肝纖維化組織中抗衰老蛋白及抗增殖蛋白的表達(dá)及其作用機(jī)制

馬 波 陳忠誠

(白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 白城 137000)

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肝纖維化組織中抗衰老蛋白及抗增殖蛋白的表達(dá)及其作用機(jī)制

馬 波 陳忠誠1

(白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 白城 137000)

目的 探討肝纖維化大鼠肝組織中抗衰老標(biāo)志蛋白(RGN)及抗增殖蛋白(PHB)的表達(dá)及其作用機(jī)制。方法 48只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常對照組(12只)、造模組(36只)。使用豬血清誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，造模成功后隨機(jī)分為肝纖維化組(16只)、CGII干預(yù)組(16只)。CGII干預(yù)組給予60 mg/ml CGII肌肉注射，肝纖維化組和正常對照組給予等量的等滲鹽水肌肉注射，1次/d，連續(xù)6 w。取大鼠肝組織行HE和Masson染色；RT-PCR檢測肝組織中RGN和PHB mRNA表達(dá)，免疫組化檢測蛋白表達(dá)。結(jié)果 HE和Masson染色顯示，肝纖維化組大鼠纖維化程度明顯高于正常對照組；CGII干預(yù)組大鼠肝組織膠原變細(xì)、減少，纖維化程度較肝纖維化組明顯改善。纖維化組大鼠肝組織中RGN和PHB蛋白表達(dá)量明顯少于正常對照組(P<0.01)；CGII干預(yù)組RGN和PHB蛋白表達(dá)量明顯高于纖維化組(P<0.01)。肝纖維化組RGN和PHB mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對照組(P<0.05)；CGII干預(yù)組RGN和PHB mRNA表達(dá)水平明顯高于肝纖維化組(P<0.01)。結(jié)論 RGN和PHB在大鼠肝纖維化組織中表達(dá)降低，與肝纖維化存在相關(guān)性。

肝硬化；抗衰老蛋白；抗增殖蛋白

活化的肝星狀細(xì)胞(HSC)產(chǎn)生胞外基質(zhì)異常沉積是肝纖維化的病理基礎(chǔ)。肝損傷后抗衰老標(biāo)志蛋白(RGN)及其基因表達(dá)下調(diào)〔1〕；抗增殖蛋白(PHB)可能通過抗細(xì)胞增殖抑制腎小管間質(zhì)纖維化〔2〕；推測二者可能與肝纖維化存在關(guān)系，但目前仍未見相關(guān)報道。本研究使用豬血清誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型，并選用抗肝纖維化藥物谷胱甘肽復(fù)方注射液(CGII)進(jìn)行干預(yù)，觀察肝組織中RGN和PHB的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康清潔級Wistar雄性大鼠48只，質(zhì)量230～270 g，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，動物合格證號：SCXK(吉)：2011-0004。豬血清購于南京森貝伽生物科技有限公司；CGII、等滲鹽水購于重慶藥友制藥有限責(zé)任公司；衰老標(biāo)記蛋白(SMP)30、sPM311一抗，Envision兩步法免疫組化試劑盒購于上海西寶生物科技有限公司。

1.2 分組與建模 48只大鼠隨機(jī)分為正常對照組(12只)、造模組(36只)。造模組腹腔注射豬血清0.5 ml/只，2次/w，連續(xù)8 w；隨機(jī)處死4只行病理學(xué)檢查，病理改變符合大鼠肝纖維化病理診斷標(biāo)準(zhǔn)3～4級改變。正常對照組腹腔注射等滲生理鹽水0.5 ml/只，2次/w，連續(xù)8 w。造模成功后將造模組剩余的32只隨機(jī)分為肝纖維化組和CGII干預(yù)組，每組16只。CGII干預(yù)組大鼠肌肉注射60 mg/ml的CGII，2.7 mg/kg，1次/d；肝纖維化組和正常對照組大鼠肌肉注射等劑量的等滲鹽水。每周稱重1次，調(diào)整給藥劑量，連續(xù)6 w。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 肝組織病理學(xué)檢查 取三組大鼠相同部位肝組織，4%多聚甲醛溶液固定1 d，常規(guī)組織脫水，石蠟包埋后3 μm連續(xù)

切片，行蘇木素-伊紅(HE)和Masson染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變并依據(jù)Ishak方法分級。

1.3.2 肝組織RGN和PHB mRNA表達(dá)量 Trizol試劑盒提取肝組織總RNA，純化后采用紫外分光光度法測定RNA量和純度。取1 000 ng總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，將此作為模板行實時定量PCR，獲得每個樣本的起始拷貝數(shù)。以β肌動蛋白為對照，每組樣本分2份，在指數(shù)期內(nèi)設(shè)定參數(shù)值，得到每個PCR反應(yīng)的Ct值。以標(biāo)本的目的片段與帶內(nèi)參片段的Ct比值為該標(biāo)本表達(dá)的相對值，將對照組表達(dá)量為100%，計算另外兩組mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.3 免疫組化檢測 采用Elivision兩步法，石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，高壓熱修復(fù)抗原，滴加一抗(1∶500)，4℃孵育過夜，滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后HE復(fù)染。光學(xué)顯微鏡下每張切片選取4個高倍鏡視野，計數(shù)100個細(xì)胞，肝組織細(xì)胞質(zhì)染成黃色或棕黃色為陽性，計算陽性細(xì)胞百分比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠肝組織HE和Masson染色 正常對照組大鼠肝組織細(xì)胞以中央靜脈為中心放射狀排列，索條狀排列的肝細(xì)胞形成肝細(xì)胞索，其間有肝血竇。肝纖維化組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞索排列紊亂，匯管區(qū)結(jié)締組織增生形成纖維間隔，包繞并分割正常肝組織，纖維化程度明顯高于正常對照組。CGII干預(yù)組大鼠肝組織膠原變細(xì)、減少，向肝小葉延伸，纖維化程度較肝纖維化組明顯改善。見圖1。

