菌酶共降解棉秸稈的工藝研究

侯敏，包慧芳，王寧，詹發(fā)強(qiáng)，楊蓉，龍宣杞，崔衛(wèi)東

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

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菌酶共降解棉秸稈的工藝研究

侯敏，包慧芳，王寧，詹發(fā)強(qiáng)，楊蓉，龍宣杞，崔衛(wèi)東

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

【目的】研究菌酶共降解棉秸稈工藝，為菌酶混合棉秸稈固體發(fā)酵的研究提供相應(yīng)的工藝參數(shù)和理論依據(jù)?！痉椒ā扛鶕?jù)羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活確定最佳混菌組，采用正交試驗(yàn)，研究不同混菌組、酶制劑、含水量對(duì)NDF含量、ADF含量、纖維素含量、纖維素降解率的影響，并且通過(guò)感官評(píng)價(jià)、pH值及干物質(zhì)含量確定發(fā)酵棉稈品質(zhì)?！窘Y(jié)果】發(fā)酵最優(yōu)條件為A1B2C2，即混菌組為L(zhǎng)p+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1，酶活為15 000 U/g，加水量為50%。最優(yōu)發(fā)酵條件下，NDF含量降低4.61%，ADF含量降低8.01%，纖維素含量降低10.74%，纖維素降解率達(dá)25.62%，pH值為4.21，干物質(zhì)含量為54.2%，棉稈品質(zhì)為優(yōu)等?！窘Y(jié)論】菌酶混合發(fā)酵棉秸稈提高棉稈品質(zhì)的最佳條件。

棉稈；混菌；酶；固體發(fā)酵；棉稈品質(zhì)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國(guó)畜牧業(yè)主產(chǎn)區(qū)之一[1]，飼草料極為短缺，年缺口超過(guò)1 300×104t，嚴(yán)重制約畜牧業(yè)發(fā)展。新疆棉花種植面積約占全國(guó)的1/3，棉稈資源相當(dāng)豐富，年產(chǎn)量達(dá)1 000×104t以上。新疆棉花秸稈中粗蛋白的含量為6.5%，比玉米秸稈、稻草和小麥秸稈的粗蛋白含量都要高[2]。因此，棉花秸稈具備制作優(yōu)質(zhì)飼草料的基礎(chǔ)。纖維素是棉稈的主要成分，與半纖維素、木質(zhì)素通過(guò)分子間氫鍵形成一種復(fù)雜的原纖維結(jié)構(gòu)[3]，降低棉稈中纖維素是解決棉秸稈飼料化的重中之重?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，秸稈預(yù)處理方法主要包括生物法、物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法[4]。廣泛地開(kāi)展了降解纖維素微生物菌株的研究[5-6]，并且利用纖維素酶制劑提高青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7-9]。趙政等[10]利用乳酸菌制劑和纖維素酶制劑的添加可以使青貯稻草飼料品質(zhì)得到明顯改善；在玉米秸稈青貯過(guò)程中添加乳酸菌和纖維素酶，可有效降低青貯飼料腐敗率、改善和提高青貯飼料的品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[11]；乳酸菌和纖維素酶的共同作用可以使玉米秸稈青貯飼料中NDF，ADF分別降低10%和7%[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，運(yùn)用微生物發(fā)酵處理棉稈，主要應(yīng)用于生物肥料，并且利用菌酶混合發(fā)酵棉稈飼料的研究還未報(bào)道。研究菌酶共降解棉秸桿工藝，確立菌酶混合發(fā)酵棉秸稈提高品質(zhì)的最佳條件?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究纖維素酶和乳酸菌、芽孢桿菌對(duì)棉秸稈飼料品質(zhì)的影響，為菌酶混合制劑在棉稈飼料中的研究和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 棉稈

新疆中收農(nóng)牧機(jī)械公司提供，棉稈處理成1～2 cm片段。

1.1.2 菌種

LP+為植物乳酸菌(lactobacillusplantarum)，TH14為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，295為布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)，WS-6為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，BS-2為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

