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    日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)的研究

    2016-11-28 12:47:02龍冬梅湯德元曾智勇韋冠東
    豬業(yè)科學(xué) 2016年3期
    關(guān)鍵詞:原核乙型保護(hù)性

    龍冬梅,黃 濤,湯德元,曾智勇,李 達(dá),韋冠東

    (貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

    日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)的研究

    龍冬梅,黃 濤,湯德元*,曾智勇,李 達(dá),韋冠東

    (貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

    日本乙型腦炎是由日本乙型腦炎病毒引起的嚴(yán)重的人畜共患性傳染病,日本乙型腦炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白包括C、PrM和E 3種。其中C蛋白主要參與病毒RNA和蛋白之間的相互作用,且具有核定位信號序列,在乙腦病毒中,缺失此序列后C蛋白只在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn);PrM和E基因是其主要免疫保護(hù)性抗原基因,表達(dá)的蛋白是乙型腦炎病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,是病毒顆粒的主要成分,也是維持病毒粒子形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要物質(zhì),主要參與病毒感染的后期階段,可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫。近年來許多學(xué)者對日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因原核表達(dá)和真核表達(dá)及其相關(guān)免疫原性進(jìn)行了大量的研究,取得了一定的研究進(jìn)展,文章主要針對日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,為乙型腦炎基因工程疫苗的進(jìn)一步研究提供參考。

    日本乙型腦炎病毒;結(jié)構(gòu)蛋白;原核表達(dá);真核表達(dá);免疫原性

    日本乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)簡稱乙腦,是由乙型 腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus,JEV) 引起的以三帶庫蚊為主要傳播媒介的嚴(yán)重的人畜共患傳染病。該病主要侵犯患病動(dòng)物或人的丘腦、脊髓、角細(xì)胞、大腦皮質(zhì)和小腦,引起患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷。動(dòng)物感染JEV的死亡率為30%,存活下來的有50%的動(dòng)物會(huì)有神經(jīng)系統(tǒng)的后遺癥[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)已經(jīng)把日本乙型腦炎列為重點(diǎn)防控傳染病。豬是乙型腦炎的主要傳染源,是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一,對豬的致死率不高,臨床上以高熱和狂暴、或沉郁、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激等神經(jīng)癥狀為特征,具有明顯的季節(jié)性和一定的地理區(qū)域分布,多發(fā)生于蚊蟲較多的夏秋季節(jié),屬于自然疫源性疾病,可引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎或木乃伊胎,也可引起公豬睪丸急性炎癥反應(yīng)或不育,因此,控制豬的乙腦具有十分重要的意義。隨著科技工作者對JEV分子結(jié)構(gòu)的大量研究,人們對JEV基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的蛋白等都有了較為清楚的認(rèn)識,為從分子水平上來研究JEV的防制奠定了理論基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上,近年來許多學(xué)者對日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因原核表達(dá)和真核表達(dá)及其相關(guān)免疫原性進(jìn)行了大量的研究,取得了一定的研究進(jìn)展,本文主要針對日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,為乙型腦炎基因工程疫苗的進(jìn)一步研究提供參考。

    1 日本乙腦病毒的基因組結(jié)構(gòu)

    JEV的基因組為單股正鏈RNA分子,其長度為11 kb,與其他黃病毒科成員相似,整個(gè)基因組由非編碼區(qū)(5'-noncoding region, 5'-NCR )和3’端的非編碼區(qū)(3'-NCR)和一個(gè)幾乎跨越整個(gè)基因組的單一開放閱讀框(open reading frame, ORF)構(gòu)成,無亞基因組結(jié)構(gòu)。5'端有一個(gè)I型帽子結(jié)構(gòu),3’端無Poly ( A)尾,各基因之間無重疊。從5’端至3’端形成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白:核衣殼蛋白C(C)、膜蛋白( PrM/M )、囊膜糖蛋白(E);7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1.NS2a.NS2b. NS3.NS4a.NS4b.NS5),各基因在基因組上的排列為:5"-C-PrM/M-E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3",它們之間無重疊,JEV基因組結(jié)構(gòu)示意圖如圖1。