2.2 三組大鼠肝組織RGN和PHB蛋白表達(dá) 正常對照組大鼠肝組織RGN主要表達(dá)于肝實質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞核存在部分表達(dá)；PHB主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)、匯管區(qū)、細(xì)胞間質(zhì)，少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞核。纖維化組大鼠肝組織中RGN和PHB蛋白表達(dá)量明顯少于正常對照組(P<0.01)；CGII干預(yù)組RGN和PHB蛋白表達(dá)量明顯高于纖維化組(P<0.01)。見圖2，表1。

圖1 三組大鼠肝組織HE和Masson染色(×200)

圖2 三組大鼠肝組織RGN和PHB蛋白的免疫組化染色(×400)

分組nRGNPHB正常對照組1262.19±6.8556.97±5.34肝纖維化組1611.96±3.701)15.61±3.861)CGII干預(yù)組1648.69±6.362)44.83±2.552)

與正常對照組相比：1)P<0.05；與肝纖維化組相比：2)P<0.05；下表同

2.3 三組大鼠肝組織RGN和PHB mRNA表達(dá) 肝纖維化組RGN和PHB mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對照組(P<0.05)；CGII干預(yù)組RGN和PHB mRNA表達(dá)水平明顯高于肝纖維化組(P<0.01)。見表2。

表2 三組大鼠肝組織RGN和PHB mRNA相對表達(dá)量

3 討 論

RGN為一種高保守的親水性蛋白，主要分布于肝、腎細(xì)胞中，維持胞內(nèi)鈣離子平衡，在鈣離子信號傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，肝損傷、高血壓會導(dǎo)致RGN表達(dá)下調(diào)〔3〕。在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中，細(xì)胞因子和胞內(nèi)鈣離子濃度在肝組織星狀細(xì)胞激活中起到重要作用，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1、血小板衍生長因子(PDGF)是其中的兩個關(guān)鍵細(xì)胞因子〔4〕。TGFβ1可激活HSC中的電壓依賴性鈣通道，增加胞外鈣離子內(nèi)流，連續(xù)性提升胞內(nèi)鈣離子，激活HSC，其中TGFβ1和Smad4信號分子表達(dá)，可上調(diào)ERK、PDGF表達(dá)，進(jìn)一步激活HSC，其大量增殖膠原蛋白，形成肝纖維化。而RGN可與鈣離子結(jié)合，抑制PKC激活，下調(diào)PDGF和TGFβ1的表達(dá)。

PHB為一種由細(xì)胞核DNA編碼的高保守蛋白質(zhì)，主要分布于細(xì)胞核、細(xì)胞膜、線粒體中。PHB參與衰老、凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期等多種細(xì)胞活動。研究發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化的腎組織基因譜中PHB基因出現(xiàn)明顯下調(diào)，推測其可能是介導(dǎo)腎纖維化的一個重要基因〔5〕。體外研究顯示，PDB可有效抑制TGFβ1介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖活化和胞外基質(zhì)的生成，該過程可能通過非Smads信號通路完成〔6〕?？紤]到肝損傷是肝纖維化的起始因素，而肝損傷時RGN蛋白和mRNA表達(dá)減少；PHB還可通過抗細(xì)胞增殖來抑制腎小管間質(zhì)纖維化，但二者與肝纖維化的關(guān)系仍鮮有報道。

CGII是根據(jù)俄羅斯抗肝纖維化藥物仿制而成的藥物，主要有效成分為肌酐和氧化型谷胱甘肽。CGII可有效緩解豬血清誘發(fā)的肝纖維化，提升肝組織中的還原型谷胱甘肽含量，降低過氧化物酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13的表達(dá)，降低TGFβ1、PDGF、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白的表達(dá)〔7〕。本研究結(jié)果也顯示CGII可有效改善豬血清誘發(fā)的大鼠肝纖維化程度。

本次研究重點在于比較正常肝組織、纖維化肝組織、CGII干預(yù)的纖維化肝組織中RGN和PHB蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，RGN和PHB與肝纖維化存在相關(guān)性，而其與HSC、TGFβ1等多種細(xì)胞因子在肝纖維化過程中的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

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3 Kim AY，Kim YK，Lee MW，etal.Detection of hepatocellular carcinoma in gadoxetic acid-enhanced MRI and diffusion-weighted MRI with respect to the severity of liver cirrhosis〔J〕.Acta Radiol，2012；53(8)：830-8.

4 Gu JJ，He XH，Li WT，etal.Safety and efficacy of splenic artery coil embolization for hypersplenism in liver cirrhosis〔J〕.Acta Radiol，2012；53(8)：862-7.

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6 Terai S，Takami T，Yamamoto N，etal.Status and prospects of liver cirrhosis treatment by using bone marrow-derived cells and mesenchymal cells〔J〕.Tissue Eng Part Rev，2014；20(3)：206-10.

7 Oliveira-Junior MC，Monteiro AS，Leal-Junior ECP，etal.Low-level laser therapy ameliorates CCl4-induced liver cirrhosis in rats〔J〕.Photochem Photobiol，2013；89(1)：173-8.

〔2015-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省教育廳課題(2015ZCY214)

馬 波(1972-)，女，副教授，主要從事內(nèi)科學(xué)研究。

R57

A

1005-9202(2016)20-4978-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.016

1 白城市醫(yī)院