養(yǎng)心氏對巨噬細(xì)胞極化及活化的調(diào)節(jié)

侯 亮，路英進(jìn)，丁彥春

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

養(yǎng)心氏對巨噬細(xì)胞極化及活化的調(diào)節(jié)

侯 亮1，路英進(jìn)1，丁彥春2

目的 以人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞為基礎(chǔ)，觀察養(yǎng)心氏對THP-1源性巨噬細(xì)胞極化和活化的影響，為養(yǎng)心氏抗動脈粥樣硬化機制提供理論依據(jù)。方法 分別以不同濃度(10 mg/L，25 mg/L和50 mg/L)的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞24 h，以空白為對照組，用ELISA法測定上清液中的單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)的濃度，用流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞表面CD16及CD68的表達(dá)。用不同濃度的養(yǎng)心氏(10 mg/L，50 mg/L和100 mg/L)預(yù)處理THP-1源性巨噬細(xì)胞12 h，再用50 mg/L的 ox-LDL刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞24 h，檢測上清液中MIF、MCP-1的濃度以及CD16及CD68的表達(dá)情況。結(jié)果 ox-LDL能以劑量依賴的方式誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞分泌MCP-1和MIF，其中50 mg/L 組表達(dá)最高，MCP-1(29.30±1.48)pg/mL，對照組為(5.71±1.94) pg/mL；MIF(18.67±0.15) ng/mL，對照組為 (4.61±0.40) ng/mL(P<0.01)。ox-LDL能改變巨噬細(xì)胞表面抗原CD16、CD68的表達(dá)，50 mg/L組能顯著下調(diào)CD16、CD68的表達(dá)(CD16：26.9 vs對照組29.8；CD68：22.3 vs對照組25.2)。養(yǎng)心氏能夠以劑量依賴的方式抑制ox-LDL所致的THP-1源性巨噬細(xì)胞分泌MCP-1和MIF，隨著養(yǎng)心氏刺激濃度的增加，MCP-1和MIF的分泌減少。結(jié)論 養(yǎng)心氏可能通過抑制巨噬細(xì)胞炎性活化，抑制巨噬細(xì)胞向促炎表型轉(zhuǎn)化進(jìn)而抑制動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。

動脈粥樣硬化；巨噬細(xì)胞極化；養(yǎng)心氏；單核細(xì)胞趨化蛋白-1；巨噬細(xì)胞移動抑制因子

單核-巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化(AS)的形成和發(fā)展中具有重要意義。在動脈粥樣斑塊中聚集著大量的單核-巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可分泌多種炎癥因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)，促進(jìn)炎癥發(fā)生。此外活化的巨噬細(xì)胞還可以表達(dá)MCH Ⅱ類分子與T細(xì)胞結(jié)合使其活化，分泌各種炎性因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(INF-γ)等共同促進(jìn)炎癥反應(yīng)[1]。巨噬細(xì)胞是一種異質(zhì)性很強的細(xì)胞群，按照功能可分成不同的亞型。人們按照Th1和Th2細(xì)胞的劃分方法，將巨噬細(xì)胞劃分為經(jīng)典活化型M1型和替代活化型M2型，其中M1型巨噬細(xì)胞可被IFN-γ、TNF-α、內(nèi)毒素(LPS)活化，分泌IL-1、IL-12等炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)一氧化氮等活性氧合成，參與抗原呈遞及炎癥反應(yīng)，具有很強的組織侵襲力和分解力，促進(jìn)斑塊進(jìn)展和破裂。M2型巨噬細(xì)胞在AS病變進(jìn)展中卻起到與M1相反的作用，分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等抗炎因子，并表達(dá)清道夫受體、甘露糖受體，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、斑塊穩(wěn)定、抵御寄生蟲感染，具有抗炎作用。巨噬細(xì)胞亞型與AS之間的關(guān)系日漸成為研究的熱點[2]。促炎型巨噬細(xì)胞和抗炎型巨噬細(xì)胞共同參與AS的發(fā)展，如何影響巨噬細(xì)胞亞型的改變，使巨噬細(xì)胞向抗炎型極化或抑制促炎型巨噬細(xì)胞的生成，成為AS防治的一個新方向。