    圖1 JEV基因結(jié)構(gòu)示意圖

    2 JEV蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白與功能

    JEV有3種結(jié)構(gòu)蛋白,分別是核衣殼蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)和囊膜糖蛋白(E),這些結(jié)構(gòu)蛋白是日本乙型腦炎病毒顆粒的主要成分,是維持病毒粒子形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要物質(zhì),編碼JEV結(jié)構(gòu)蛋白的這些基因定位于ORF5’端約前1/3的部分,結(jié)構(gòu)蛋白在N端順序依次為核衣殼蛋白C、膜蛋白PrM/ M和囊膜糖蛋白E,信號肽酶對此進(jìn)行至少3次切割,將這些結(jié)構(gòu)蛋白分開。JEV 3種結(jié)構(gòu)蛋白的功能分別為:

    2.1 核衣殼蛋白C

    核衣殼蛋白C的分子量為13 ku,屬于強(qiáng)堿性蛋白,由136個(gè)氨基酸組成,其39~54位氨基酸序列在黃病毒屬中具有保護(hù)性,且該段氨基酸序列具有疏水性[2]。C蛋白的保守性稍差,主要作用為C蛋白與基因組RNA結(jié)合組成核心,參與病毒RNA和蛋白之間的相互作用,將其暫時(shí)固定在宿主細(xì)胞的內(nèi)置網(wǎng)上,在病毒和衣殼裝配時(shí)發(fā)揮作用,作用是在合成部位由C端疏水性氨基酸將其暫時(shí)固定在宿主細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,以便裝配成核衣殼包裹基因組,保護(hù)基因組免受核酸酶或其他因素的破壞。

    2.2 M蛋白

    M蛋白是由其前體PrM切割而產(chǎn)生,分子量為8.5 ku,約含有75個(gè)氨基酸殘基,具有高度的疏水性,參與病毒囊膜的構(gòu)成,被包埋在病毒粒子囊膜的脂質(zhì)雙層中,它可能與插入脂雙層中的E蛋白完全疏水性C端相互作用。其前體蛋白PrM(18~19 ku)存在于感染細(xì)胞內(nèi)未成熟毒粒中,是未成熟病毒體的一部分,病毒以此與細(xì)胞相連。在病毒感染后期,可以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫,PrM蛋白緊密地與E蛋白結(jié)合在一起,形成異二聚體,其作用認(rèn)為是伴侶蛋白PrM對E蛋白的正確折疊、定位于膜上和最后的裝配起著至關(guān)重要的作用,是與膜結(jié)合以及裝配時(shí)所必須的,抑制病毒的作用直到病毒釋放。Takegami等[3]在對其生物學(xué)功能的研究中認(rèn)為:M蛋白參與病毒的感染過程,能誘生具有輕度中和作用的抗體。PrM區(qū)整體結(jié)構(gòu)相對較穩(wěn)定[4],是病毒誘發(fā)保護(hù)性免疫的重要協(xié)同成分,對E蛋白的正確折疊、定位于膜上和最后的裝配十分重要。

