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    紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖與凋亡的影響

    2016-11-28 00:44:32馬永臻
    中國老年學雜志 2016年20期
    關(guān)鍵詞:和順劃痕紫杉醇

    馬永臻

    (山東醫(yī)學高等??茖W校,山東 臨沂 276000)

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    紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖與凋亡的影響

    馬永臻

    (山東醫(yī)學高等??茖W校,山東 臨沂 276000)

    目的 探討紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖與凋亡。方法 用劃痕實驗檢測紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖、遷移能力的影響;MTT法和免疫細胞化學方法檢測紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響。結(jié)果 紫杉醇和順鉑明顯抑制KYSE150細胞的增殖,降低其遷移能力(P<0.05),且兩藥有協(xié)同抑制作用。紫杉醇和順鉑降低KYSE150細胞中Bcl-2蛋白的表達,增強Bax和Caspase-3蛋白的表達(P<0.05)。結(jié)論 紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖和凋亡影響與Bax、Bcl-2和Caspase-3基因表達異常相關(guān)。

    紫杉醇;順鉑;Bax;Bcl-2;Caspase-3;食管癌

    早期食管癌的治療以手術(shù)切除為主,晚期常以化療為主,但食管癌發(fā)病隱匿,確診時大多已是中晚期,失去了根治的機會,導致食管癌治療的總有效率并不高。因此,尋找對食管癌更有效的治療方法和化療藥物具有重要意義。紫杉醇和順鉑是臨床常用的食管癌化療藥物,但對其作用機制尚未完全清楚。食管癌的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡異常密切相關(guān),而細胞凋亡又是由多種基因調(diào)控的,研究凋亡調(diào)控基因?qū)τ诹私馐彻馨┑陌l(fā)生、發(fā)展及治療都有重要意義。本文觀察紫杉醇和順鉑對食管癌KYSE150細胞增殖和凋亡的影響,檢測Bax、Bcl-2和Caspase-3基因表達變化,探紫杉醇和順鉑的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶和胎牛血清由杭州四季青公司提供。人食管癌KYSE150株由本實驗室凍存。紫杉醇(分子量853.9)、順鉑(分子量300.05)由哈藥集團生物工程有限公司提供,5%四甲基偶氮唑藍(MTT)由上海華美生物工程公司提供。兔抗人Bax、Bcl-2和Caspase-3單克隆抗體由美國Santa Cruz公司提供,F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG、山羊封閉血清、二甲基亞砜(DMSO)、DAB顯色劑和PBS購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

    1.2 細胞培養(yǎng) KYSE150細胞接種于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 U/ml鏈霉素),常規(guī)培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液并傳代,取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

    1.3 MTT法檢測

    1.3.1 半數(shù)抑制濃度(IC50)測定 取100 μl含5×104個/ml細胞接種于96孔板。孵育12 h后,加入不同濃度的順鉑和紫杉醇,順鉑終濃度依次為4、8、16、32、64、128、256 μg/ml,紫杉醇終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml,每孔100 μl,每個濃度設(shè)3個復(fù)孔,以不含藥物的培養(yǎng)液作為陰性對照孔,同樣設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl/孔,孵育4 h,吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,加150 μl DMSO,振蕩10 min。用全自動酶標儀測定490 nm處吸光值(A)。細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A)×100%。計算出順鉑、紫杉醇對人食管癌細胞KYSE150的IC50。實驗重復(fù)3次。

    1.3.2 藥物聯(lián)合作用評價 細胞分如下4組:對照組、紫杉醇組、順鉑組和聯(lián)合組(紫杉醇+順鉑),對照組不加藥物,紫杉醇和順鉑的濃度均為IC50。倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài);全自動酶標儀檢測藥物作用24、48、72 h后各組細胞的吸光值,比較不同藥物和用藥方式對KYSE150細胞增殖的影響。實驗重復(fù)3次。采用兩藥相互作用指數(shù)(CDI)評價兩藥的相互作用〔1〕:CDI=AB/(A×B),其中A、B是兩藥單獨作用吸光度值與對照組吸光度值的比值,AB為兩藥聯(lián)合組吸光度值與對照組吸光度值比值。CDI>1時,兩藥相互作用為拮抗作用;CDI=1,兩藥作用性質(zhì)為相加;CDI<1時,兩藥相互作用為協(xié)同。

