自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對腦梗死大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

蔣 超 孔維霞 朱 麗 羅 煥

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 1)神經(jīng)內(nèi)科 2)超聲醫(yī)學(xué)科 鄭州 450052

?

自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對腦梗死大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

蔣 超1)孔維霞2)朱 麗1)羅 煥1)

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 1)神經(jīng)內(nèi)科 2)超聲醫(yī)學(xué)科 鄭州 450052

目的 研究骨髓單個(gè)核細(xì)胞對腦梗死后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響，探討骨髓單個(gè)核細(xì)胞對腦梗死治療作用的可能機(jī)制。方法 成年雄性SD大鼠 72只，體質(zhì)量250～300 g。梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞純度，將由模型動物股骨骨髓腔內(nèi)分離出的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)尾靜脈途徑移植到大鼠體內(nèi)；線栓法制作腦梗死動物模型，分別于腦梗死后24 h、72 h通過Western blot技術(shù)檢測腦部BDNF的表達(dá)；室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況于腦梗死7 d時(shí)通過BrdU/Nestin免疫熒光雙染技術(shù)進(jìn)行檢測。結(jié)果 經(jīng)骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植24 h、72 h時(shí)，BDNF表達(dá)的水平在腦梗死大鼠腦部明顯增高，與模型組及溶劑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植還促進(jìn)了腦梗死7 d時(shí)室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植組與模型組以及溶劑治療組比較，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植可以顯著增加腦梗死大鼠腦部BDNF的表達(dá)、并促進(jìn)室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的動員。骨髓單個(gè)核細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用可能與骨髓單個(gè)核細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

腦梗死；骨髓單個(gè)核細(xì)胞；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；神經(jīng)干細(xì)胞；神經(jīng)營養(yǎng)作用

自體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有利于腦梗死后神經(jīng)功能的恢復(fù)，腦內(nèi)神經(jīng)的發(fā)生受多重因素的調(diào)節(jié)。缺血性或創(chuàng)傷性損傷可上調(diào)成年哺乳動物的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化[1，2]。在受損的腦組織，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力可被腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等外界的刺激物所加強(qiáng)[3]。既往研究表明骨髓單個(gè)核細(xì)胞具有促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)BDNF分泌的能力，但關(guān)于其對神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的研究尚屬少見。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，體質(zhì)量250～300 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。所有操作程序均遵守鄭州大學(xué)動物管理委員會規(guī)定。動物飼養(yǎng)、管理按二級動物標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。按隨機(jī)化原則將所用實(shí)驗(yàn)動物分為4組，即假手術(shù)組(Control)、模型組(Ischemia)、溶劑治療組(Vehicle)和骨髓單個(gè)核細(xì)胞治療組(BMMNC)。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠用于Western blot檢測，每組6只用于熒光染色。

1．2 腦梗死動物模型制作 大腦中動脈局灶性腦缺血模型的制備采用線栓法[4]。腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉。假手術(shù)組只分離、暴露血管，不結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈，不插入尼龍魚線。模型組大鼠，仰臥固定，頸部正中切口，在頸內(nèi)、外動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，并分離并暴露左側(cè)頸總及頸內(nèi)、外動脈，左側(cè)頸總動脈剪口，插入頭端燒成圓鈍形尼龍魚線，進(jìn)線長度18～19mm，模型成功后，將頸總動脈連同尼龍魚線一起結(jié)扎，縫合皮膚，放回籠內(nèi)，單籠喂養(yǎng)。選擇右上肢屈曲、行走時(shí)向右側(cè)旋轉(zhuǎn)或右側(cè)肢體癱瘓的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離、純化 腹腔注射水合氯醛(0.4 g/kg)麻醉大鼠，在脛骨外側(cè)皮膚上做一小切口，暴露脛骨，去除骨膜，利用牙科鉆在脛骨上鉆一1.25×2.5 mm的小孔直達(dá)骨髓腔，將一細(xì)針插入骨髓腔內(nèi)，并連接到一個(gè)肝素化注射器上，通過前后移動細(xì)針，抽取骨髓，骨蠟封閉鉆孔，縫合皮膚。將收集到的骨髓細(xì)胞進(jìn)行離心，用含0.5%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗滌，將洗滌過的細(xì)胞懸浮于199培養(yǎng)基內(nèi)，并將細(xì)胞懸液加入含20 mL淋巴細(xì)胞分離液的50 mL錐形瓶中、進(jìn)行離心[5]。收集骨髓單核細(xì)胞，用含0.5%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗滌并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。然后將骨髓單核細(xì)胞懸浮于無菌冷磷酸鹽緩沖液內(nèi)，并達(dá)到所需的細(xì)胞濃度，備用；假手術(shù)組、模型組及溶劑治療組亦經(jīng)骨髓腔內(nèi)抽出等量的骨髓細(xì)胞，假手術(shù)組、模型組不進(jìn)行細(xì)胞移植，溶劑治療組經(jīng)尾靜脈途徑注射等劑量的生理鹽水。取收集的骨髓單核細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)達(dá)1×106，1 000 rpm離心5 min，棄上清液，用PBS洗滌2次，取1 mL液體，輕搖離心管后，將骨髓單核細(xì)胞混勻，加入2 μL一抗(CD45)，室溫孵育1 h，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。結(jié)果通過儀器CellQuest軟件分析。