    2.3 包膜蛋白E

    E蛋白是JEV主要的囊膜蛋白,也是毒粒表面最重要的成分,在JEV毒力中占有重要位置,分子量為53 ku,含有病毒血凝素中和抗原決定簇,為黃病毒屬中的主要結(jié)構(gòu)蛋白,是引起宿主機(jī)體免疫及產(chǎn)生中和抗體的主要抗原蛋白,它在參與病毒粒子的吸附、穿入、致病和誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答等密切相關(guān),在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的中和抗體及其保護(hù)性免疫中起重要作用[5],并且是體外中和作用中的主要靶位點(diǎn)和JEV特異性抗體的作用位點(diǎn),一般認(rèn)為E蛋白是病毒受體的結(jié)合蛋白,介導(dǎo)膜融合和細(xì)胞傳入?;?yàn)閱挝稽c(diǎn)突變可使JEV病毒喪失其神經(jīng)毒力/侵襲力,通過對減毒株和野毒株的比較共有8個(gè)氨基酸殘基差異,具體位置在E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315、E439位,是毒力減弱的關(guān)鍵位點(diǎn),其中E138和E176位點(diǎn)上的氨基酸突變可能改變E蛋白對細(xì)胞受體的吸附性,或者引起該病毒對其他細(xì)胞不可穿透,這兩種機(jī)制導(dǎo)致病毒毒力減弱,即E蛋白138位點(diǎn)或138和176位點(diǎn)一起對乙型腦炎病毒強(qiáng)毒株在連續(xù)傳代過程中減弱起了關(guān)鍵作用[6]。同時(shí)E蛋白是體外中和作用的主要靶位點(diǎn)和JEV特異性抗體的作用位點(diǎn),可激發(fā)中和抗體和保護(hù)性免疫。

    3 日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原表達(dá)及其免疫的研究進(jìn)展

    3.1 日本乙型腦炎的原核表達(dá)的研究進(jìn)展

    Mason等[7]己成功地在大腸桿菌中表達(dá)JEV的 E蛋白,對其進(jìn)行單抗結(jié)合位點(diǎn)的研究。Konish等[8]用高度致弱的痘苗病毒NYVAC株分別構(gòu)建了VP908和VP923;VP908表達(dá)PrM、E和NS1, VP923表達(dá)PrM和E,用VP908和VP923免疫豬,能明顯降低JEV強(qiáng)毒株攻擊后的病毒血癥。

    Wu等[9]將JEVCH2195LA分離株的E蛋白這段目的基因克隆到原核表達(dá)載體pET32a,然后在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白TrxD3,用純化的蛋白與弗氏佐劑或陽離子脂質(zhì)混合后免疫小鼠,結(jié)果證明:TrxD3融合蛋白能夠使小鼠產(chǎn)生較高的免疫保護(hù)中和抗體。

    謝良伊[10]等根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中乙型腦炎病毒的PrM氨基酸序列獲得其對應(yīng)的基因序列,對PrM全長基因(80aa)進(jìn)行體外合成,將其克隆至Pet-21原核表達(dá)載體,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒Pet21-PrM,將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,通過鎳離子親和層析純化目的蛋白,將純化蛋白免疫BALB/c小鼠,獲取克隆抗體并利用Protein A Sepharose柱進(jìn)行純化,然后用ELISA法檢測抗體的效價(jià),再用Western bolt法檢測抗體的特異性,最后獲得了高純度的乙型腦炎病毒PrM蛋白,并成功地制定了效價(jià)高達(dá)1:1.6×106特異性的單克隆抗體。

    梅勻安等[11]提取JEV上海分離株的基因組RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,RT-PCR擴(kuò)增該病毒的PrM基因片段,亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28(a)上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28(a)-JEV-prM并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),挑取克隆擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后,1 mmol/LIPTG誘導(dǎo)3 h,分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后取樣,煮沸裂解細(xì)菌,SDS-PAGE檢測重組蛋白表達(dá)情況,結(jié)果表明獲得分子量為24 ku的重組蛋白,主要以包涵體形式表達(dá),薄層掃描分析表明:表達(dá)量占總菌體蛋白的30%以上,純化后獲得高純度重組蛋白,占總蛋白60%以上。用純化蛋白His-JEV-prM免疫BALB/ c小鼠,制備了小鼠抗JEV-prM抗體,Western-blotting和間接免疫熒光檢測小鼠抗JEV-PrM抗體的特異性。純化蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度抗體,并且該抗體能特異識別原核、真核和病毒表達(dá)的PrM。