1.1.3 酸性纖維素酶

購(gòu)于山東蘇柯漢生物工程股份有限公司，酶活≥10 000 U/g；購(gòu)于山東蘇柯漢生物工程股份有限公司，酶活≥15 000 U/g；日本國(guó)立畜產(chǎn)草地研究所提供，酶活≥20 000 U/g；酶活定義：1個(gè)酶活力單位是指在特定條件(25℃，其它為最適條件)下，在1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 μmol微摩爾底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化底物中1 μmol的有關(guān)基團(tuán)的酶量。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白棟 10 g、酵母粉 5 g、氯化鈉10 g、水 1 000 mL、pH 7.0。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g 、牛肉浸取物 10.0 g、酵母提取液 5.0 g、 葡萄糖 5.0 g、乙酸鈉 5.0 g、檸檬酸二銨 2.0 g、吐溫 80 1.0 g、磷酸氫二鉀 2.0 g、 七水硫酸鎂 0.2 g、七水硫酸錳 0.05 g、碳酸鈣 20.0 g、瓊脂 20.0 g、蒸餾水 1.0 L，pH6.8。

復(fù)篩培養(yǎng)基：硝酸鈉 0.5 g、濾紙(需預(yù)處理)5.0 g、氯化鉀 0.5 g、氯化鈣0.5 mg、磷酸氫二鉀 1.0 g、硫酸銅 5.0 mg、七水硫酸亞鐵 5.0 mg、七水硫酸鎂 0.5 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 6.0，在121℃、101 kpa下滅菌20 min。

濾紙的預(yù)處理方法：將新華1號(hào)濾紙用1%的醋酸溶液里浸泡24 h除去淀粉；用碘液檢驗(yàn)淀粉后，再用2%的碳酸氫鈉溶液洗至中性，然后曬干備用。

1.2 方 法

1.2.1 液體種子的制備

芽孢桿菌經(jīng)斜面活化后刮取一環(huán)接入 200 mL 液體 LB 培養(yǎng)基，在 30℃，120 r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng) 12 h，制成種子液；乳酸菌經(jīng)斜面活化后刮取一環(huán)接入 200 mL 液體 MRS培養(yǎng)基，在 30 ℃，120 r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng)18 h，制成種子液。

1.2.2 混菌組的確定

以1%的接種量接種于纖維素分解菌復(fù)篩液體培養(yǎng)基，35℃、120 r/min下?lián)u床培養(yǎng)16 d后測(cè)定羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活。Lp+、TH14、295、WS-6和BS-2五種菌的混合配比實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。表1

表1 混菌混合配比
Table 1 The design of mix strain rate

混菌組MixedBacteriaGroupLp+TH14295WS-6BS-2①111--②11-1-③11--1④1111-⑤111-1⑥11-11

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)實(shí)際發(fā)酵確定關(guān)鍵因素，不同酶活、不同含水量、不同混菌組進(jìn)行正交試驗(yàn)，1%的菌液添加量，60 d固體瓶裝發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究酶制劑、含水量及混菌對(duì)棉稈中纖維素降解率的影響。選用3因素3水平L9(33) 正交表試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化，采用正交軟件助手對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。其中，混菌組根據(jù)確定好的配比分別為組、組、組；酶制劑酶活分別為10 000、15 000和20 000 U/g；含水量分別為40%、50%、60%。每個(gè)處理3次重復(fù)。對(duì)照組為未處理棉稈。表2

表2 正交試驗(yàn)因素水平
Table 2 The orthogonal experiment factor levels

水平LevelA混菌組MixedBacteriaGroupB酶活(U/g)EnzymeActivityC含水量(%)Moisture1?10000402?15000503?2000060

1.2.4 測(cè)定項(xiàng)目

1.2.4.1 棉稈發(fā)酵飼料化學(xué)成分含量測(cè)定含量測(cè)定

發(fā)酵棉桿中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素含量采用范式(Van Soest)纖維測(cè)定法[13]。