1．4 Western blot 檢測腦梗死后BDNF的表達(dá)情況分別于腦梗死后24 h、72 h取腦組織，以RIPA裂解液冰浴下裂解并超聲裂解梗死區(qū)的皮層組織。采用Bradford法測定蛋白含量，并將分離后的蛋白通過半干途徑轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉 2 h。加入一抗過夜后，用TBST溶液洗膜 3次，每次洗滌時(shí)間為10 min。然后將PVDF膜置于以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。用TBST溶液洗膜3次，每次洗滌時(shí)間為5 min。X-射線膠片曝光后，對免疫印記條帶的相對密度用電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析和定量[4]。

1．5 免疫熒光雙染檢測室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖 于腦梗死后7 d取腦組織，冰凍切片置4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中(4°C)固定15 min。透膜封閉液封閉透膜2 h含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉 2 h。一抗過夜，二抗室溫孵育切片。分別用PBS洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡下，激發(fā)/發(fā)射波長488/525 nm的FITC呈綠色熒光，激發(fā)/發(fā)射波長550/565 nm的Cy3呈紅色熒光。

2 結(jié)果

2．1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞對腦部BDNF蛋白表達(dá)的影響 Western blot定量檢測結(jié)果表明，對照組腦組織內(nèi)BDNF蛋白的表達(dá)量較少，經(jīng)骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞治療后其表達(dá)水平明顯增高，而溶劑治療組與模型組腦組織內(nèi)BDNF蛋白的表達(dá)量僅略有增高。統(tǒng)計(jì)分析表明，骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞治療組與模型組、溶劑治療組比較，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞移植后腦部BDNF的分泌明顯升高。見表1。

表1 腦梗死24 h、72 h時(shí)周圍腦組織BDNF的檢測結(jié)果 (OD目的條帶/β-actin)

注：*與假手術(shù)組及溶劑治療組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01

2．2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞對室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響 腦梗死7 d時(shí)室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的熒光雙染結(jié)果(雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù))：對照組2.98±1.01，模型組4.16±1.13，溶劑治療組4.33±1.37，黃體酮治療組12.35±2.92。對照組大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞多處于靜止?fàn)顟B(tài)，Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量很少；缺血7 d時(shí)逐漸出現(xiàn)室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的活化、增殖，Nestin陽性細(xì)胞數(shù)增加，但是數(shù)量不多；經(jīng)黃體酮治療7 d后，室管膜下區(qū)BrdU/Nestin 免疫熒光染色雙陽性的細(xì)胞數(shù)量明顯增多。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理表明，4組之間比較，7 d時(shí)F(3，23)值為36.63(P<0.01)。組間兩兩比較的結(jié)果表明，黃體酮治療組與模型組以及溶劑治療組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；說明經(jīng)黃體酮治療后腦部室管膜下區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖數(shù)量明顯增多，骨髓單核細(xì)胞不但具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，亦具有促進(jìn)自體神經(jīng)干細(xì)胞動員的能力。

3 討論

細(xì)胞移植治療有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)，對腦血管病具有潛在的治療價(jià)值。動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，骨髓源性細(xì)胞是對腦梗死具有很高治療價(jià)值的眾多來源細(xì)胞中的一種。骨髓源性細(xì)胞主要包括骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells BMSCs)與骨髓單個(gè)核細(xì)胞(Bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是具有多種分化潛能的干細(xì)胞，該細(xì)胞移植可以減輕腦梗死后神經(jīng)功能的缺損；且具有分離簡單、不良反應(yīng)少等缺點(diǎn)。然而骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)過程較為復(fù)雜，自體來源骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在急性及亞急性缺血性腦血管病患者的臨床應(yīng)用方面受到很大的限制。單核細(xì)胞在骨髓中亦占有一定的比例，骨髓單核細(xì)胞的成分主要包括間質(zhì)細(xì)胞及造血細(xì)胞[5]。將骨髓單核細(xì)胞用于缺血性腦血管病治療方面的研究目前在國內(nèi)外鮮有報(bào)道。

脊椎動物腦部具有增殖能力的神經(jīng)前體細(xì)胞主要位于前腦側(cè)腦室附近的室管膜下區(qū)(SVZ)和海馬齒狀回顆粒下區(qū)(SGZ)，這些前體細(xì)胞具有分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的能力、并行使一定的生理功能。神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員包含BDNF等，已有研究闡述了BDNF在腦梗死后神經(jīng)發(fā)生過程中的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，將經(jīng)BDNF轉(zhuǎn)染的腺病毒通過立體定位注射的方式導(dǎo)入腦內(nèi)，可以促進(jìn)SGZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，有助于神經(jīng)發(fā)生及神經(jīng)功能的恢復(fù)[6]。另有研究表明，經(jīng)BDNF治療的大鼠，其紋狀體、下丘腦等腦室周圍組織內(nèi)新生神經(jīng)元的數(shù)量顯著明顯[7]。所有上述研究均說明中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)的發(fā)生與BDNF的神經(jīng)營養(yǎng)作用密切相關(guān)。通過BDNF側(cè)腦室注射除增加了SVZ區(qū)神經(jīng)的發(fā)生外，亦在沿側(cè)腦室和第三腦室排列的紋狀體、隔區(qū)、下丘腦和海馬中等特殊皮質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目均明顯增多，且在上述區(qū)域新產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞可表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物(Neun)和微管相關(guān)蛋白MAP2等。以上體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究均表明，BDNF促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的作用是其它類型神經(jīng)營養(yǎng)因子所不能代替的，且通過提升BDNF的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)的發(fā)生可能對腦梗死的治療具有重大意義[6]。

