短期飼喂鐮刀菌毒素飼糧誘導(dǎo)斷奶仔豬陰戶、血清代謝和氧化應(yīng)激指標(biāo)的改變

楊立杰，牛群升，張崇玉，張桂國，姜淑貞，楊維仁

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271018）

短期飼喂鐮刀菌毒素飼糧誘導(dǎo)斷奶仔豬陰戶、血清代謝和氧化應(yīng)激指標(biāo)的改變

楊立杰，牛群升，張崇玉，張桂國，姜淑貞*，楊維仁*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271018）

該試驗(yàn)旨在研究霉變飼糧中鐮刀菌毒素對斷奶仔豬陰戶、血清代謝和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。選用28日齡平均體重（9．59 ± 0．79）kg的健康三元雜交（杜 × 長 × 大）斷奶雌性仔豬15頭，隨機(jī)分為3個(gè)處理。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，50%鐮刀菌毒素組［玉米赤霉烯酮（ZEN），0．90 mg/kg；嘔吐毒素（DON），1．43 mg/kg；煙曲霉毒素（FUM），5．85 mg/kg］和100%鐮刀菌毒素組［ZEN，1．69 mg/kg；DON，2．03 mg/kg；FUM，9．05 mg/kg］分別用50%和100%的霉變玉米和霉變玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)飼糧中的玉米和玉米蛋白粉，預(yù)試期7 d，試驗(yàn)期15 d。結(jié)果表明：與對照組相比，50%和100%鐮刀菌毒素組試驗(yàn)第6 d的陰戶面積顯著增大（P＜0．05）；50%和100%鐮刀菌毒素組仔豬陰戶面積的線性斜率和試驗(yàn)第15 d的陰戶長、寬和面積均顯著大于對照組（P＜0．05）。100%鐮刀菌毒素組試驗(yàn)第8 d和第15 d仔豬血清中膽固醇和尿素均顯著高于對照組（P＜0．05）；而50%鐮刀菌毒素組顯著提高試驗(yàn)第15 d膽固醇和尿素水平（P＜0．05）。與對照組相比，50%和100%鐮刀菌毒素組均顯著提高仔豬試驗(yàn)第8 d和第15 d血清中GSH-Px和SOD活性（P＜0．05）；而MDA含量則相反（P＜0．05）。試驗(yàn)條件下，自然霉變飼糧飼喂斷奶仔豬6 d顯著增加其外陰大小，8 d便顯著改變血清代謝產(chǎn)物和抗氧化酶活性，這些結(jié)果對指導(dǎo)仔豬健康生產(chǎn)具有重要意義。

仔豬；鐮刀菌毒素；陰戶；代謝產(chǎn)物；氧化應(yīng)激

鐮刀菌是農(nóng)作物中最常見的污染性霉菌，生長過程中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物鐮刀菌毒素包括玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、煙曲霉毒素等。全球范圍內(nèi)用于動(dòng)物生產(chǎn)的谷物和飼料受到鐮刀菌毒素的嚴(yán)重污染［1］。在中國，谷物收獲條件的限制和油料加工過程的落后使鐮刀菌毒素的污染加重，低質(zhì)量的玉米和糧食加工副產(chǎn)品，特別是非常規(guī)原料的廣泛使用，使我國鐮刀菌毒素的污染程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出國外［2-4］。鐮刀菌毒素不僅能夠引起斷奶仔豬陰戶紅腫、乳腺增大、子宮增生、生殖激素分泌紊亂以及卵泡病理性發(fā)育［5］，而且對動(dòng)物氧化應(yīng)激［6］和血清代謝產(chǎn)物具有重要影響［7］。盡管國內(nèi)外針對鐮刀菌毒素進(jìn)行了大量的研究，但是大部分研究是采用純毒素形式進(jìn)行［7-10］，而生產(chǎn)中往往是多種鐮刀菌毒素的聯(lián)合作用，且鐮刀菌毒素短期飼喂斷奶仔豬對其陰戶、血清代謝產(chǎn)物和抗氧化指標(biāo)的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)旨在研究飼喂自然霉變玉米和玉米蛋白粉中鐮刀菌毒素短時(shí)間（8 d和15 d）內(nèi)對斷奶仔豬陰戶、血清代謝產(chǎn)物和氧化應(yīng)激的影響，為仔豬健康及生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與管理

選擇28日齡的三元雜交（杜 × 長 × 大）斷奶雌性仔豬15頭（平均體重9．59 ± 0．79 kg），隨機(jī)分為3個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬，各處理組間初始體重差異不顯著（P ＞ 0．05）。