    1.4 免疫細胞化學染色 KYSE150細胞按照1.3.2方法分組培養(yǎng),至細胞完全貼壁后加紫杉醇和順鉑(均為IC50的濃度)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞,涂片,固定,3%H2O2室溫孵育15 min,山羊血清孵育15 min。分別與Bax、Bcl-2和Caspase-3單克隆抗體37℃孵育2 h,PBS洗3次。二抗室溫孵育15 min,DAB顯色,封片,以培養(yǎng)液代替一抗作陰性對照。顯微鏡下觀察切片,以細胞膜和細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色細顆粒為陽性細胞,比較各組細胞陽性著色的位置和強度,計算KYSE150細胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的陽性率。應(yīng)用Image J軟件和Image Proplus軟件對免疫組化圖像進行半定量分析。

    1.5 劃痕實驗檢測紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞生長和遷移的影響 取對數(shù)期各組細胞接種于6孔板,細胞密度為5×103個/孔,待細胞貼壁成單層細胞后,用消毒槍頭均勻劃4條橫線,用PBS洗去劃下的細胞,換成含1.5%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37°C,5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察0、24、48 h劃痕愈合情況,用Image Proplus軟件測量各組細胞24 h的遷移距離,每組實驗重復(fù)3次。

    1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1 IC50測定 見表1。隨著紫杉醇和順鉑濃度增加,KYSE150細胞的抑制率也增加,當紫杉醇濃度為8 μg/ml、順鉑的濃度為64 μg/ml時,細胞的抑制率近半數(shù),因此,可以認為紫杉醇的IC50為8 μg/ml,順鉑的IC50為64 μg/ml。

    表1 紫衫醇和順鉑IC50測定

    2.2 紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖的影響 顯微鏡下觀察,紫杉醇組、順鉑組和聯(lián)合組細胞稀疏,形態(tài)皺縮、變圓,胞核固縮;對照組細胞密集,貼壁良好,形態(tài)規(guī)則,多邊形。說明紫杉醇和順鉑對食管癌細胞有明顯的抑制作用。紫杉醇和順鉑對KYSE150細胞增殖抑制作用并無時間依賴性,48 h時抑制作用最強(CDI=0.742),72 h后抑制作用減弱(CDI=0.922),24 h時CDI=0.878;各時間點CDI<1,說明紫杉醇和順鉑有協(xié)同作用,而且48 h協(xié)同作用最強。見表2。

    表2 紫杉醇和順鉑作用不同時間的平均吸光度值比較

    與同組別其他時間點比較:1)P<0.05;與同時間點其他組比較:2)P<0.05

    2.3 免疫細胞化學結(jié)果 各組平均灰度值見表3,各用藥組Bcl-2蛋白的表達均低于對照組,Bax和Caspase-3蛋白的表達均高于對照組。應(yīng)用Image J軟件對免疫組化圖像進行陽性細胞計數(shù),見表4,陽性細胞越多,說明表達Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達越多(P<0.05)。

    表3 Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的平均灰度值

    與對照組比較:1)P<0.05,下表同

    表4 免疫組化圖像陽性細胞數(shù)分析(%,n=100)

    2.4 劃痕實驗結(jié)果 劃痕實驗結(jié)果顯示,對照組細胞生長較快,48 h后細胞已經(jīng)長滿劃痕部位,而順鉑組細胞生長緩慢,48 h后劃痕部位沒有長滿。用Image Proplus軟件測量各組細胞24 h的遷移距離,結(jié)果表明對照組遷移距離明顯大于順鉑組(P<0.05),見表5。

    表5 各組細胞24 h、48 h遷移距離

    3 討 論

    紫杉醇和順鉑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食管癌的治療,效果較好〔2,3〕。本研究發(fā)現(xiàn),隨著紫杉醇和順鉑濃度的增加,對KYSE150細胞的抑制作用增強,當紫杉醇濃度為8 μg/ml、順鉑的濃度為64 μg/ml時,細胞的抑制率近半數(shù),但紫杉醇和順鉑的抑制作用并無時間依賴性,48 h時抑制作用最強,72 h后抑制作用減弱,而且紫杉醇和順鉑有協(xié)同作用。章曉萍等〔4〕研究發(fā)現(xiàn),順鉑與吉非替尼聯(lián)合用藥對食道癌Eca-109細胞有協(xié)同抑制作用,細胞的生長抑制率均隨著給藥濃度的增加和時間的延長而提高,順鉑組具有時間濃度依賴性,與本研究略有不同之處。

