腦血疏口服液對(duì)大鼠腦出血后神經(jīng)功能及血腫周?chē)氚祹Ъ?xì)胞凋亡的影響

胡 勇，張亞紅，劉重霄 ，周 任 ，師 蔚，郭振宇

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腦血疏口服液對(duì)大鼠腦出血后神經(jīng)功能及血腫周?chē)氚祹Ъ?xì)胞凋亡的影響

胡 勇1，張亞紅2，劉重霄2，周 任2，師 蔚2，郭振宇2

目的 在建立大鼠腦出血(ICH)模型基礎(chǔ)上，早期應(yīng)用藥物進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠神經(jīng)功能缺失及腦出血血腫周?chē)氚祹е屑?xì)胞凋亡情況。方法 選用SD大鼠78只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、治療組和對(duì)照組，各組又隨機(jī)分為1 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d亞組。實(shí)驗(yàn)組注射Ⅳ型膠原酶建立ICH模型，治療組予以藥物干預(yù)，后各組分別進(jìn)行神經(jīng)功能測(cè)定及TUNEL法統(tǒng)計(jì)檢測(cè)細(xì)胞。結(jié)果 腦出血模型建立后各組動(dòng)物均出現(xiàn)不同的神經(jīng)功能缺失癥狀，腦出血組神經(jīng)功能缺失癥狀明顯重于治療組和對(duì)照組；對(duì)照組腦組織幾乎未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組于6 h可見(jiàn)腦出血灶周?chē)鶷UNEL陽(yáng)性細(xì)胞最多，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，于3 d再次出現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞高峰后下降；治療組僅在腦出血后6 h觀察到腦出血灶周?chē)鶷UNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高峰，但其高峰時(shí)數(shù)量少于腦出血組，之后漸下降。結(jié)論 腦血疏口服液可以通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能缺失及減輕腦出血后繼發(fā)腦損害。

腦出血；腦血疏口服液；細(xì)胞凋亡；神經(jīng)功能缺失；大鼠；中風(fēng)

腦出血(ICH)是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，ICH后繼發(fā)性腦損傷是導(dǎo)致ICH病人致殘率和死亡率極高的重要原因之一。既使近年來(lái)神經(jīng)影像診斷、神經(jīng)外科微創(chuàng)手術(shù)和神經(jīng)康復(fù)研究等方面均有較大進(jìn)展，但I(xiàn)CH病人的療效和預(yù)后并未有根本改觀，仍然是目前神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題[1]。研究證實(shí)，ICH后血液成分及其降解產(chǎn)物和炎性細(xì)胞大量滲入腦組織中，可通過(guò)細(xì)胞凋亡造成腦組織進(jìn)一步損傷[2]。腦血疏口服液(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20070059，國(guó)家中藥保護(hù)品種)具有益氣、活血、化瘀之功效，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其確實(shí)對(duì)ICH病人顱內(nèi)血腫吸收及減輕腦損害起到一定作用，但其確切治療機(jī)制仍未完全明了[3]。那么腦血疏口服液是否通過(guò)抑制ICH后血腫周?chē)氚祹е屑?xì)胞凋亡來(lái)改善神經(jīng)功能及減輕繼發(fā)腦損傷，目前缺乏相關(guān)研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)擬在建立大鼠ICH模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用腦血疏口服液進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠神經(jīng)功能缺失及腦出血血腫周?chē)氚祹е屑?xì)胞凋亡，為今后闡明ICH后腦損傷的致病機(jī)制及治療方案打下一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 健康清潔SD大鼠78只，體重250 g～300 g，雄性，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用隨機(jī)數(shù)字表法分組：實(shí)驗(yàn)組、治療組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和治療組再隨機(jī)分為1 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d亞組，每亞組6只大鼠，對(duì)照組共6只大鼠，各組間大鼠體重?zé)o明顯差異。