養(yǎng)心氏片(上海醫(yī)藥集團青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字號2370211027)是中藥復(fù)方制劑，由人參、靈芝、黃芪、淫羊藿、丹參、當(dāng)歸、葛根和山楂等中藥組成，有效成分是葛根總黃酮、丹參酮、淫羊藿總黃酮、人參皂苷、黃芪皂苷、阿魏酸和靈芝多糖等，具有抗炎、抗血小板聚集、調(diào)脂和改善循環(huán)等多種效應(yīng)，能從多靶點干擾AS進(jìn)程，發(fā)揮治療冠心病的效能，但具體的機制尚不完全清楚。利用ox-LDL刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞，并加入不同濃度養(yǎng)心氏干預(yù)，研究養(yǎng)心氏對巨噬細(xì)胞分泌炎性因子及巨噬細(xì)胞表型改變可能產(chǎn)生的影響，探討?zhàn)B心氏在抗AS作用中的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人單核細(xì)胞系THP-1購自中科院上海細(xì)胞庫，ox-LDL購自北京欣源佳和生物科技有限公司，人MIF ELISA試劑盒購自上海細(xì)胞生物公司，人MCP-1 ELISA試劑盒購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，流式細(xì)胞抗體CD16-FITC、CD68-FITC、IgG2a-FITC購自BD公司，其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及THP-1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 THP-1單核細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈單個、圓形、懸浮生長。每2 d～3 d按1∶2～1∶3傳代一次。選取3～4代以后細(xì)胞，以1×106/mL細(xì)胞密度接種于6孔板，以160 nmol/L PMA誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞貼壁，變成不規(guī)則形或梭形，伸出偽足，誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞。

1.3 養(yǎng)心氏的制備 用RPMI1640培養(yǎng)液溶解養(yǎng)心氏，配制為1.0 g/L的原液。37℃水浴30 min，充分振蕩30 min，超聲溶解1 min，1 000 r/min離心10 min，取上清液過濾滅菌，用于細(xì)胞培養(yǎng)。預(yù)實驗中應(yīng)用MTT法檢驗養(yǎng)心氏對THP-1源性巨噬細(xì)胞的毒性作用，分別以養(yǎng)心氏終濃度500 mg/L、400 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L和10 mg/L刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞24 h，并重復(fù)3次，所有濃度養(yǎng)心氏對細(xì)胞均無毒性作用。結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果及臨床實際情況，本研究中養(yǎng)心氏預(yù)處理的終濃度確定為10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L。

1.4 實驗分組及處理 依照實驗處理因素，以不同濃度ox-LDL(10 mg/L、25 mg/L和50 mg/L)分別刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞24 h，以空白為對照組。以不同濃度養(yǎng)心氏(10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L)預(yù)處理THP-1源性巨噬細(xì)胞12 h，以空白為對照組，再用ox-LDL(50 mg/L)刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞24 h。

1.5 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中細(xì)胞因子MIF、MCP-1的濃度 收集培養(yǎng)物的上清液，儲存在-80℃冰箱。按照ELISA試劑盒說明書方法，將試劑盒提供的原倍標(biāo)準(zhǔn)品在 EP 管中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比稀釋，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔。在標(biāo)準(zhǔn)孔中加標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，待測樣品100 μL，37℃溫箱孵育90 min，洗板5次，除空白孔外加入生物素化抗體工作液，封板膠封孔，37℃溫箱孵育60 min，洗板5次，除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液，封板膠封孔，37℃溫箱避光孵育30 min。洗板5次，加入顯色液，37℃溫箱避光孵育15 min，迅速加入終止液，混勻后即刻在450 nm波長下讀值，測定MIF、MCP-1的濃度。

1.6 細(xì)胞流式學(xué)檢測THP-1源性巨噬細(xì)胞表面抗原CD16、CD68表達(dá) 采用流式細(xì)胞儀(FACSCaLibar，美國BD公司)測定細(xì)胞表面抗原CD16、CD68的表達(dá)水平。在流式專用試管中分別加入20 μL 熒光素標(biāo)記的CD16、CD68單克隆抗體(美國BD公司)，100 μL細(xì)胞懸液振蕩混勻，室溫避光15 min孵育，震蕩混勻，室溫避光孵育10 min，2 500 r/min離心3 min，棄上清，加入PBS 0.5 mL混勻，重懸細(xì)胞上機檢測。以熒光素標(biāo)記的IgG2a-FITC作為同型對照。用CeLQuest軟件分析結(jié)果，以熒光陽性的細(xì)胞的平均熒光強度來表示。

2 結(jié) 果

2.1 ox-LDL對THP-1源性巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中炎癥因子表達(dá)的影響ox-LDL能以劑量依賴的方式誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)MCP-1和MIF。隨著ox-LDL刺激濃度的增加，MCP-1和MIF的分泌增加，其中50 mg/L組ox-LDL表達(dá)最高。詳見表1。

表1 不同濃度ox-LDL刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞表達(dá)MCP-1和MIF結(jié)果(±s)

2.2 養(yǎng)心氏對巨噬細(xì)胞活化的抑制 以不同濃度養(yǎng)心氏溶液預(yù)處理THP-1源性巨噬細(xì)胞12 h，以空白為對照組，加入50 mg/L ox-LDL刺激24 h，利用ELISA法檢測細(xì)胞上清液MIF、MCP-1的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)養(yǎng)心氏能以濃度依賴的方式抑制ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞分泌MIF和MCP-1，其中100 mg/L組最顯著。詳見表2。

