錄其在60 s內尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。如果大鼠60 s內不能找到平臺，則由實驗者用手牽引其到平臺上停留10 s，然后取下休息30～60 s，再進行下一次訓練。此項試驗反映大鼠的學習能力。②空間探索試驗：實驗第6天，撤除平臺，將大鼠任意選1個入水點放入水中，記錄其60 s的游泳軌跡，分別計算首次到達平臺的時間及跨越平臺次數，以此項反映大鼠的空間記憶能力。水迷宮試驗結束后，各組實驗動物立即隨機等分為兩部分：一部分用于HE染色觀察腦室旁白質的結構改變，另一部分用于GFAP和S100B免疫組織化學染色。

1.3.5 用于免疫組化的大鼠的灌注與取材 將實驗大鼠取仰臥位固定于手術臺上，用10%的水合氯醛(0.5 ml/100 g體重)腹腔注射深度麻醉，剪開腹腔，暴露膈肌，小心剪破膈肌，然后向上剪破胸壁與心包，暴露心臟。用灌注穿刺針沿著心臟的縱軸方向經心尖刺入左心室至主動脈根部，止血鉗固定，在右心耳剪一小口，可見血液流出，先用溫生理鹽水50 ml灌注，待右心耳流出的液體變清亮時，再用4℃預冷的4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.2～7.4)150～200 ml灌注，一般灌注時間不少于30 min。灌注完成后，斷頭取腦，4℃預冷的4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.2～7.4)中后固定過夜后，以視交叉和其后4 mm處兩點冠狀切片，片厚4 mm，經梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，以備HE染色和免疫組織化學染色。GFAP和S100B免疫組織化學染色結果判定：GFAP陽性細胞為胞質黃染，S100B陽性細胞為細胞質及胞核黃染。免疫組化檢測設陽性對照，用從福州邁新公司購買的陽性對照片作陽性對照，結果陽性；陰性對照，用PBS液代替一抗作空白對照，結果陰性。

1.3.6 攝片 將每張切片于鏡下隨機選取6個不重疊的400倍視野，使用顯微照相攝片。在使用數碼相機拍攝切片照片時，電源的電壓保持穩(wěn)定，不能調解光源亮度及聚光鏡，以保持顯微鏡的亮度在拍攝一組照片的過程中前后一致。同時，數碼相機需手動設置曝光時間、變焦、光圈，關閉自動白平衡功能。

1.3.7 圖像分析 所攝照片用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)，測量平均光密度值(MOD)。MOD值為陽性細胞區(qū)域內所有像素點光密度值的平均，染色陽性程度越高，MOD值越低，所測得值的均值即分別為GFAP和S100B的含量。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行秩和檢驗和Spearman相關性分析。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮測試結果

2.1.1 定位航行試驗 CIH組和UC、AC組不同時間點逃避潛伏期有顯著差異(F=228.47，P=0.003)，從第1天開始，CIH組的逃避潛伏期明顯長于同期的UC組和RH組(均P<0.05)，UC組與AC組不存在統計學差異(P>0.05)。見表1。

2.1.2 空間探索試驗 CIH組首次達平臺時間明顯較UC組及AUC組均延長(P值分別為0.031，0.010)；CIH組的穿越平臺次數較UC組顯著減少(P=0.003)，說明處理組間存在差異，再進行兩兩比較，校正自由度α′=0.012 5，CIH組明顯比UC組及AC組穿越次數少(P值分別為0.002，0.004)。見表2。

2.2 腦室旁白質的HE染色所見 UC組及AC組腦組織的結構正常，未見缺血缺氧性改變。CIH組見神經元皺縮、部分神經元脫失，染色淺，細胞間質疏松明顯，核淡染，部分核不規(guī)則，核仁不清。見圖1。

表1 各組大鼠平均潛伏期的比較±s，s)

與同時點UC組比較：1)P<0.05

表2 三組大鼠記憶能力測定±s)

與UC照組比較：1)P=0.003,2)P=0.02;與AC組比較：3)P=0.004

圖1 各組大鼠腦室旁白質的HE染色(×400)

2.3 免疫組織化學染色光鏡觀察

2.3.1 GFAP的免疫組化表達 UC組和AC組腦室旁白質可見少量GFAP陽性細胞，GFAP陽性細胞胞質為棕黃色，胞體較小，周圍有放射狀突起，突起較小，較細。而在CIH組腦室旁白質GFAP陽性細胞的表達明顯增多，細胞形態(tài)也有明顯改變，胞體較大，周圍的放射性突起粗大，深染，見圖2。各組腦室旁白質GFAP表達水平的比較顯示，CIH組GFAP陽性產物IOD值高于UC組和AC組(P<0.01)，UC組與AC組之間沒有差異(P>0.05)。見表3。

圖2 各組大鼠腦室旁白質GFAP陽性表達(DAB，×400)

組別nGFAPS100BCIH組200.0722±0.01571)0.0829±0.02292)UC組150.1225±0.02060.1368±0.0397AC組150.1227±0.02030.1389±0.0331

與UC組比較:1)P=0.00，2)P=0.01

2.3.2 S100B的免疫組化表達 UC組和AC組腦室旁白質可見少量S100B陽性細胞。UC組和AC組的S100B細胞胞質為棕黃色，胞體較小，染色較淡。而在CIH組腦室旁白質S100B陽性細胞的表達明顯增多，細胞形態(tài)也有明顯改變，胞體較大，細胞質及細胞核均深染，見圖3。故CIH組IOD與其余兩組比較差異有顯著意義(F=4.75，P<0.05)。各組腦室旁白質S100B表達水平的比較顯示，CIH組S100B陽性產物IOD值高于UC組和AC組(P<0.01)。UC組與AC組之間沒有差異(P>0.05)。見表3。