    徐健等[12]和湯德元等[13]將收集到的JEV貴州分離株(GZ株)根據(jù)GenBank登錄的JEVSA14和SA14-14-2株全基因序列設(shè)計(jì)并合成1對擴(kuò)增E基因的特異性引物,用RT-PCR方法擴(kuò)增出JEV貴州分離株E基因,并將E基因克隆到pET-32a-E(+)原核表達(dá)載體上,成功地構(gòu)建出了JEV的 E基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-E,將構(gòu)建好的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DH3)中,誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blot分析,得到了約59 ku條帶,與預(yù)期大小相符,進(jìn)一步提取、純化和濃縮目的蛋白,并將其加入弗氏佐劑后免疫小鼠,免疫后采血檢測抗體。結(jié)果顯示:JEV貴州分離株E基因原核表達(dá)目的蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定抗體水平。

    3.2 日本乙型腦炎病毒的真核表達(dá)的研究進(jìn)展

    Ashok M S等[14]構(gòu)建了編碼JEV E蛋白的DNA質(zhì)粒PCM XENV,經(jīng)鼻腔和肌肉途徑接種瑞士小鼠后,進(jìn)行JEV腦內(nèi)接種攻擊試驗(yàn),結(jié)果顯示:該重組質(zhì)粒對攻擊感染有一定的保護(hù)作用。

    Chen等[15]利用真核表達(dá)載體分別重組構(gòu)建了JEV E蛋白以及其他蛋白基因片段,通過比較上述重組質(zhì)粒在分別免疫動(dòng)物后所產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)與免疫保護(hù)效果,發(fā)現(xiàn)含JEV E蛋白編碼基因的質(zhì)粒DNA所致的中和抗體效價(jià)以及保護(hù)性免疫結(jié)果明顯優(yōu)于其他蛋白基因片段,用編碼JEV E蛋白的質(zhì)粒免疫小鼠,與活疫苗比較,結(jié)果產(chǎn)生了更持久更強(qiáng)的JEV E蛋白特異性抗體,且對JEV的致死具有高度保護(hù)性作用。

    Konishi[16]利用DNA重組技術(shù)分別克隆了JEV E、C、NS1-2A、NS3以及NS5等蛋白編碼基因片段,發(fā)現(xiàn)含有JEV E蛋白編碼基因的質(zhì)粒DNA所致的中和抗體效價(jià)以及保護(hù)性免疫結(jié)果明顯優(yōu)于其他基因片段,說明含JEV E蛋白編碼基因的質(zhì)粒DNA免疫結(jié)果與前述E蛋白功能分析相符合,在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和保護(hù)性免疫方面起著主要作用。研究還發(fā)現(xiàn):含JEV PrME蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒DNA在免疫動(dòng)物后不僅誘導(dǎo)出特異性的CTL細(xì)胞免疫反應(yīng),而且還能產(chǎn)生特異性B細(xì)胞來參與體液反應(yīng),通過進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)在免疫動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體的效價(jià)與維持所需的時(shí)間都明顯高于普通滅活苗的免疫效果[17]。

    Kour R等[18]用合成分泌型或膜錨定型JEV的P rM和E蛋白的質(zhì)粒經(jīng)肌注或基因槍接種小鼠發(fā)現(xiàn):E蛋白的2種表達(dá)類型均能誘導(dǎo)較高的中和抗體滴度,而肌注較基因槍方法能誘導(dǎo)更高水平的抗E抗體反應(yīng);認(rèn)為肌注可能誘導(dǎo)以Thl為主的免疫反應(yīng),而基因槍接種誘導(dǎo)Th2為主的免疫反應(yīng);在小鼠對JEV腦內(nèi)接種的攻擊感染可提供60%的保護(hù)。

    馮國和[19]等提取JEV野生株JaGAr-01感染培養(yǎng)的C6/36細(xì)胞的總RNA,經(jīng)RT-PCR方法擴(kuò)增出JEV prM/E與E基因片段,經(jīng)電泳和核酸測序后分別將它們的蛋白編碼基因片段構(gòu)建于真核表達(dá)載體pcDNA3的BamHI/EcoR I酶切位點(diǎn)之間,并分別將其命名為pJME和pJE。對培養(yǎng)后采用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù),選用HepG2、COS-1、KN73細(xì)胞作為受體細(xì)胞,將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pJME和pJE分別轉(zhuǎn)染于受體細(xì)胞,采用不同抗體系統(tǒng),經(jīng)Western blot法檢測JEV prME和E蛋白的表達(dá)特征,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在不同的細(xì)胞系內(nèi),PrM/ E蛋白的表達(dá)優(yōu)于E蛋白。