1.2.4.2 pH的測(cè)定

取 5.0 g鮮樣品，加入45.0 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌1 min后使用酸度計(jì)立刻測(cè)定pH值。

1.2.4.3 干物質(zhì)的測(cè)定

稱(chēng)取50.0 g樣品，放置于105℃的烘箱中3 h左右烘干至恒重，冷卻后稱(chēng)重。

1.2.4.4 棉稈固體發(fā)酵評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)按照德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)[14](DLG)感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)氣味、結(jié)構(gòu)、顏色、總分等級(jí)進(jìn)行評(píng)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌組確定的

研究表明，六組混菌：①Lp+∶TH14∶295=1∶1∶1、②Lp+∶TH14∶WS-6=1∶1∶1、③Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1、④Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1、⑤Lp+∶TH14∶295∶WS-6=1∶1∶1∶1、⑥ Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1，1%的接種量、35℃、120 r/min下?lián)u床培養(yǎng)16 d后測(cè)定羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活。其中③Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1濾紙酶活19.654 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活20.785 U/L，酶活在各組中最高；另外，⑤Lp+∶TH14∶295∶WS-6=1∶1∶1∶1濾紙酶活16.443 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活18.524 U/L；⑥ Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1濾紙酶活18.741 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活19.953 U/L。表3

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)不同混菌組的羧甲基纖維素酶活、濾紙酶活的研究表明，確定三組混菌組：組①：Lp+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1、組②：Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1、組③：Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1；酶制劑酶活分別為10 000、15 000、20 000 U/g；含水量分別為40%、50%、60%。設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，極差列中混菌組因素的極差值最大，不同的混菌組對(duì)纖維素降解率的影響最大，其次是酶活、含水量。發(fā)酵最優(yōu)條件為A1B2C2，即混菌組為L(zhǎng)p+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1，酶活為15 000 U/g，加水量為50%。對(duì)照未處理的棉稈NDF含量為63.43%，ADF含量為58.12%，纖維素含量為41.92%。經(jīng)過(guò)固體發(fā)酵，NDF含量降低3.44%～4.61%，ADF含量降低4.14%～8.01%，纖維素含量降低4.72%～10.74%。最優(yōu)發(fā)酵條件下，纖維素降解率達(dá)25.62%。表4

表3 混菌混合配比結(jié)果
Table 3 The results of Mixed fungus mix ratio test

實(shí)驗(yàn)組ExperimentalGroup濾紙酶活(U/L)FilterPaperEnzymeActivity羧甲基纖維素鈉酶活(U/L)SodiumCarboxymethylCelluloseEnzymeActivity①1141314524②1611816706③1965420785④1583217155⑤1644318524⑥1874119953

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)
Table 4 The results from the orthogonal test for optimized composition of the ferment medium

實(shí)驗(yàn)組ExperimEntalGroupA混菌組MixedBacteriaGroupB酶活(U/g)EnzymeActivityC含水量(%)MoistureNDF(%)ADF(%)Cellulose(%)纖維素降解率(%)CelluloseDegradationRate1?200004059095011315924642?150005059075024311825623?100006059005111318224094?200004059225134333020565?150005058825074330221236?100006059065121353515677?200004058965293354015568?150005058885259342318349?10000605990539837201126K1247820251955----K2191521731915----K3150517012029----R973472115----

2.3 棉稈發(fā)酵飼料的感官評(píng)定、pH及干物質(zhì)的測(cè)定

研究表明，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵處理的棉稈在氣味上評(píng)分11～13、結(jié)構(gòu)上評(píng)分均為4、顏色上評(píng)分1～2、總分16～20，等級(jí)均為優(yōu)等。對(duì)照CK，氣味上評(píng)分8、結(jié)構(gòu)上評(píng)分均為4、顏色上評(píng)分1、總分13，等級(jí)尚好。表5

表5 棉稈發(fā)酵飼料感官評(píng)分
Table 5 The standards of Cotton fermented feed sensory score

