低氧預(yù)適應(yīng)減輕缺氧所致大鼠海馬神經(jīng)元線粒體膜改變*

陳 堃， 張志發(fā)， 廖明鋒， 李 璐， 羅愛林， 田玉科， 王學(xué)仁

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科，武漢 430030

?

低氧預(yù)適應(yīng)減輕缺氧所致大鼠海馬神經(jīng)元線粒體膜改變*

陳 堃， 張志發(fā)， 廖明鋒， 李 璐， 羅愛林， 田玉科， 王學(xué)仁△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科，武漢 430030

目的 通過觀察低氧預(yù)適應(yīng)處理對缺氧引起的神經(jīng)元bcl-2表達(dá)、線粒體膜電位變化的影響，探討低氧預(yù)適應(yīng)處理對神經(jīng)元缺氧性損傷保護(hù)作用的機(jī)制。方法 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，分組處理后，采用免疫組織化學(xué)法對細(xì)胞bcl-2表達(dá)進(jìn)行檢測；采用羅丹明123染色測定線粒體膜電位，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察缺氧條件下各組細(xì)胞的線粒體膜電位變化。結(jié)果 低氧預(yù)處理組海馬神經(jīng)細(xì)胞在急性缺氧1 h復(fù)氧后，bcl-2表達(dá)陽性率為(74.5±9.8)%，較缺氧對照組(69.5±10.3)%明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；線粒體膜電位測定發(fā)現(xiàn)，與缺氧對照組比較，低氧預(yù)處理組從缺氧第80 s開始，各時間點(diǎn)線粒體膜電位均高于缺氧對照組(均P<0.05)。結(jié)論 低氧預(yù)適應(yīng)處理對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元缺氧性損傷保護(hù)作用可能是通過增加缺氧后bcl-2表達(dá)，從而穩(wěn)定線粒體膜，減慢神經(jīng)元急性缺氧時線粒體膜電位降低的速度來實(shí)現(xiàn)的。

低氧預(yù)處理； 大鼠海馬神經(jīng)元； bcl-2； 線粒體膜電位

神經(jīng)元對缺氧非常敏感，在研究神經(jīng)元缺血缺氧損傷時發(fā)現(xiàn)預(yù)適應(yīng)對神經(jīng)元有保護(hù)作用[1]，即短時間的腦缺血可以對其后的非致死性腦缺血損傷起保護(hù)作用[2]，神經(jīng)元預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用產(chǎn)生的分子機(jī)制目前尚不明確，既往的研究多數(shù)通過預(yù)適應(yīng)引起的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號傳遞通路的改變來探討[3-4]。

缺血缺氧時細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高可導(dǎo)致線粒體功能障礙、線粒體去極化和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transitional pore，MPTP)開放，引起細(xì)胞死亡。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)能的重要細(xì)胞器，并在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度中處于中心地位，由此推測，線粒體可能在預(yù)適應(yīng)引起的神經(jīng)保護(hù)作用中扮演非常重要的角色[5]。bcl-2基因所編碼的膜內(nèi)蛋白普遍存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜[6]，腦缺血可以誘導(dǎo)bcl-2表達(dá)，其過表達(dá)可以增強(qiáng)神經(jīng)元抗缺氧能力[7]。因此本實(shí)驗(yàn)通過觀察低氧預(yù)適應(yīng)處理對缺氧引起的神經(jīng)元bcl-2表達(dá)、線粒體膜電位變化的影響，探討低氧預(yù)適應(yīng)處理對神經(jīng)元缺氧性損傷保護(hù)作用的線粒體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清、馬血清購于Gibco公司，DMEM/F12購于HyClone公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液和青、鏈霉素混合液、谷氨酰胺購于Solarbio公司，bcl-2免疫組化試劑盒購于武漢博士德公司，羅丹明123染料購于Sigma公司，ATP生物發(fā)光試劑盒購于Boehringer Mannheim公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng) 詳細(xì)見參考文獻(xiàn)[8]，簡述如下：取當(dāng)天新生Wistar大鼠(同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供)，消毒后分離出雙側(cè)海馬并剪碎，0.125%胰蛋白酶37℃消化30 min、過濾、離心、接種于24孔培養(yǎng)板，置于37℃ 10%CO2培養(yǎng)箱，3～5 d后，加入細(xì)胞分裂抑制劑阿糖胞苷3 μg/mL，抑制非神經(jīng)細(xì)胞增殖。培養(yǎng)7～11 d備用。種植培養(yǎng)液：DMEM/F12 80%、胎牛血清10%、馬血清10%、青鏈霉素1%、谷氨酰胺100 μg/mL；飼養(yǎng)培養(yǎng)液：DMEM/F12 90%、馬血清10%、青鏈霉素1%、谷氨酰胺100 μg/mL。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 分為正常對照組、缺氧對照組和低氧預(yù)處理組。正常對照組神經(jīng)元置于37℃常氧(69%N2+21%O2+10%CO2)恒溫容器中培養(yǎng)；缺氧對照組神經(jīng)元則置于密閉的37℃無氧(90%N2+10%CO2)恒溫容器中培養(yǎng)；低氧預(yù)處理組自細(xì)胞培養(yǎng)后第5天起，每天將培養(yǎng)的神經(jīng)元置于密閉的37℃低氧(89%N2+1%O2+10%CO2)恒溫容器中30 min，總共處理5 d。