1.2 ICH動(dòng)物模型建立 用Ⅳ型膠原酶建立ICH模型，大鼠術(shù)前12 h禁飲食4 h禁水，0.4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg)，必要時(shí)水合氯醛補(bǔ)充麻醉，保證手術(shù)操作期間大鼠有自主呼吸，俯臥位固定于動(dòng)物頭顱立體定向儀上，頭皮“釘子型”剪開(kāi)，取前囟為原點(diǎn)，向右3 mm，向后1 mm，深度5 mm為注射點(diǎn)(尾狀核)，磨鉆磨開(kāi)顱骨，進(jìn)針后緩慢注射Ⅳ型膠原酶、肝素和生理鹽水混合溶液(每1 mL含Ⅳ型膠原酶0.2 U及肝素2 U)，留針10 min，緩慢退針，骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮。術(shù)中注意大鼠呼吸情況并保持呼吸道通暢，大鼠體溫控制在36.5℃～37.5℃，術(shù)畢動(dòng)物送入有空調(diào)的動(dòng)物房飼養(yǎng)。對(duì)照組按Ⅳ型膠原酶法注入相同劑量生理鹽水；治療組按上述造模方法每8 h灌服腦血疏口服液1 mL/kg，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組灌服生理鹽水。

1.3 觀察指標(biāo) 采用SPSS 20.0軟件包分析。參照Longa FZ五級(jí)評(píng)分法，對(duì)造模后大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。取腦出血?jiǎng)游锬Ｐ湍X組織標(biāo)本備用，TUNEL法染色。

2 結(jié) 果

2.1 ICH后各組神經(jīng)功能缺損癥狀 造模后6 h將實(shí)驗(yàn)組大鼠尾部提起，可見(jiàn)大鼠左側(cè)前肢略回收于腹下，而部分大鼠表現(xiàn)為追尾現(xiàn)象，Longa評(píng)分1分～2分；術(shù)后2 d～3 d神經(jīng)功能缺失最重，表現(xiàn)為不能站立或有意識(shí)障礙，Longa評(píng)分3分～4分。治療組動(dòng)物神經(jīng)功能缺失癥狀與實(shí)驗(yàn)組相比較輕，對(duì)照組無(wú)明顯神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。

表1 ICH后各時(shí)相點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較(±s) 分

2.2 出血灶周?chē)鶷UNEL陽(yáng)性細(xì)胞 正常腦組織內(nèi)極少見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，對(duì)照組腦組織幾乎未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞；6 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組出血灶周?chē)X組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞最多，明顯高于治療組(P<0.05)；1 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較6 h時(shí)有所下降，但仍高于治療組(P<0.05)；3 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較其1 d時(shí)又有所增加，而此時(shí)治療組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，并且治療組與實(shí)驗(yàn)組同時(shí)段相比TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少明顯(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組血腫周?chē)毖氚祹UNEL陽(yáng)性細(xì)胞的變化(±s)

3 討 論

有關(guān)ICH后繼發(fā)性腦損傷的研究，目前觀點(diǎn)認(rèn)為ICH后繼發(fā)性腦損傷的可能機(jī)制主要兩大類(lèi)[4-6]：一是血腫直接作用，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。其發(fā)病機(jī)制可能與下述幾方面因素有關(guān)：①血紅蛋白的作用。血紅蛋白是一種含鐵蛋白，出血后該物質(zhì)被釋放到蛛網(wǎng)膜下腔或腦組織內(nèi)，并在其代謝過(guò)程中產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、DNA片段化，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。②血液其他成分的刺激。研究證實(shí)，血液中凝血酶和纖溶酶可直接導(dǎo)致神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡。③出血后繼發(fā)的炎性反應(yīng)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ICH后存在炎性細(xì)胞增生、釋放炎性因子，并導(dǎo)致正常神經(jīng)元凋亡。二是除了血腫的直接作用外，ICH后血腫對(duì)周?chē)X組織的壓迫、腦水腫形成、局部腦組織缺血、并發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣等也可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷、凋亡。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)形態(tài)學(xué)上的概念，自1972年來(lái)病理學(xué)家Kerr等提出“凋亡”概念后，引起人們對(duì)這一生物學(xué)現(xiàn)象的廣泛興趣。細(xì)胞凋亡與壞死是有本質(zhì)區(qū)別的[7-8]。凋亡被描述成細(xì)胞的程序性崩解，細(xì)胞皺縮，胞核裂解，染色質(zhì)濃縮，凋亡小體形成。而嚴(yán)重缺血、高溫及機(jī)械性損傷等主要環(huán)境變化引起的細(xì)胞壞死現(xiàn)象是一種變性現(xiàn)象，壞死的特征是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器膨脹、胞膜及胞體破裂。細(xì)胞壞死是不可逆過(guò)程，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷是不可逆轉(zhuǎn)的，是被動(dòng)的過(guò)程。而凋亡在一定條件下可被調(diào)控的。既然ICH后神經(jīng)元凋亡是造成繼發(fā)腦損傷的關(guān)鍵因素同時(shí)又是可控因素，那么臨床中探尋一種行之有效的治療ICH的方法就成為可能。