樣品TheSample氣味Smell結(jié)構(gòu)Structure顏色Color總分TotalScore等級(jí)Grade1134217優(yōu)等2144220優(yōu)等3134219優(yōu)等4114217優(yōu)等5114217優(yōu)等6114116優(yōu)等7114116優(yōu)等8114116優(yōu)等9114116優(yōu)等CK84113尚好

棉稈微貯處理后的pH值表明。對(duì)照CK未處理棉桿pH值最高，為4.97；經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵的棉桿處理均比對(duì)照低，pH在4.21～4.56；其中，實(shí)驗(yàn)組2的pH值最低，為4.21。圖1

圖1 棉桿發(fā)酵飼料pH值
Fig.1 pH value of fermented cotton feed

研究表明，經(jīng)微貯后的棉稈發(fā)酵飼料干物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果顯示。對(duì)照CK未處理棉桿干物質(zhì)含量最低，為12.2%；經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵的棉桿處理均比對(duì)照高，干物質(zhì)含量在26.4%～54.2%；其中，實(shí)驗(yàn)組2的干物質(zhì)含量最高，為54.2%。圖2

圖2 棉桿發(fā)酵飼料干物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果
Fig.2 Dry matter content determination results of fermented cotton feed

3 討 論

3.1 作物青貯時(shí)接種同型乳酸菌(主要為糞鏈球菌、啤酒片球菌、植物乳桿菌、干酷乳桿菌)，可以迅速增加農(nóng)作物表面的乳酸菌數(shù)目，使乳酸發(fā)酵占主導(dǎo)地位，從而達(dá)到降低pH值，抑制有害微生物的活動(dòng)，保存和提高飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的目的[12]。微生物固體發(fā)酵過(guò)程中加入芽孢桿菌等，其本身就是益生菌，有利于改善動(dòng)物胃腸道的微生態(tài)環(huán)境，減少抗生素的應(yīng)用和疾病的發(fā)生[15-16]。加入酶制劑能夠降低粗飼料中的纖維素、半纖維素、淀粉等，解決秸稈類(lèi)飼料中粗纖維含量過(guò)高的問(wèn)題，從而促進(jìn)乳酸發(fā)酵，提高飼料利用率。實(shí)驗(yàn)采用芽孢桿菌、植物乳酸菌及酸性纖維素酶的菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵棉稈，可有效降低棉稈飼料腐敗率、改善和提高青貯飼料的品質(zhì)。

3.2 對(duì)于青貯飼料，對(duì)其發(fā)酵品質(zhì)的評(píng)估很重要,這包括測(cè)定青貯飼料的pH值、各種揮發(fā)性脂肪酸、乳酸的含量、青貯的損失、氨態(tài)氮/總氮、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、木質(zhì)素、可溶性碳水化合物(WSC)的含量[17]。原料適宜的水分是保證青貯過(guò)程中乳酸菌正常活動(dòng)的重要條件之一，水分過(guò)多，容易腐爛，滲出液多，養(yǎng)分損失大；水分過(guò)低，會(huì)直接抑制微生物發(fā)酵，且由于空氣難以排凈，易引起霉變[18]。pH是評(píng)價(jià)微貯和青貯飼料品質(zhì)最簡(jiǎn)單且最重要的指標(biāo)，

pH值越低，酸度越大，則說(shuō)明飼料得到了很好的保存[19]，品質(zhì)優(yōu)良的青貯飼料pH為3.8～4.5[12]。實(shí)驗(yàn)考察不同混菌組、酶制劑、含水量對(duì)NDF含量、ADF含量、纖維素含量、纖維素降解率的影響，并且通過(guò)感官評(píng)價(jià)、pH值及干物質(zhì)含量確定發(fā)酵棉稈品質(zhì)。

4 結(jié) 論

4.1 設(shè)計(jì)六組混菌，確定最優(yōu)化酶活產(chǎn)量。其中，③ Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1濾紙酶活19.654 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活20.785 U/L，酶活在各組中最高；另外，⑤Lp+∶TH14∶295∶WS-6=1∶1∶1∶1濾紙酶活16.443 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活18.524 U/L；⑥ Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1濾紙酶活18.741 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活19.953 U/L。根據(jù)測(cè)定羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活結(jié)果，挑選③、⑤、⑥三組產(chǎn)酶活較高的混菌組進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