表2 不同濃度養(yǎng)心氏對ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞分泌MCP-1及MIF的影響(±s)

2.3 ox-LDL對THP-1源性巨噬細(xì)胞表面抗原CD16和CD68的影響 不同濃度ox-LDL刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞24 h，以利用流式細(xì)胞術(shù)測定CD16和CD68的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著oxLDL刺激濃度的增加，巨噬細(xì)胞表面抗原CD16和CD68的表達(dá)改變，與對照組相比，50 mg/L組能顯著下調(diào)CD16、CD68的表達(dá)(見圖1、表3)。

圖1 不同濃度ox-LDL刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞表面抗原CD16和CD68的FACS檢測

組別CD16CD68對照組(0mg/L)25.2±0.629.8±0.410mg/L組28.3±1.630.9±0.725mg/L組23.7±0.71)29.9±1.750mg/L組 21.3±0.62)3)4) 26.9±0.92)3)4) 與對照組比，1)P<0.05，2)P<0.01；與10mg/L組比，3)P<0.01；與25mg/L組比，4)P<0.01。

2.4 養(yǎng)心氏對ox-LDL激活的THP-1源性巨噬細(xì)胞表面抗原CD16和CD68的影響 養(yǎng)心氏能夠以劑量依賴的方式改變巨噬細(xì)胞表面抗原CD68、CD16的表達(dá)，隨著養(yǎng)心氏刺激濃度的增加，CD16和CD68的表達(dá)上調(diào)，100 mg/L組表達(dá)最高(見圖2、表4)。

圖2 不同濃度養(yǎng)心氏刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞表面抗原CD16和CD68的FACS檢測

組別CD16CD68對照組(0mg/L)26.9±1.9 22.3±0.910mg/L組71.2±2.31)54.7±1.91)25mg/L組92.7±0.71)2)60.7±1.11)2)50mg/L組 96.1±1.51)2)3) 91.6±3.61)2)3) 與對照組比較，1)P<0.01；與10mg/L組比，2)P<0.01；與50mg/L組比，3)P<0.01。

3 討 論

關(guān)于免疫細(xì)胞在AS炎癥反應(yīng)中異常改變的研究日漸成為熱點，特別是單核-巨噬細(xì)胞，具有很強的可塑性及異質(zhì)性，作為炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞，被認(rèn)為是參與AS形成過程中的關(guān)鍵，它們能夠分泌促炎因子和其他炎癥介質(zhì)影響斑塊損傷形成和斑塊的穩(wěn)定性[3]。ox-LDL作為一種強致AS的損傷相關(guān)的分子模式，可以介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的激活、分泌、增殖，有研究表明ox-LDL能夠刺激巨噬細(xì)胞MIFmRNA的表達(dá)增加[4]，研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL可以以濃度依賴的方式增加MCP-1和MIF的分泌，但是經(jīng)養(yǎng)心氏提前處理巨噬細(xì)胞后，ox-LDL誘導(dǎo)的MCP-1和MIF的分泌被抑制，提示養(yǎng)心氏可以在泡沫細(xì)胞形成的過程中抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌，從而抑制巨噬細(xì)胞炎性活化。

養(yǎng)心氏作為一種復(fù)方中藥制劑，能從多靶點干擾AS進(jìn)程，發(fā)揮治療冠心病的效能，但具體的機制尚不完全清楚。有研究表明養(yǎng)心氏可以顯著降低血中內(nèi)皮素的水平，而內(nèi)皮素可以提高單核細(xì)胞的趨化性以及參與低密度脂蛋白的氧化修飾[5]。本研究中發(fā)現(xiàn)隨著養(yǎng)心氏刺激濃度的增加，MCP-1和MIF的分泌減少。MCP-1是由內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞合成的一種趨化蛋白，是內(nèi)膜單核/巨噬細(xì)胞募集到受損部位的主要因素[6]。MIF是來源于淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的一種蛋白質(zhì)，可抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞游走移動，使其聚集在炎癥部位，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子，加劇炎癥反應(yīng)，MIF還能刺激細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白表達(dá)和一氧化氮的釋放，細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白能降解細(xì)胞基質(zhì)，使斑塊失去穩(wěn)定性，最后導(dǎo)致破裂[7]。這些都提示養(yǎng)心氏可以抑制巨噬細(xì)胞的炎癥因子的分泌，從而發(fā)揮抗AS的作用。