本研究提示，實(shí)驗(yàn)組及治療組大鼠均出現(xiàn)了神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，具體表現(xiàn)為反應(yīng)淡漠、食欲差，活動(dòng)減少，肢體癱瘓，對(duì)照組大鼠正常。1 h時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分3組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明1 h時(shí)神經(jīng)功能障礙可能由麻醉引起，沒(méi)有實(shí)際意義；6 h后神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組明顯高于其余兩組，由于此時(shí)麻醉藥物已代謝，故考慮與這一階段血腫的形成、進(jìn)展、壓迫腦組織、腦水腫產(chǎn)生及局部炎癥介質(zhì)的毒性反應(yīng)等繼發(fā)性腦損傷的嚴(yán)重程度有關(guān)。使用腦血疏口服液的治療組大鼠也出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，但癥狀較未使用藥物實(shí)驗(yàn)組為輕，并且恢復(fù)快。對(duì)照組均于造模后6 h恢復(fù)進(jìn)食和活動(dòng)，其后未見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀出現(xiàn)。ICH后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡發(fā)生存在并有一定規(guī)律性，實(shí)驗(yàn)組凋亡發(fā)生的時(shí)間較早，且出現(xiàn)兩次神經(jīng)元凋亡高峰：早期約6 h時(shí)，晚期在3 d左右。而治療組出現(xiàn)一次神經(jīng)元凋亡高峰，約在6 h左右。

腦血疏口服液具有益氣、活血、化瘀的作用，其主要成分為黃芪、水蛭、 石菖蒲、牛膝及川芎，主要用于“氣虛血瘀”所致中風(fēng)病人。近期關(guān)于腦血疏口服液的研究表明[9-13]：ICH血腫周?chē)把[內(nèi)部發(fā)生炎癥反應(yīng)，并且有中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞移行至血管外，小膠質(zhì)細(xì)胞激活；ICH后1 d～7 d，有大量的多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞在血腫周?chē)?rùn)；ICH后48 h中性粒細(xì)胞黏附于血管壁或從毛細(xì)血管和小靜脈內(nèi)游出。滲出的中性粒白細(xì)胞能夠釋放各種細(xì)胞因子，以腫瘤壞死因子-α(TNF-α)為主的多種致炎因子，破壞血腦屏障(BBB)、加重腦水腫和腦損傷。TNF-α對(duì)毛細(xì)血管有直接毒性作用，導(dǎo)致微小血管痙攣，增加毛細(xì)血管通透性，開(kāi)放血腦屏障，加重外周白細(xì)胞浸潤(rùn)及腦水腫。腦血疏口服液可以減輕血腫周?chē)喾N細(xì)胞因子的參與和表達(dá)，如TNF-α、IL-1、IL-6等。

腦血疏口服液可以通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能缺失及減輕腦出血后繼發(fā)腦損害，對(duì)大鼠腦出血后神經(jīng)功能及血腫周?chē)氚祹Ъ?xì)胞凋亡調(diào)控，可能是通過(guò)抑制炎性因子產(chǎn)生，但該方式是否為唯一渠道，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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(本文編輯王雅潔)

1.陜西省黃陵縣醫(yī)院(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院協(xié)管醫(yī)院 陜西黃陵727300)；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院

郭振宇，E-mail：guozhenyu18@sina.com

R743.3 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.15.012

1672-1349(2016)15-1735-03

2016-04-16)