鵪鶉致病性大腸桿菌分離鑒定及抗生素敏感性試驗(yàn)

李章程，胡 洋，黃書倫，程方俊，伊光紅，聶青青

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

鵪鶉致病性大腸桿菌分離鑒定及抗生素敏感性試驗(yàn)

李章程，胡 洋，黃書倫，程方俊，伊光紅，聶青青

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

為確診四川某養(yǎng)殖場(chǎng)產(chǎn)蛋鵪鶉死亡的病因，本試驗(yàn)采集病死鵪鶉的肝臟、心血等組織分離純化細(xì)菌，并進(jìn)行了細(xì)菌形態(tài)觀察、生化特性檢查、16S rRNA分子鑒定以及藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示：從肝臟、心血等組織中分離的細(xì)菌為致病性大腸桿菌；分離菌對(duì)環(huán)丙沙星、阿米卡星、大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素、頭孢噻肟的敏感率均在84%以上，對(duì)氨芐西林、卡那霉素耐藥。

鵪鶉；大腸桿菌；分離鑒定；抗生素敏感性

本試驗(yàn)采集四川某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病死亡的產(chǎn)蛋鵪鶉病料進(jìn)行病原的分離與鑒定，然后進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 四川自貢某鵪鶉養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病死亡的產(chǎn)蛋鵪鶉。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 20只臨床健康的七日齡鵪鶉，購(gòu)于西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物管理科。

1.1.3 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基等，細(xì)菌微量編碼鑒定管，PCR試劑盒等，DNA Marker、核酸染色劑等，氨芐西林等10種常見(jiàn)藥敏紙片。

1.2 方法

1.2.1 剖檢變化 剖檢150日齡病死鵪鶉，發(fā)現(xiàn)其心臟表面有一層灰白色纖維素性薄膜覆蓋，心包積液嚴(yán)重；肝臟腫大；部分腸管粘連，腸黏膜充血；卵巢中卵泡變形、變性、有出血點(diǎn)，輸卵管水腫，嚴(yán)重的呈卵黃性腹膜炎。

1.2.2 病原分離培養(yǎng)與細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查 無(wú)菌采集發(fā)病鵪鶉的肝臟、心臟、肺臟等組織病料，分別接種于兔血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h。分離純化后，取麥康凱培養(yǎng)基上的紅色菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3 生化特性鑒定 對(duì)分離純化的細(xì)菌進(jìn)行糖發(fā)酵、吲哚、VP、MR、枸櫞酸鹽、三糖鐵、氧化酶等試驗(yàn)，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4 藥物敏感性試驗(yàn) 將分離純化的試驗(yàn)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，將菌液制備成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬?.5×109CFU/mL）的菌懸液。用滅菌棉球蘸取菌懸液，均勻涂布在瓊脂平板表面，室溫靜置幾分鐘，無(wú)菌夾取藥敏紙片貼放于培養(yǎng)基表面，藥敏紙片之間的中心距離應(yīng)大于30mm，37℃培養(yǎng)24h后，測(cè)量抑菌環(huán)的直徑。

1.2.5 16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 將分離菌接種于普通LB瓊脂平板上培養(yǎng)24h，提取細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)引物為細(xì)菌16S rRNA基因通用引物，反應(yīng)體系參考呂朋沙等[1]的試驗(yàn)報(bào)告。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)切膠回收后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

將分離菌株的16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果與Gen-Bank公布的其他大腸桿菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAstar進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 選取3株分離菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24h后，用滅菌生理鹽水配制成細(xì)菌濃度為5×108CFU/mL的菌懸液備用。將健康鵪鶉隨機(jī)分為4組，試驗(yàn)組每只腹腔注射0.2mL菌液，對(duì)照組不做處理正常飼喂，然后記錄發(fā)病及死亡情況。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離與形態(tài)觀察 分離株在兔血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)24h后出現(xiàn)圓形、凸起、光滑、濕潤(rùn)、灰白色的菌落，直徑約2～3mm，不溶血；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈粉紅色、中等大小、表面光滑濕潤(rùn)、不透明的菌落形態(tài)。將以上培養(yǎng)物經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，觀察到許多兩端鈍圓、散在分布的陰性短桿菌。

2.2 細(xì)菌生化特性 生化試驗(yàn)結(jié)果為三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面和底部呈現(xiàn)黃色，氧化酶陰性，吲哚、MR陽(yáng)性，VP、枸櫞酸鹽陰性，且均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇，與大腸桿菌的生化特性相符[2]。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)2008年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦的標(biāo)準(zhǔn)判定[3]。結(jié)果顯示該13株分離菌對(duì)氨芐西林和卡那霉素耐藥，對(duì)鏈霉素、大觀霉素、阿米卡星等8種抗生素敏感性較高。