2.4 大鼠腦室旁白質GFAP、S100B表達分別與認知功能受損之間的相關性 大鼠認知功能損害程度和腦室旁白質GFAP、S100B表達呈負相關(r=-0.121,-0.015；P=0.028,0.015)。

圖3 各組大鼠腦室旁白質S100B陽性表達(DAB，×400)

3 討 論

由于OSAS患者夜間反復呼吸暫停需較長時間才可能導致各系統較嚴重并發(fā)癥，故目前在人類進行OSAS與白質關系的前瞻性研究比較困難，且臨床研究存在許多干擾因素，使得很多研究在人體上進行有一定的局限性，所以建立適當的OSAS的動物模型對于闡明OSAS白質損害及認識功能減退的研究是非常重要的。近年來隨著對其研究的深入，各國學者針對其病理生理的特點制作出了各種動物模型，但仍然無法很好地模擬OSAS的病理生理過程，故我們嘗試對現有的模型加以改進，建立CIH大鼠模型，試圖更好地研究OSAS的發(fā)生發(fā)展過程。本研究建立的模型很好地模擬了OSAS的病理生理過程，利于對OSAS的進一步研究。

記憶損害常是OSAS患者就診的主要癥狀之一，一些研究認為OSAS患者主要出現執(zhí)行功能的減退，包括無法形成新的記憶以及選擇性及持續(xù)的注意力減退等〔12〕。OSAS患者在智力和語言表達功能上的損害難以被察覺，但是在覺醒性和執(zhí)行功能上有明顯的障礙〔13〕。目前OSAS患者的認知功能障礙是否可逆還沒有定論，但是在OSAS患者觀察到的大腦結構性的改變可能支持認知功能減退是不可逆的〔14〕。OSAS引起的認知功能損害，主要表現在記憶力、注意力、執(zhí)行能力等方面〔15〕。本研究結果顯示CIH不但可以造成大鼠的學習能力進行性下降，從而經過訓練獲得有效經驗的能力下降，而且可以造成空間定位記憶能力的損害。

GFAP作為星形膠質細胞活化的一個重要特征，其合成量的多少對腦損傷程度有直接影響。少突膠質細胞是腦白質的主要膠質細胞，它主要功能為合成髓鞘，包繞有髓神經。髓鞘主要是為有髓神經纖維提出了一個高的膜阻抗和低的電容，保證了沖動的跳躍式傳導〔16〕。S100B是腦組織中主要的S100蛋白，在灰質及皮層由星形膠質細胞表達，在白質由少突膠質細胞表達〔17〕。Naegele等〔18〕發(fā)現，在大腦慢性持續(xù)低灌注的大鼠模型中，S100B的表達在其白質損害的部位廣泛地增多。故S100B表達的上調與腦白質的損害程度正相關。本研究發(fā)現S100蛋白及GFAP在CIH組大鼠腦室旁白質表達較UC、AC組明顯升高。

VD的病理機制主要在于血管栓塞及小血管疾病。典型的皮質下缺血性血管病廣泛累及室周和深部白質，特別是內囊膝部或前肢、放射冠前部和半卵圓中心前部，常常累及前額葉皮質下環(huán)路，從而影響認識知功能，這與臨床上我們看到的OSAS造成的腦室旁白質損害的部位類似，而血管梗死的病因多為高血壓、動脈粥樣硬化及各種栓塞性疾病，這恰與OSAS的高危因素相同，同時VD中小血管的病理改變也與OSAS因低氧而引起的血管的改變類似，提示OSAS腦室旁白質損害對認知功能的損害的機制可能與VD的機制相似。Cavalieri等〔8〕甚至認為通過測量腦室旁白質損害容量的大小可以評估癡呆程度，進一步提示了OSAS的認知功能減退與腦室旁白質損害的相關性。

Zhang等〔19〕認為慢性間斷性睡眠低血氧通過對前額及后頭部(ERP)的影響所致的前額中央執(zhí)行系統功能損害可能是OSAS患者記憶障礙的病理基礎。由于與記憶、情緒行為等智能有關的三種邊緣環(huán)路(內側邊緣環(huán)路、基底外側邊緣環(huán)路和防御環(huán)路)均位于腦室周圍，故當腦室周圍白質發(fā)生病損時，環(huán)路中斷，患者就可能表現為記憶障礙、情感及行為異常，記憶障礙主要表現為近記憶力明顯下降，定向力、計算力減退。同時，腦白質的損害破壞聯絡性傳導，導致感覺、運動及高級神經活動障礙，同時具有一定的隱匿性和延遲性。另外，皮質和皮質下投射系統的分離可加重白質損傷，最終引起認知功能的損害。Du等〔20〕研究表明白質病變可引起腦皮質萎縮，而且對其他腦皮質區(qū)域的影響要比對內嗅區(qū)和海馬皮質的影響要大。另外腦室旁的白質纖維多由額葉投射纖維組成，因此白質病變可延伸至額葉，引發(fā)精神運動下降，逐漸形成癡呆。本實驗結果說明GFAP、S100B越高，腦室旁白質損害越厲害，大鼠的空間學習和記憶能力越差。

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〔2015-02-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

許盈盈(1981-),女，主治醫(yī)師,碩士，主要從事腦血管病研究。

R743

A

1005-9202(2016)20-4987-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.020

1 晉江市醫(yī)院神經內科