    4 對乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)的展望

    根據(jù)乙型腦炎病毒保護(hù)性基因的原核表達(dá),抗原結(jié)合黃病毒C至E區(qū)段各結(jié)構(gòu)蛋白功能特點(diǎn)分析,人們發(fā)現(xiàn)在prM和E蛋白編碼基因所進(jìn)行的DNA疫苗具有一定的代表性。目前,國內(nèi)外應(yīng)用的乙腦疫苗主要有滅活疫苗和減毒疫苗2種。滅活疫苗主要是鼠腦純化滅活疫苗、和地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗。鼠腦純化滅活疫苗是從感染鼠腦培養(yǎng)制備的,由日本研制生產(chǎn)并得到國際廣泛認(rèn)可和使用的疫苗;地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗為我國生產(chǎn),病毒經(jīng)原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)制備的疫苗,1998年開始生產(chǎn)使用,隨后在全國大面積使用。近幾年,Vero細(xì)胞純化滅活疫苗已在研究生產(chǎn),該疫苗主要是我國自主研制的乙腦SA14-14-2株,為目前唯一獲得認(rèn)可和推廣使用的乙腦活疫苗,自1989年獲得新藥證書以來,該疫苗產(chǎn)量不斷增多,并在全國廣泛使用,其弱毒性穩(wěn)定并己經(jīng)得到世界衛(wèi)生組織的認(rèn)可[20];2000年曾明等對該減毒活疫苗進(jìn)行了基因組全序列測定,證明了它傳代后的穩(wěn)定性。隨著分子免疫學(xué)、分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展和生物技術(shù)的進(jìn)步和對JEV的分子生物學(xué)的大量研究,目前預(yù)防乙型腦炎病毒感染的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗,但由于滅活疫苗存在注射量大,需要多次注射,且效果不穩(wěn)定、免疫力不持久以及副作用大等缺點(diǎn),所以減毒苗是一個(gè)更好的選擇;但是活疫苗畢竟是一種活的生物,所以我國研制的SA14-14-2株減毒活疫苗也會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)、帶毒、排毒、垂直傳播和核酸重組等現(xiàn)象,而且通過常規(guī)的血清學(xué)方法一般無法與自然感染區(qū)分開,所以基因工程苗是乙腦疫苗發(fā)展的方向,國內(nèi)外學(xué)者在嵌合病毒疫苗、DNA疫苗、蛋白質(zhì)疫苗和亞病毒顆粒疫苗方面取得了一些進(jìn)展。如用乙腦SA14-14-2病毒的PrM和包膜E蛋白基因代替17D黃熱病毒cDNA的相應(yīng)序列,構(gòu)建了嵌合的減毒乙腦疫苗,免疫鼠和猴子具有安全性、免疫原性和保護(hù)作用[20]?;蚬こ桃呙缬辛己玫陌l(fā)展前景,但有很多實(shí)際問題尚需解決。

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    [20] 俞永新.流行性乙型腦炎減毒活疫苗SA(14 )-14-2弱毒株的表 型和基因型特性及其穩(wěn)定性[J].中國計(jì)劃免疫2002,8(5):283-287.

    2016-01-28)

    貴州大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目(2015)。

    龍冬梅(1990-),女,碩士研究生,主要從事動(dòng)物傳染病病原分子病毒學(xué)的科研學(xué)習(xí)。

    *通訊作者:湯德元(1964-),男,教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)和中西獸醫(yī)結(jié)合的教學(xué)科研工作。E-mail:tdyuan@163.com

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