2.4 16S rRNA基因擴(kuò)增 隨機(jī)選擇3株菌，提取其基因組，擴(kuò)增16S rRNA基因序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，得出目的基因擴(kuò)增片段大小與預(yù)期條帶基本相同，約為1500bp左右（見(jiàn)圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增的16S rRNA電泳結(jié)果

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 將生物公司的測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知的10株大腸桿菌序列進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果顯示同源性為98.2%～99.6%，其中ZG-2、ZG-3、ZG-7與JN811622.1的同源性最高（為99.6%）。進(jìn)化樹(shù)分析表明，3株分離菌與JN811622.1 E.coli和HQ169124.1 E.coil為同一簇，親緣關(guān)系最近。

2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組鵪鶉接種菌液17 h后普遍出現(xiàn)精神萎頓、腹瀉、糞便呈灰黃色、食欲廢絕、站立不穩(wěn)、呼吸困難等臨床癥狀，接種后24 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，接種后48h全部死亡；而對(duì)照組鵪鶉健康無(wú)死亡情況。剖檢死亡鵪鶉，可見(jiàn)肺部有出血點(diǎn)，肝臟和脾臟出現(xiàn)不同程度的腫大，心包膜粗糙并附著纖維素性分泌物。然后從死亡鵪鶉體內(nèi)重新分離到了該致病菌的純培養(yǎng)物。

3 討論和小結(jié)

3.1 鵪鶉大腸桿菌病是常見(jiàn)疾病 隨著鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鵪鶉的常見(jiàn)疾病越來(lái)越多，大腸桿菌病就是其中的一種。鵪鶉大腸桿菌病一年四季均可發(fā)病，鵪鶉一生都可感染，幼鶉和6月齡后的鵪鶉發(fā)病率較高[4]，本次試驗(yàn)的發(fā)病鵪鶉在5月齡預(yù)防，當(dāng)養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)細(xì)菌病，應(yīng)選用對(duì)細(xì)菌比較敏感的藥物進(jìn)行治療?！?/p>

[1]呂朋沙，張菊，劉書超，等.鵝源沙門菌分離鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2014，50（9）：10-13.

[2]布坎南 R E，吉本斯 N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組, 譯.8版.北京：科學(xué)出版社，1984.

[3] National Committee for Clinical Laboratory Standards，Performance Standards for Antimicrobial disk Susceptibility Tests[S].Wayne PA：Approved Standard Second Edition，NCCLS，2003：M31-A2.

[4]丁伯良.特種禽類養(yǎng)殖技術(shù)手冊(cè)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000：45.

[5] 張麗華，劉雷生，董群.一例鵪鶉大腸桿菌病的診治[J].中國(guó)畜禽種業(yè)，2012（11）：142-143.

[6] 李忠顯，劉洪敏.鵪鶉大腸桿菌病的診斷防治[J].畜牧與獸醫(yī)，2005，37（2）：64.

[7] 蘭玲，馬亞珍.一起鵪鶉大腸桿菌病的診斷治療[J].新疆畜牧業(yè)，2011（7）：54-55.

[8] 李沐森，姜成，吳斌.鵪鶉大腸桿菌病的診治[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2007，10（1）：20.

[9]劉建華，苑麗，李鳳娟，等.鴨致病性大腸桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（7）：161-163.

Isolation，Identification and Antibiotics Sensitivity Test of Escherichia Coli From the Quail

LI Zhangcheng，HU Yang，HUANG Shulun，et al.
（Department of Veterinary Medicine of Rongchang Campus，Southwest University，Chongqing Rongchang 402460，China）

To study the death cause of egg quails in a farm，some strains of pathogenic bacteria were isolated from liver and heart samples of sick quails.These strains were identified as E.coli by morphologic characters，biochemical identification，drug sensitive test and 16S rRNA sequence analysis，and they had strong pathogenic.The sensitive rates to ciprofloxacin，amikacin，spectinomycin，streptomycin，gentamicin and cefotaxime had more than 84%，meanwhile，they were resistant to ampicillin and kanamycin.

Quail；E.coli；Isolation and identification；Antibiotic sensitivity

S858.395.12

B

1001-8964（2016）04-0029-02

2016-01-20

西南大學(xué)教改項(xiàng)目（2014JY100）

李章程（1996-），男，云南宣威人，大學(xué)本科。

*通訊作者：程方?。?962-），副教授。E-mail：cfj-xn@163. com.