三七總皂苷對心肌梗死大鼠血管新生及VEGF表達(dá)的影響

阿得力·艾山

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三七總皂苷對心肌梗死大鼠血管新生及VEGF表達(dá)的影響

阿得力·艾山

目的 探討三七總皂苷對心肌梗死大鼠血管新生及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法 成年健康Wistar大鼠108只，隨機(jī)分為對照組、三七總皂苷低劑量組和高劑量組，各36只。采用左冠狀動脈結(jié)扎法建立急性心肌梗死大鼠模型。模型建立后對照組給予生理鹽水100 mg/kg腹腔注射；三七總皂苷低、高劑量組分別給予100 mg/kg和400 mg/kg三七總皂苷腹腔注射，每日一次。分別于術(shù)后3 d，7 d，14 d 和21 d處死大鼠9只，檢測各組大鼠心肌梗死周邊組織微血管密度、心肌梗死面積百分比、心肌梗死周圍組織VEGF mRNA表達(dá)水平，分析微血管密度與VEGF mRNA的相關(guān)性。結(jié)果 3組大鼠心肌梗死周邊組織微血管密度逐漸增加，低劑量組和高劑量組各時點(diǎn)心肌梗死周邊組織微血管密度顯著高于對照組(P<0.05)；而高劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)；3組大鼠各時點(diǎn)心肌梗死面積百分比差別有統(tǒng)計學(xué)意義，高低劑量組顯著低于對照組(P<0.05)；而低劑量組和高劑量組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照組大鼠心肌梗死周圍組織VEGF mRNA表達(dá)呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢；高低劑量組大鼠VEGF mRNA表達(dá)隨時間推移顯著增高；各時點(diǎn)高劑量組VEGF mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組和低劑量組(P<0.05)，低劑量組顯著高于對照組(P<0.05)；3組大鼠心肌梗死周圍組織血管密度與VEGF mRNA均呈現(xiàn)正相關(guān)(r對照組=0.86，r低劑量組=0.84，r高劑量組=0.86，P<0.05)。結(jié)論 三七總皂苷通過上調(diào)VEGF表達(dá)促進(jìn)新生血管生成，減少了心肌梗死面積。

心肌梗死；三七總皂苷； 血管內(nèi)皮生長因子；血管密度；血管新生；大鼠

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是臨床上最為常見的心血管疾病之一[1]。近年來隨著我國人口老齡化的加劇以及生活飲食習(xí)慣的逐漸改變，AMI的發(fā)病率出現(xiàn)了逐年上升的趨勢[2]。隨著醫(yī)療水平的不斷進(jìn)步，急性心肌梗死后再血管化治療取得了較大的進(jìn)展，使得病人心功能得到明顯改善，生活質(zhì)量顯著提高。但存在冠狀動脈彌漫性病變的病人大多喪失了再血管化治療的機(jī)會，預(yù)后較差。因此，如何促進(jìn)梗死后新生血管生成成為了研究熱點(diǎn)[3]。中藥提取物三七總皂苷具有活血祛瘀，通脈活絡(luò)，抑制血小板聚集和增加腦血流量的作用。近年來的研究顯示，三七總皂苷還具有促進(jìn)新生血管生成的作用，但其確切分子機(jī)制并不十分清楚[4]。本研究采用Wistar大鼠為研究對象，建立AMI模型，探討三七總皂苷對心肌梗死大鼠血管新生及VEGF表達(dá)的影響，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑儀器 成年健康Wistar大鼠(購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心)體重180 g～220 g，(3～4)月齡，飼養(yǎng)于安靜動物房，恒定溫度為20 ℃～22 ℃，濕度為50%，12 h光暗周期。三七總皂苷購自云南省藥物研究所制藥廠；組織標(biāo)本RNA提取試劑盒，購自大連寶生生物公司；VEGF引物序列，由華大基因公司合成；SP免疫組化試劑盒及抗鼠Ⅷ多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。7900HT Realtime PCR儀，購自美國ABI公司；多功能酶標(biāo)儀，購自德國Berthold公司；石蠟切片機(jī)，購自德國徠卡公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 成年健康Wistar大鼠108只隨機(jī)分為對照組、三七總皂苷低劑量組和高劑量組各36只。采用左冠狀動脈結(jié)扎法建立急性心肌梗死大鼠模型。大鼠用10%水合氯醛麻醉后，與左側(cè)3、4肋切口打開胸腔，切開心包暴露冠狀動脈，在動脈圓錐與左心耳下1 mm處分離并結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈后逐層關(guān)閉胸腔。模型建立后對照組給予生理鹽水100 mg/kg腹腔注射；三七總皂苷低、高劑量組分別給予100 mg/kg和400 mg/kg三七總皂苷腹腔注射，每日一次。分別于術(shù)后3 d，7 d，14 d 和21 d處死大鼠9只，檢測各組大鼠心肌梗死周邊組織微血管密度、心肌梗死面積百分比、心肌梗死周圍組織VEGF mRNA表達(dá)水平，分析微血管密度與VEGF mRNA的相關(guān)性。

1.2.2 微血管密度檢測 在各時間點(diǎn)斷頸法處死大鼠后，將大鼠心臟取出制成石蠟切片，以抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色，計數(shù)梗死區(qū)微血管數(shù)目。每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野，計算后取平均值。