1.2.3 bcl-2免疫組織化學(xué)染色 培養(yǎng)5 d的缺氧對照組和低氧預(yù)適應(yīng)處理組置于密閉的37℃無氧恒溫容器中作缺氧處理1 h后，置于正常培養(yǎng)條件下24 h后行多聚甲醛固定，按以下程序行免疫組織化學(xué)染色：①0.03%H2O2甲醇室溫下孵育30 min，正常單血清(1：10)37℃作用1 h；②加入兔抗bcl-2血清(1：100)中4℃孵育72 h；③生物素化羊抗兔IgG(1：100)37℃作用1 h；④鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(1：100)37℃作用1 h，用葡萄糖氧化酶-硫酸鎳胺法顯色10 min。免疫組織化學(xué)圖像分析：隨機(jī)抽取50個相鄰視野，在顯微鏡下分別計(jì)數(shù)視野中bcl-2免疫反應(yīng)陽性和陰性神經(jīng)元數(shù)目，計(jì)算陽性神經(jīng)元所占百分率。應(yīng)用TTTY-400TC真彩色細(xì)胞圖像分析儀對各組陽性神經(jīng)元進(jìn)行平均吸光度分析。1.2.4 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ATP含量測定 對照組和低氧預(yù)處理組置于密閉的37℃無氧(90%N2+10%CO2)恒溫容器中缺氧處理1 h后，PBS沖洗3遍，用細(xì)胞匙刮下細(xì)胞，配成2 mL的細(xì)胞懸液，搖勻后1 mL用于測定蛋白質(zhì)含量，1 mL用ATP生物發(fā)光試劑盒于LKB1251型生物發(fā)光儀測ATP含量。

1.2.5 線粒體膜電位測定 取溶于DMSO的羅丹明123染料加入培養(yǎng)7～11 d的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中，終濃度為5 mg/L，避光于37℃孵育45 min，用37℃人工腦脊液沖洗培養(yǎng)皿2遍，置于Bio-Rad MRC600型激光共聚焦顯微鏡下，激光激發(fā)峰488 nm，發(fā)射峰525 nm，每40秒采集1次。以缺氧前最后一次采集的熒光強(qiáng)度為100%，缺氧后各時間點(diǎn)的值與之比較得出各自的數(shù)值(百分比表示)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氧預(yù)適應(yīng)處理對急性缺氧后再復(fù)氧誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元bcl-2表達(dá)的影響

經(jīng)低氧預(yù)適應(yīng)處理后的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元在1 h急性缺氧再復(fù)氧24 h后，bcl-2表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)明顯多于缺氧對照組，表達(dá)量較缺氧對照組明顯增強(qiáng)，圖像分析顯示，低氧預(yù)處理組平均吸光度值明顯高于缺氧對照組(P<0.05)(圖1，表1)。