M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞以動態(tài)的比例存在于AS的斑塊中，已經(jīng)分化的巨噬細(xì)胞仍可以相互轉(zhuǎn)化。本研究選擇巨噬細(xì)胞表面抗原CD16、CD68作為巨噬細(xì)胞亞型的表面標(biāo)記。Bouhle等[8]在動脈斑塊中發(fā)現(xiàn)CD68+細(xì)胞群能夠表達(dá)甘露糖受體，而甘露糖受體是M2巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志。CD16主要表達(dá)于單核細(xì)胞，通常認(rèn)為M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)CD16[9-10]，但TGF-β也能誘導(dǎo)血液中單核細(xì)胞表達(dá)CD16[11]，而TGF-β是一種能夠被M2型巨噬細(xì)胞分泌的抗炎因子[12]。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的ox-LDL可以使巨噬細(xì)胞表面抗原CD16，CD68表達(dá)下降，但經(jīng)養(yǎng)心氏處理后，巨噬細(xì)胞表面抗原CD16，CD68表達(dá)升高，提示ox-LDL可以刺激巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，而養(yǎng)心氏可以抑制這種轉(zhuǎn)變并促使巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮抗炎作用。養(yǎng)心氏可以抑制巨噬細(xì)胞的炎性活化及抑制巨噬細(xì)胞向促炎型轉(zhuǎn)化，這可能是其抗AS的主要機制。

養(yǎng)心氏可以抑制巨噬細(xì)胞的炎性活化及抑制巨噬細(xì)胞向促炎型轉(zhuǎn)化，這可能是其抗AS的主要機制。盡管養(yǎng)心氏對機體的作用機制仍需進(jìn)一步明確，但本研究為其抗AS的作用提供了實驗依據(jù)，為其更廣泛的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯王雅潔)

Regulation of Yangxinshi Tablets in the Macrophage Polarization and Activation

Liang Hou，Lu Yingjin，Ding Yanchun

Dalian Medical University， Dalian 116044，Liaoning，China

Ding Yanchun(The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University， Dalian，Liaoning，China)

Objective To explore the anti-atherosclerotic mechanism of Yangxinshi tablets(YXST)， we stimulated THP-1 derived macrophages with YXST and observed its effects on macrophage polarity switch and activation.Methods Human monocytic cell line THP-1 were differentiated into macrophages by stimulated with 160 nmol/L phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for 24 h.Then THP-1 derived macrophages were stimulated by different concentrations of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) for 24 h， which were 10mg/L， 25mg/L and 50mg/L， and blank was used as control.The secretion of monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) and macrophage migration inhibition factor (MIF) were detected by ELISA， and the membrane molecule CD16 and CD68 were tested by flow cytometry.THP-1 derived macrophages were pretreated with different concentrations of YXST (10 mg/L， 50 mg/L and 100 mg/L)12 h.Then we stimulated these cells by ox-LDL (50 mg/L) for 24 h and detected the secretion of MIF， MCP-1 and the expression of CD16 and CD68 again.Results The ox-LDL up-regulatet the secretion of MCP-1 and MIF as a dose-dependent manner in THP-1 derived macrophages.With the increasing concentration of ox-LDL， the secretion of MCP-1 and MIF increased， 50mg/L group reached their secretion peaks after 24h(MCP-1：29.30±1.48 pg/mL vs.control 5.71±1.94 pg/mL；MIF：18.67±0.15 ng/mL vs.control 4.61±0.40 ng/mL；P<0.01).The expression of CD16 and CD68 were varied with different ox-LDL concentrations.The mean fluorescence intensity of CD16 and CD68 was significantly reduced in 50mg/L group (CD16：26.9 vs.control 29.8；CD68：22.3 vs.control 25.2).YXST inhibited the expression of MCP-1 and MIF induced by ox-LDL as a dose-dependent manner.With the increasing concentration of Yangxinshi， the secretion of MCP-1 and MIF decreased.The 100mg / L group declined mostly(MCP-1：9.95±2.09 pg/mL vs.control 33.30±2.37 pg/mL；MIF：4.85±0.12 ng/mL vs.control 18.65±0.15 ng/mL；P<0.01).Yangxinshi change the expression of CD16 and CD68 reduced by ox-LDL as a dose-dependent manner， the mean fluorescence intensity of CD16 and CD68 was significantly up-regulated in 100 mg/L group (CD16：96 vs.control 26.9；CD68：91.6 vs.control 22.3).Conclusion YXST may execute its anti-atherosclerotic effect by inhibiting macrophage inflammatory activation and affecting macrophage polarity switch.

atherosclerosis；macrophage polarization；Yangxinshi tablets；monocyte chemotactic protein-1；macrophage migration inhibition factor

1.大連醫(yī)科大學(xué)2013級研究生(遼寧大連 116044)；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

丁彥春，E-mail：yanchunding@aliyun.com

R541 R289.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.15.008

1672-1349(2016)15-1722-05

2015-09-07)