1.2.3 VEGF mRNA檢測 根據(jù)RNA提取試劑盒說明，提取大鼠心臟組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)為cDNA 后應(yīng)用7900HT Realtime PCR儀檢測大鼠VEGF mRNA表達(dá)水平。VEGF上游引物F：5′-agaaggaggagggcagaatca-3′下游引物R：5′-caaatgctttctccgctctga-3′。反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃30 s，52℃30 s，72℃60 s，共40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2 結(jié) 果

2.1 微血管密度比較 3組大鼠心肌梗死周邊組織微血管密度逐漸增加，低劑量組和高劑量組各時點(diǎn)心肌梗死周邊組織微血管密度顯著高于對照組，且差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而高劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠心肌梗死周邊組織微血管密度比較(±s)

2.2 心肌梗死面積比較 3組大鼠各時點(diǎn)心肌梗死面積百分比差別有統(tǒng)計學(xué)意義，高劑量組、低劑量組顯著低于對照組(P<0.05)；而低劑量組和高劑量組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 3組大鼠心肌梗死面積比較(±s) %

2.3 心肌VEGF mRNA表達(dá)比較 對照組大鼠心肌梗死周圍組織VEGF mRNA表達(dá)先增高后降低的趨勢；高、低劑量組大鼠VEGF mRNA表達(dá)隨時間推移顯著增高；各時點(diǎn)高劑量組VEGF mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組和低劑量組(P<0.05)，低劑量組顯著高于對照組(P<0.05)。詳見表3。

表3 3組大鼠心肌梗死周圍組織VEGF mRNA表達(dá)比較(±s)

2.4 VEGF mRNA與血管密度關(guān)系 3組大鼠心肌梗死周圍組織血管密度與VEGF mRNA均呈現(xiàn)正相關(guān)(r對照組=0.86，r低劑量組=0.84，r高劑量組=0.86，P<0.05)。詳見圖1。

圖1 3組大鼠周圍組織血管密度與VEGF mRNA相關(guān)性

3 討 論

急性心肌梗死是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。近年來AMI已發(fā)展成為城鎮(zhèn)居民高發(fā)的心血管疾病。臨床上病人主要表現(xiàn)為劇烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯類藥物不能完全緩解，伴有血清心肌酶活性增高及進(jìn)行性心電圖改變。目前對于AMI治療的有效方法為經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)或冠狀動脈旁路移植術(shù)，此治療方法療效確切，能夠挽救瀕死的心肌細(xì)胞，提高病人生活質(zhì)量，降低AMI病人死亡風(fēng)險[5]。但對于直徑小于2 mm的病變血管無法采用上述方案進(jìn)行治療。對于小于2 mm的冠脈血管病變導(dǎo)致的局部缺血性病變可以采用促進(jìn)缺血區(qū)血管新生的方法來再建立血液循環(huán)，保留心肌功能。有研究顯示某些細(xì)胞生長因子可刺激缺血的心肌組織形成新生血管并再通，為瀕臨死亡的心肌細(xì)胞提供營養(yǎng)[6]。這類細(xì)胞因子中，血管內(nèi)皮生長因子具有較強(qiáng)的促血管生成作用，VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性促有絲分裂原，是目前為止最為特異的促進(jìn)新生血管形成的生長因子[7]。大量動物實(shí)驗證實(shí)，VEGF能夠誘導(dǎo)缺血缺氧心肌組織產(chǎn)生功能性新生血管，建立新的側(cè)支循環(huán)，改善心肌血液供應(yīng)[8]。

除了VEGF外，近年來有研究發(fā)現(xiàn)一些中藥成分同樣能夠促進(jìn)新生血管生成。三七總皂苷為中藥三七中提取的生物活性成分，包括有人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1，三七皂苷R1等[9]。臨床上具有活血祛瘀，通脈活絡(luò)，具有抑制血小板聚集和增加心腦血流量的作用。新近的動物實(shí)驗顯示，三七總皂苷可促進(jìn)缺血性心肌組織微循環(huán)建立，誘導(dǎo)新生血管生成，但其確切分子機(jī)制不明[4]。

本研究采用Wistar大鼠制作AMI模型，探討三七總皂苷對心肌梗死大鼠血管新生及VEGF表達(dá)的影響，明確其促進(jìn)新生血管的分子機(jī)制。研究結(jié)果顯示三七總皂苷可顯著提高AMI大鼠梗死心肌周圍微血管密度，降低梗死心肌面積，提高心肌VEGF mRNA表達(dá)水平，且大鼠心肌梗死周圍組織血管密度與VEGF mRNA均呈現(xiàn)正相關(guān)。

本研究證實(shí)三七總皂苷可能通過上調(diào)VEGF表達(dá)促進(jìn)新生血管生成，減少心肌梗死面積，改善大鼠心功能，挽救瀕死的心肌細(xì)胞。但三七總皂苷通過何種分子機(jī)制和信號通路上調(diào)VEGF表達(dá)仍不十分清楚。因此，下一步應(yīng)采用相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗，進(jìn)一步探討其調(diào)控VEGG表達(dá)的分子機(jī)制，為三七總皂苷的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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(本文編輯王雅潔)

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(烏魯木齊 830054)，E-mail：zhengyi50324@126.com

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.15.011

1672-1349(2016)15-1732-04

2015-09-28)