A：培養(yǎng)7 d的正常對照細(xì)胞；B：缺氧對照組細(xì)胞；C：低氧預(yù)處理組細(xì)胞；圖中白色箭頭所示為染色陽性細(xì)胞圖1 海馬神經(jīng)元bcl-2蛋白表達(dá)(×400)Fig.1 Expression of bcl-2 in rat hippocampal neurons(×400)

組別nbcl?2陽性細(xì)胞(%)平均吸光度值正常對照組714．30±2．50 0．12±0．03缺氧對照組669．50±10．30?0．66±0．21?低氧預(yù)處理組674．50±9．80?#1．01±0．16?#

與正常對照組比較，*P<0.05；與缺氧對照組比較，#P<0.05

2.2 低氧預(yù)適應(yīng)處理提高缺氧時海馬神經(jīng)元胞內(nèi)ATP水平

低氧預(yù)適應(yīng)處理后的海馬神經(jīng)元在1 h急性缺氧后，其細(xì)胞內(nèi)ATP含量為[(1.23±0.45) μmol/g蛋白質(zhì)]，與缺氧對照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ATP含量[(0.65±0.23) μmol/g蛋白質(zhì)]相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 低氧預(yù)適應(yīng)處理對缺氧時海馬神經(jīng)元線粒體膜電位變化的影響

羅丹明123的熒光信號主要集中于線粒體，其熒光強(qiáng)度的變化反映了線粒體膜電位(ΔΨm)的變化。如圖2所示，自缺氧第80 s開始，缺氧對照組(n=6)神經(jīng)元線粒體膜電位明顯低于正常對照組(n=7，P<0.05)，隨時間推移，線粒體膜電位逐漸降低，各時間點(diǎn)測量熒光強(qiáng)度之間具有顯著性差異。而經(jīng)過低氧預(yù)處理培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(n=7)，從缺氧第80 s開始，線粒體的熒光強(qiáng)度即明顯高于缺氧對照組(均P<0.05)，提示低氧預(yù)處理可以減慢缺氧時海馬神經(jīng)元膜電位的降低速度。

與正常對照組比較，*P<0.05；與缺氧對照組比較，#P<0.05圖2 低氧預(yù)適應(yīng)處理改變?nèi)毖鯐r海馬神經(jīng)元線粒體膜電位Fig.2 Effect of hypoxic preconditioning on the mitochondrial membrane potential(ΔΨm)in hippocampal neurons exposed to acute anoxia

3 討論

缺血缺氧導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高、線粒體去極化進(jìn)而MPTP開放，細(xì)胞死亡，說明線粒體功能障礙在神經(jīng)元缺氧損傷發(fā)生過程中起著重要作用[8-10]。有研究提示線粒體在預(yù)適應(yīng)引起的神經(jīng)保護(hù)作用中起非常關(guān)鍵的作用[5]，因此應(yīng)該了解線粒體在應(yīng)對外界缺血缺氧刺激時功能是否正常。檢測線粒體膜電位(ΔΨm)是研究線粒體功能的主要手段，ΔΨm代表的氫離子跨膜電化學(xué)梯度占總呼吸能量的90%[11]?？梢酝ㄟ^熒光染料或者電化學(xué)探針來測量ΔΨm，我們是通過親脂性陽離子熒光染料羅丹明123的熒光強(qiáng)度的變化來檢測ΔΨm。神經(jīng)元缺血缺氧損傷可以導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡[7]，bcl-2是線粒體的調(diào)節(jié)因子，可以抑制缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡。ΔΨm主要由線粒體膜的通透性決定，bcl-2是位于線粒體膜蛋白，在調(diào)控線粒體膜通透性中起著非常重要的作用，可以防止線粒體膜電位的耗散，抑制缺氧引起的凋亡發(fā)生[9-10，12]。

本研究發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)處理可以增加神經(jīng)元在缺氧條件下bcl-2表達(dá)，可以減慢缺氧時線粒體膜電位降低的速度。因此低氧預(yù)適應(yīng)對神經(jīng)元的保護(hù)可能是通過增加bcl-2表達(dá)，從而穩(wěn)定線粒體膜通透性進(jìn)而穩(wěn)定線粒體膜電位來實(shí)現(xiàn)的。

[1] Lu G W，Yu S，Li R H，et al.Hypoxic preconditioning a novel intrinsic cytoprotective strategy[J].Mol Neurobiol，2005，31(1-3)：255-271.