    細胞增殖失控是惡性腫瘤重要的生物學特征,細胞增殖與凋亡失衡是食管癌發(fā)生的重要原因,細胞凋亡又受許多基因的調(diào)控,其中Bax、Bcl-2和Caspase-3都與細胞凋亡有關(guān)。孔霞等〔5〕研究證實,順鉑與紫杉醇聯(lián)合可協(xié)同誘導人食管癌細胞的凋亡,其作用機制可能與下調(diào)凋亡抑制基因的表達有關(guān)。原癌基因Bcl-2基因家族及其相關(guān)蛋白是研究最早的與凋亡有關(guān)的基因,也是目前最受重視的調(diào)控細胞凋亡的基因家族〔6〕。Bcl-2家族成員分為兩大類:促凋亡類,如Bid、Bax、Bak等;抑凋亡類,如Bcl-2、Bcl-x1等,這2類蛋白可通過形成異二聚體發(fā)揮相互拮抗或協(xié)同作用〔7〕。Bcl-2基因高表達可以抑制細胞凋亡,維持細胞的存活,而對細胞增殖無影響。

    Bax基因定位于染色體19q13.3-19q13.4,含有6個外顯子5個內(nèi)含子。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡,當Bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡;Bax與Bcl-2形成異源二聚體時則實現(xiàn)了Bcl-2抑制細胞凋亡的功能〔7〕。

    本研究說明紫杉醇和順鉑使得Bcl-2蛋白表達降低,Bax和Caspase-3的表達增高,對KYSE150細胞凋亡的抑制作用減弱,誘導凋亡的作用增強,從而抑制細胞的增殖,抑制食管癌的進一步發(fā)展。這一結(jié)果與某些實驗結(jié)果一致〔8,9〕。

    細胞凋亡是非常復(fù)雜的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程。目前認為藥物誘導腫瘤細胞的凋亡受一個或多個基因的調(diào)控〔10〕。眾所周知,Caspase-3為與細胞凋亡密切相關(guān)的蛋白酶家族〔11〕。誘導細胞凋亡的典型途徑包括:對Caspase-3的依賴性(細胞外途徑)和對線粒體靶向性(細胞內(nèi)途徑),而Caspase-3是兩種細胞凋亡途徑中的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者,是級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。由于活化的Caspase-3能特異性地切斷DNA,使參與DNA損傷修復(fù)過程中的DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)和聚ADP核糖聚合酶(PARP)失活,導致核酸激活和染色質(zhì)聚集,促使細胞凋亡。Odonkor等〔12〕研究結(jié)果表明,Caspase-3依賴性途徑是Paclitaxel細胞毒性作用的重要途徑,Caspase活化和效能對Paclitaxel治療腫瘤的敏感性具有良好的指示作用。劉圓圓等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)茶多酚能抑制Eca-109細胞生長、誘導細胞凋亡,使細胞周期阻滯在G1期的比例增高;兩藥聯(lián)合其作用更明顯,其機制可能與Caspase-3 mRNA表達增高有關(guān)。從作用機制而言,Bcl-2不僅可能通過抑制細胞色素C從線粒體的釋放而調(diào)控線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開啟從而抑制Caspase-3的活化,還可能參與抑制Caspase-3的合成〔14〕。

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    2 孫兆勇,王傳省.紫杉醇脂質(zhì)體聯(lián)合奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶治療晚期食管癌的療效〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(12):2927-8.

    3 丁金鋒.順鉑與紫杉醇同步化療聯(lián)合放療治療老年食管癌療效觀察〔J〕.中國實用醫(yī)藥,2012;7(22):143-4.

    4 章曉萍,李孝麟.吉非替尼聯(lián)合順鉑對食管癌細胞增殖的影響〔J〕.海峽藥學,2012;24(8):240-2.

    5 孔 霞,王秀美,隋愛華,等.重組人血管內(nèi)皮抑素與紫杉醇聯(lián)合誘導人食管癌細胞 Eca-109 凋亡的實驗研究〔J〕.臨床腫瘤學雜志,2013;18(3):193-6.

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    13 劉圓圓,王秀美,姚如永,等.茶多酚并紫杉醇對食管癌Eca-109細胞增殖與凋亡影響〔J〕.齊魯醫(yī)學雜志,2013;28(2):102-5.

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    〔2015-04-15修回〕

    (編輯 苑云杰/曹夢園)

    山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃(2011HZ098)

    馬永臻(1970-),女,碩士,教授,主要從事腫瘤病理研究。

    R735.1

    A

    1005-9202(2016)20-4973-03;

    10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.014

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