另有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)的發(fā)生與腦梗死后神經(jīng)功能的恢復(fù)關(guān)系密切[8-9]；該研究表明骨髓單個(gè)核細(xì)胞既促進(jìn)了腦部神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放及室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，提示骨髓單個(gè)核細(xì)胞可能對腦梗死具有突出的治療價(jià)值。關(guān)于骨髓單個(gè)核細(xì)胞促進(jìn)BDNF分泌的可能機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究，如果骨髓單個(gè)核細(xì)胞在腦梗死方面的基礎(chǔ)研究能夠得到進(jìn)一步的證實(shí)，必將為骨髓單個(gè)核細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

[1] Kokaia Z，Lindvall O．Neurogenesis after ischaemic brain insults[J]．Current Opinion in Neurobiology，2003，13(1)：127-132．

[2] Shi Q，Zhang P，Zhang J，et al．Adenovirus-mediated brain-derived neurotrophic factor expression regulated by hypoxia response element protects brain from injury of transient middle cerebral artery occlusion in mice[J]．Neurosci Lett，2009，465(3)：220-225．

[3] Ivanova T，Beyer C．Pre- and postnatal expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA/protein and tyrosine protein kinase receptor B mRNA in the mouse hippocampus[J]．Neurosci Lett，2001，307(1)：21-24．

[4] Jiang C，Wang JP，Li X，et al．Progesterone exerts neuroprotective effects by inhibiting inflammatory response after stroke[J]．Inflammation Res，2009，9(8)：619-624．

[5] 蔣超，王建平，何遠(yuǎn)宏．自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對腦梗死的治療作用[J]．中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2012，11(4)：353-357．

[6] Hunsberger J，Austin DR，Henter ID，et al．The neurotrophic and neuroprotective effects of psychotropic agents[J]．Dialogues Clin Neurosci，2009，11(3)：333-348．

[7] Lee E，Son H．Adult hippocampal neurogenesis and related neurotrophic factors[J]．BMB Rep，2009，42(5)：239-244．

[8] Ryu HH，Lim JH，Byeon YE，et al．Functional recovery and neural differentiation after transplantation of allogenic adipose-derived stem cells in a canine model of acute spinal cord injury[J]．J Vet Sci，2009，10(4)：273-284．

[9] Belayev L，Khoutorova L，Zhao KL，et al．A novel neurotrophic therapeutic strategy for experimental stroke[J]．Brain Res，2009，14：117-123．

(收稿2016-04-20)

The influence of auto-transplantation with bone marrow mononuclear cells on proliferation of neural stem cells insubventricular zone in rats with cerebral infarction

JiangChao，KongWeixia，ZhuLi，LuoHuan

DepartmentofNeurology，theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China

Objective Our study aimed at investigating the effects of bone marrow mononuclear cells(BMMNCs)on brain-derived neurotrophic factors(BDNF)and on proliferation of neural stem cells in subventricular zone in rats with cerebral infarction，in order to explore the potential mechanisms of BMMNCs on cerebral infarction．Methods Totally 72 adult male Sprague-Dawley rats weighing 250 to 300 g were used in this study．We performed thread occlusion technique to establish the model of cerebral infarction．Mononuclear cells(MNCs)isolated from femoral marrow cavity were separated by using density-gradient centrifugation method and the purity of selected cells was identified by flow cytometer．Then the separated MNCs were transplanted into rats via tail vein injection．The expression of BDNF in brain was detected by Western blotting method at 24h and 74h after stroke and proliferation of neural stem cells in subventricular zone was tested by double BrdU/Nestin immunofluorescence staining on the seventh day after stroke．Results At 24 h and 72 h after auto-transplantation with bone marrow mononuclear cells，the expression of BDNF in transplantation group was obviously increased and showed statistical differences compared with model group and solvent group(allP<0.05)．Proliferation of neural stem cells in subventricular zone in the transplantation group was significantly improved，which presented statistical differences relative to both model group and solvent group(allP<0.05)．Conclusion BMMNCs can not only significantly increase the expression of BDNF but also effectively improve proliferation of neural stem cells in subventricular zone．The improvement of BMMNCs may be closely associated with the protective effect of BMMNCs．

Cerebral infarction；BMMNCs；Brain-derived neurotrophic factor；Neural stem cells；Neurotrophic effect

R-332

A

1673-5110(2016)20-0009-03