[2] Kirino T.Ischemic tolerance[J].J Cereb Blood Flow Metab，2002，22(11)：1283-1296.

[3] Stenzel-Poore M P，Stevens S L，King J S，et al.Preconditioning reprograms the response to ischemic injury and primes the emergence of unique endogenous neuroprotective phenotypes：a speculative synthesis[J].Stroke，2007，38(Suppl 2)：680-685.

[4] Gidday J M.Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance[J].Nat Rev Neurosci，2006，7(6)：437-448.

[5] Sisalli M J，Annunziato L，Scorziello A.Novel cellular mechanisms for neuroprotection in ischemic preconditioning：A view from inside organelles[J].Front Neurol，2015，6：155.

[6] Gimenez-Cassina A，Danial N N.Regulation of mitochondrial nutrient and energy metabolism by Bcl-2 family proteins[J].Trends Endocrinol Metab，2015，26(4)：165-175.

[7] Ivana P，Katarina K，Maria C，et al.Possible contribution of proteins of Bcl-2 family in neuronal death following transient global brain ischemia[J].Cell Mol Neurobiol，2015，35(1)：23-31.

[8] 王學(xué)仁，劉衛(wèi)，袁世熒，等.氯胺酮對培養(yǎng)大鼠頸上交感神經(jīng)元煙堿樣乙酰膽堿受體門控電流的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2011，31(7)：809-811.

[9] Jonas E.Molecular participants in mitochondrial cell death channel formation during neuronal ischemia[J].Exp Neurol，2009，218(2)：203-212.

[10] Gross A.BCL-2 family protein as regulators of mitochondia metabolism[J].Biochim Biophys Acta，2016，1857(8)：1243-1246.

[11] Palmeira C M，Rolo A P.Mitochondrial membrane potential(ΔΨ)fluctuations associated with the metabolic states of mitochondria[J].Methods Mol Biol，2012，810：89-101.

[12] Soane L，F(xiàn)iskum G.Inhibition of mitochondrial neural cell death pathways by protein transduction of Bcl-2 family proteins[J].J Bioenerg Biomembr，2005，37(3)：179-190.

(2016-06-22 收稿)

Effect of Hypoxic Preconditioning on Anoxia-induced Changes in Mitochondrial Membrane Potential in Rat Hippocampal Neurons

Chen Kun，Zhang Zhifa，Liao Mingfeng et al

Department of Anesthesiology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of ScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To investigate the effect of hypoxic preconditioning(HP)on anoxia-induced expression of bcl-2 and mitochondrial membrane potential(ΔΨm)in rat hippocampal neurons in an attempt to understand the mechanism by which HP protects against anoxia-induced neuronal injury.Methods Primary rat hippocampal neurons were cultured，subjected to HP and then to acute hypoxia.The expression of bcl-2 was measured by immunohistochemistry，and the mitochondrial membrane potential by rhodamine-123 staining and laser confocal scanning microscopy.Results ①After 1-hour acute anoxia and then reoxygenation，the positive expression rate of Bcl-2 was(74.5±9.8)% in hippocampal neurons，significantly higher than that in anoxia control group(69.5±10.3)%(P<0.05).②The mitochondrial membrane potential was significantly increased in HP group as compared with anoxia control group at detected time points after 80-second anoxia(P<0.05).Conclusion HP protects hippocampal neurons against anoxia-induced injury by increasing the expression of bcl-2，stabilizing the mitochondrial membrane potential and slowing down the decrease of the mitochondrial membrane potential in acute anoxia.

hypoxic-preconditioning； rat hippocampal neuron； bcl-2； mitochondrial membrane potential

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81371251)；國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目

R363.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.05.005

陳 堃，男，1981年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，E-mail：xiangfanck@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：xrwang@hust.edu.cn