試驗(yàn)豬采用單體籠（0．48 m2）飼養(yǎng)。單體籠均使用塑料漏縫地板，籠內(nèi)安裝有乳頭飲水器和料槽，試驗(yàn)豬自由采食、自由飲水。試驗(yàn)開始前對豬舍進(jìn)行全面清掃、消毒，試驗(yàn)期間保持豬舍清潔的同時(shí)，每周定期進(jìn)行一次豬舍消毒。豬舍內(nèi)安裝紅外保溫?zé)?，?周豬舍內(nèi)環(huán)境溫度維持在30 ℃左右，之后將舍內(nèi)環(huán)境溫度調(diào)整在26～28 ℃，相對濕度保持在65%左右（試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧科技園進(jìn)行）。

表1 飼糧組成（風(fēng)干基礎(chǔ)）

表2 飼糧營養(yǎng)（風(fēng)干基礎(chǔ)）及毒素水平

1.2 試驗(yàn)飼糧與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧參考美國NRC（1998）營養(yǎng)需要配制，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1、表2。試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對照組（Contr．）飼喂基礎(chǔ)飼糧，50%鐮刀菌毒素組（Fusarium Toxins 50%，F(xiàn)T-50）和100%鐮刀菌毒素組（Fusarium Toxins 100%，F(xiàn)T-100）分別用50%和100%的霉變玉米和霉變玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)飼糧中的玉米和玉米蛋白粉，預(yù)試期7 d，試驗(yàn)期15 d。

1.3 試驗(yàn)飼糧的配制、養(yǎng)分含量和毒素水平的測定

1.3.1 鐮刀菌毒素飼糧的配制

先配制對照飼糧；再用全部自然霉變玉米代替基礎(chǔ)飼糧中的玉米，用霉變玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)飼糧中的玉米蛋白粉配制100%鐮刀菌毒素飼糧；然后用等量的對照飼糧和100%鐮刀菌毒素飼糧混合配制成50%鐮刀菌毒素飼糧。試驗(yàn)期間所需飼糧于試驗(yàn)正式開始前1周一次性配制完成，分別在試驗(yàn)開始前和結(jié)束后對飼糧進(jìn)行取樣，用以分析飼糧中的毒素和粗蛋白質(zhì)水平［11］。

1.3.2 飼糧毒素測定

玉米赤霉烯酮（ZEN）、黃曲霉毒素（AFL）和煙曲霉毒素（FUM）的測定采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）和熒光測定法，嘔吐毒素（DON）的測定采用高效液相色譜法（HPLC）。ZEN、DON、AFL和FUM的最低檢測限分別為0．1 mg·kg-1、0．1 mg·kg-1、1．0 μg·kg-1和0．25 mg·kg-1。飼糧毒素水平見表2，黃曲霉毒素未檢出或低于檢測限水平。

1.4 陰戶面積

試驗(yàn)期間每隔3 d用游標(biāo)卡尺測量仔豬陰戶長、寬，并計(jì)算陰戶面積。仔豬陰戶近似菱形，所以本研究以菱形的面積公式（長×寬）/2來近似計(jì)算仔豬陰戶面積（圖1），以比較各組仔豬陰戶的增大效果。

1.5 血樣的采集、處理與測定

試驗(yàn)中期（第8 d）和結(jié)束（第15 d），對仔豬進(jìn)行前腔靜脈空腹采血（約30 mL），3 000 r/min 下離心10 min 分離血清，待測定血清代謝產(chǎn)物、血清抗氧化物酶和丙二醛含量。

圖1 陰戶大小的測量與計(jì)算

1.5.1 血清代謝產(chǎn)物

血清代謝產(chǎn)物膽固醇、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和尿素含量測定采用COBAS MIRA Plus（Roche DiagnosticSystem Inc．， 瑞士）全自動(dòng)生化分析儀測定。

1.5.2 血清抗氧化物酶和丙二醛分析

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）采用可見光法測定，超氧化物歧化酶（SOD）采用羥胺法測定，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定。GSH-Px測試盒（A005）、SOD測試盒（A001-1）和MDA測試盒（A003-1）購自南京建成生物工程研究所（南京），具體測定方法均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9．1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），差異顯著性采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。通過普通截距多元線性回歸分析評價(jià)仔豬陰戶大小隨時(shí)間的變化規(guī)律，并根據(jù)t-檢驗(yàn)確定線性斜率的顯著性，顯著性水平P ＜ 0．05。