4.2 根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，設(shè)計(jì)不同酶活、不同含水量、不同混菌組三因素三水平正交試驗(yàn)，以NDF含量、ADF含量、纖維素含量、纖維素降解率為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵條件。發(fā)酵最優(yōu)條件為A1B2C2，即混菌組為L(zhǎng)p+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1，酶活為15 000 U/g，加水量為50%。最優(yōu)發(fā)酵條件下，NDF含量降低4.61%，ADF含量降低8.01%，纖維素含量降低10.74%。纖維素降解率達(dá)25.62%。

4.3 對(duì)發(fā)酵棉稈進(jìn)行感官評(píng)定，并且測(cè)定pH值及干物質(zhì)含量。經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵處理的棉稈在氣味上評(píng)分11～13、結(jié)構(gòu)上評(píng)分均為4、顏色上評(píng)分1～2、總分16～20，等級(jí)均為優(yōu)等；pH值在4.21～4.56；其中，實(shí)驗(yàn)組2的pH值最低，為4.21；干物質(zhì)含量在26.4%～54.2%；其中，實(shí)驗(yàn)組2的干物質(zhì)含量最高，為54.2%。

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Fund project:Xinjiang Uygur Autonomous Region Fund for Young Scholars "Screening and Breeding of Highly-Effected Degrading Lignocellulose Strains and Degradation Effect Research" (2015211B019)；the Basic Science and Technology Research Support Funds of Non-profit Research Institutions of Xinjiang Uygur Autonomous Region "Microbial Treatment Technology of Cotton Stalks" (KY2014028)

Technology for Co-degradation of Cotton Stalk by Microorganism and Enzyme

HOU Min, BAO Hui-fang, WANG Ning, ZHANG Fa-qiang, YANG Rong,LONG Xuan-qi, CUI Wei-dong

(Research Institute of Applied Microbiology / Xinjiang Academy of Agricultural Sciences / Xinjiang LaboratoryofSpecialEnvironmentalMicrobiology,Urumqi830091,China)

【Objective】 The co-degradation technology of cotton stalk by microorganism and enzyme will be studied.【Method】ccording to the carboxymethyl cellulose enzyme activity and filter paper enzyme activity, the best mixed bacterium group was determined and by orthogonal experiment, the different mixed bacteria group, enzyme preparation, contents of moisture content of NDF, ADF, cellulose, cellulose degradation rate and the effect were observed and through the sensory evaluation, pH value and dry matter content, the fermentation quality of cotton was determined.【Result】The results showed that the fermentation conditions was as follows (g/L): mixed bacterium group for Lp+:TH14: 295: BS-2=1:1:1:1, the enzyme activity of 15 000 U/g, water content of 50%. Under the optimal fermentation conditions, the NDF content was reduced by 4.61%, ADF content was reduced by 8.01%, cellulose content was reduced by 10.74%, cellulose degradation rate was 25.62%, and the pH value was 4.21, dry matter content was 54.2%, the cotton quality was superior.【Conclusion】This experiment determined the best conditions to increase the quality of cotton, and the results can be used as technical parameters and theoretic basis for decreasing the degradation rate with mixture microorganism and enzyme strain on cotton stalks.

cotton; mixed bacteria; enzyme; solid-state fermentation; the quality of cotton

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.08.014

2016-04-25

新疆維吾爾自治區(qū)青年基金項(xiàng)目“木質(zhì)纖維素降解菌株選育及混菌發(fā)酵在棉稈飼料中降解效果研究”(2015211B019)；自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目“棉秸稈飼料化微生物處理技術(shù)研究”(KY2014028)

侯敏(1983-)，女，新疆人，助理研究員，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)微生物及發(fā)酵工程，(E-mail)hmde_092@ 163.com

崔衛(wèi)東(1969-)，男，新疆人，研究員，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程，(E-mail)cuwedo@163.com

S182

A

1001-4330(2016)08-1467-07