表3 鐮刀菌毒素對斷奶仔豬陰戶大小的影響

圖2 仔豬陰戶面積隨時(shí)間的線性關(guān)系。同一時(shí)間點(diǎn)不同字母表示差異顯著（P＜0.05）

表4 鐮刀菌毒素對斷奶母豬陰戶面積影響的普通截距多元線性回歸（d-0, 3, 6, 9, 12 and 15）

2 結(jié)果與分析

2.1 陰戶大小

鐮刀菌毒素對斷奶仔豬陰戶大小的影響見表3、圖2和表4。試驗(yàn)開始時(shí)（0 d）所有處理仔豬的陰戶長、寬和面積差異均不顯著（P ＞ 0．05）；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（15 d）50%和100%鐮刀菌毒素組仔豬的陰戶長、寬、面積及其增量都顯著大于對照仔豬（P ＜ 0．05）；但50%與100%鐮刀菌毒素組之間仔豬（15 d）陰戶長、寬、面積及其增量差異均不顯著（P ＞ 0．05）。隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長，仔豬的陰戶面積線性增加（P＜ 0．05，圖2），試驗(yàn)第6 d 開始50%和100%鐮刀菌毒素組陰戶面積均顯著大于對照組（P＜ 0．05）。對照組、50%和100%鐮刀菌毒素組陰戶面積的線性斜率分別為1．93、10．21和11．64，對不同處理的線性斜率進(jìn)行t-檢驗(yàn)，50%和100%鐮刀菌毒素組陰戶面積的線性斜率均顯著大于對照組（P＜ 0．05，表4）。

2.2 血清代謝產(chǎn)物

鐮刀菌毒素對斷奶仔豬血清代謝產(chǎn)物的影響見表5。100%鐮刀菌毒素組仔豬試驗(yàn)第8 d和第15 d血清中膽固醇含量和尿素水平均顯著高于對照組（P＜ 0．05）。試驗(yàn)第15 d，50%鐮刀菌毒素組仔豬血清中膽固醇含量和尿素水平均顯著高于對照組（P＜ 0．05）。不管是試驗(yàn)第8 d，還是試驗(yàn)第15 d，50%和100%鐮刀菌毒素組之間測定指標(biāo)差異均不顯著（P＞ 0．05）。

表5 鐮刀菌毒素對斷奶仔豬血清代謝產(chǎn)物的影響

表6 鐮刀菌毒素對斷奶仔豬血清谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和丙二醛的影響

2.3 血清谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和丙二醛

鐮刀菌毒素對斷奶仔豬血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的影響見表6。無論試驗(yàn)第8 d，還是試驗(yàn)第15 d，50%鐮刀菌毒素組仔豬血清中GSH-Px和SOD活性均顯著低于對照組（P＜ 0．05），100%鐮刀菌毒素組仔豬血清中GSH-Px和SOD活性均顯著低于50%鐮刀菌毒素組（P ＜ 0．05）。無論試驗(yàn)第8 d，還是試驗(yàn)第15 d，50%鐮刀菌毒素組仔豬血清中MDA含量顯著高于對照組（P ＜ 0．05），100%鐮刀菌毒素組仔豬血清中MDA含量顯著高于50%鐮刀菌毒素組（P ＜ 0．05）。

3 討論

試驗(yàn)中盡管我們選擇優(yōu)質(zhì)原料配制對照飼糧，但是遺憾的是對照飼糧中也檢測到不同程度的毒素含量，這進(jìn)一步說明我國鐮刀菌毒素污染的普遍性及本研究的迫切性。本試驗(yàn)對照飼糧中玉米赤霉烯酮（ZEN）、嘔吐毒素（DON）和煙曲霉毒素（FUM）的水平低于我國飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)定的小于0．5 mg/kg（GB13078．2-2006）、1 mg/kg（GB13078．3-2007）（我國對于飼料中FUM還沒有制定相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)）以及歐盟關(guān)于仔豬飼糧中ZEN、DON和FUM小于0．1 mg/kg、0．9 mg/kg和5 mg/kg（EC，2006）的最高限量規(guī)定。而試驗(yàn)飼糧中ZEN、DON和FUM均超過我國飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和歐盟仔豬飼糧中的最高限量，且試驗(yàn)組鐮刀菌毒素水平梯度增加，因此對照組鐮刀菌毒素的含量不影響試驗(yàn)組結(jié)果的判斷。本試驗(yàn)100%鐮刀菌素組平均日采食量和日增重均顯著低于對照組，而50%鐮刀菌素組僅平均日增重顯著低于對照組，其他差異不顯著［12］。

3.1 陰戶大小

鐮刀菌毒素對斷奶仔豬陰戶大小的影響主要是霉變玉米和霉變玉米蛋白粉中含有的ZEN。姜淑貞等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，低劑量ZEN（1．1～3．2 mg/kg）能夠顯著增加斷奶仔豬生殖器官指數(shù)和陰戶大小，且隨ZEN增加呈劑量依賴特性。本試驗(yàn)條件下，無論是50%還是100%鐮刀菌毒素組，試驗(yàn)第6 d仔豬外陰比對照組明顯紅腫，陰戶長、寬及陰戶面積較對照組均明顯增大且差異顯著，進(jìn)一步證實(shí)自然霉變飼糧中0．9 mg/kg ZEN足以誘導(dǎo)仔豬生殖系統(tǒng)毒性，但是本試驗(yàn)中DON和FUM是否加重ZEN的生殖毒性還有待進(jìn)一步體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)。

3.2 血清代謝產(chǎn)物

本試驗(yàn)條件下，100%霉菌毒素組在試驗(yàn)第8 d膽固醇水平便顯著高于對照組，試驗(yàn)第15 d兩個(gè)鐮刀菌毒素組膽固醇水平均顯著高于對照組。血清尿素水平與蛋白質(zhì)代謝有密切關(guān)系，血清尿素含量與飼糧氮利用率成反比，能夠衡量飼糧蛋白質(zhì)的生物學(xué)價(jià)值［7，13］。Drochner等（2006）分別用DON含量0、300、600和1 200 μg/kg飼糧飼喂仔豬時(shí)，證實(shí)仔豬血清中血糖與尿素含量呈負(fù)相關(guān)，并提出可能是由于DON破壞了氨基酸的正常代謝［14］。本試驗(yàn)中100%鐮刀菌毒素組在試驗(yàn)第8 d血清尿素水平便顯著高于對照組，試驗(yàn)第15 d兩個(gè)鐮刀菌毒素組尿素水平均顯著高于對照組，表明鐮刀菌毒素促進(jìn)了蛋白質(zhì)的分解代謝。

3.3 血清谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和丙二醛

谷胱甘肽過氧物酶（GSH-Px）超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體重要的抗氧化酶，能夠清除氧自由基，而丙二醛（MDA）則是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，通過檢測仔豬血清中GSH-Px和SOD活性以及MDA含量，可以判斷組織氧化損傷程度［15］。研究發(fā)現(xiàn)，ZEN濃度在10 μmol/L以上即能誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時(shí)ZEN和DON均使細(xì)胞MDA產(chǎn)生增加［16］。ZEN（40 mg/kg BW）處理小鼠肝臟SOD和GSH-Px活性顯著降低［17］。姜淑貞（2010）研究發(fā)現(xiàn)2．0和3．2 mg/kg ZEN處理仔豬血清和肝臟中SOD和GSH-Px的活性顯著低于對照組，同時(shí)MDA濃度則顯著升高。Mobio等（2000）進(jìn)一步證實(shí)了6 μmol/L FUM便可誘導(dǎo)大鼠膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［18］。不同毒素誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的能力是不同的，Kouadio等（2005）證實(shí)在1～150 μmol/L濃度范圍內(nèi)FUM比ZEN和DON更容易誘導(dǎo)人體Caco-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激，且3種毒素誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的能力為FUM＞DON＞ZEN。本試驗(yàn)中50%和100%鐮刀菌毒素組仔豬血清GSH-Px和SOD活性無論試驗(yàn)第8 d還是試驗(yàn)第15 d均顯著低于對照組，而MDA含量顯著高于對照組，表明本試驗(yàn)條件下，3種鐮刀菌毒素誘導(dǎo)仔豬氧化應(yīng)激，降低了仔豬清除氧自由基的能力，增強(qiáng)了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，但其聯(lián)合作用及其機(jī)制尚需進(jìn)一步證實(shí)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，與對照組相比，鐮刀菌毒素在試驗(yàn)第6 d使斷奶仔豬陰戶顯著紅腫；在試驗(yàn)第8 d顯著提高血清中膽固醇、尿素和MDA水平，降低血清GSH-Px和SOD的活性。

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2016-01-13）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)（SDAIT-06-022-05）

楊立杰(1992 ），男，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料，碩士研究生，E-mail：724832205@qq.com

*通訊作者：姜淑貞，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：shuzhen305@163.com；楊維仁，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：wryang@sdau.edu.cn