DOP對鯉魚的遺傳毒性及肝臟抗氧化系統(tǒng)的影響

李鳳芝

(山東省單縣楊樓鎮(zhèn)孟寨中學(xué)，山東單縣 274300)

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DOP對鯉魚的遺傳毒性及肝臟抗氧化系統(tǒng)的影響

李鳳芝

(山東省單縣楊樓鎮(zhèn)孟寨中學(xué)，山東單縣 274300)

[目的]研究鄰苯二甲酸二辛酯(DOP) 對鯉魚的遺傳毒性及抗氧化性能的影響，為評價(jià)DOP的生物學(xué)毒性及水環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。[方法]應(yīng)用吉姆薩染色和試劑盒方法，研究0.3、1.5、7.5 mg/L的DOP 24 h暴露對鯉魚紅細(xì)胞核異常率和肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性及丙二醛(MDA)含量的影響。[結(jié)果]在DOP試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，紅細(xì)胞微核率、核異常率和總核異常率均隨著DOP濃度的升高而升高，且微核率在7.5 mg/L DOP組極顯著高于對照組。SOD活性則表現(xiàn)為低促高抑。0.3 mg/L DOP組POD活性顯著高于對照組，而1.5 mg/L DOP、7.5 mg/L DOP組POD活性無明顯變化。MDA含量隨著DOP濃度的升高而升高，且各濃度DOP組MDA含量均顯著高于對照組。[結(jié)論]一定濃度的DOP對魚類具有遺傳毒性，并能損傷抗氧化防御系統(tǒng)。

鄰苯二甲酸二辛酯；鯉魚；微核；核異常；超氧化物歧化酶；過氧化物酶；丙二醛

鄰苯二甲酸二辛酯(Dioctyl phthalate,DOP)是一種重要的酞酸酯類(PAEs)化合物，是生產(chǎn)上最常使用的一種塑料和橡膠增塑劑，同時(shí)，作為添加劑還被用于化妝品、造漆、染料和冷凝劑等領(lǐng)域[1]，由于DOP的廣泛應(yīng)用，在水體、土壤、大氣和食品中均已檢出DOP的存在[2-4]。目前，DOP已被美國國家環(huán)保局(EPA)列為優(yōu)先控制的6 種PAEs有毒污染物之一，也被我國列為優(yōu)先控制的3種PAEs環(huán)境污染物之一[5]。目前，DOP的生物學(xué)毒性效應(yīng)已成為研究熱點(diǎn)。研究表明，DOP能縮短果蠅壽命，引發(fā)生殖細(xì)胞發(fā)生畸變[6]，導(dǎo)致小鼠紅細(xì)胞微核率升高[7]，降低去甲腎上腺素和多巴胺的含量[8],降低蚯蚓的成活率[9],并具有生殖毒性[10]。但是，目前DOP對生物是否具有遺傳毒性尚缺少足夠的證據(jù)?？寡趸到y(tǒng)是機(jī)體內(nèi)重要的活性氧清除系統(tǒng)，當(dāng)機(jī)體受環(huán)境污染物脅迫時(shí)，其活性成分及其含量則發(fā)生改變，因此常作為污染物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的早期預(yù)警指標(biāo)[11]。目前，我國江、河、湖泊和自來水中均已檢測出DOP的存在，因此進(jìn)一步開展PAEs對水生動(dòng)物毒性的影響研究緊迫又必要。

魚類是與水生態(tài)環(huán)境變化密切相關(guān)的水生動(dòng)物，也是人類的重要食物來源。鯉魚屬于淡水鯉科魚類，是水生態(tài)毒理學(xué)中最常應(yīng)用的模式動(dòng)物之一，也是我國最重要的經(jīng)濟(jì)魚類。筆者以鯉魚為受試動(dòng)物，研究了DOP對鯉魚紅細(xì)胞微核率以及肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量的影響，旨在為探討DOP對水生動(dòng)物的遺傳毒性和抗氧化防御系統(tǒng)的影響以評價(jià)DOP的水環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1．1．1 試驗(yàn)動(dòng)物。鯉魚，由菏澤市牡丹區(qū)魚苗養(yǎng)殖場提供，體重(68.7±6.4)g，室溫條件下馴養(yǎng)14 d。

1.1．2 試劑和儀器。DOP(純度99.5%，購自Sigma公司)；吐溫80(國產(chǎn)分析純)、Giemsa染液以及SOD、POD、MDA、蛋白含量測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810，購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；冰凍離心機(jī)(Eppendorf-5417R，德國)；MOTIC顯微成像系統(tǒng)；自制玻璃缸(120 cm×60 cm×80 cm)等。

1．2 方法

1．2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的處理。試驗(yàn)共分為4組，分別為對照(CK)組以及0.3 mg/L DOP組、1.5 mg/L DOP組和7.5 mg/L DOP組(CK組及各濃度DOP組均含2.5 mg/L吐溫80)，每組設(shè)3個(gè)平行，每組鯉魚18尾，染毒在室溫玻璃缸內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)用水為曝氣2 d的自來水，使用充氧機(jī)24 h充氧，溶氧量不低于6 mg/L，pH為6.5～7.0，染毒24 h。

1.2.2 血涂片的制作、染色及觀察。染毒24 h，每組各隨機(jī)選取鯉魚3尾，斷尾取血，制作血涂片，每尾魚各制作3個(gè)血涂片，并按照試劑盒方法使用Giemsa染液對血涂片進(jìn)行染色，自然晾干。然后，使用MOTIC顯微成像系統(tǒng)在油鏡下觀察血涂片，每個(gè)涂片觀察統(tǒng)計(jì)3 000個(gè)以上紅細(xì)胞，記錄微核及核異常的細(xì)胞數(shù)，并按照以下公式計(jì)算出微核率、核異常率及總核異常率：

微核率=微核總數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×1 000‰

(1)

核異常率=具有核異常的細(xì)胞總數(shù)(不包括微核數(shù))/觀察細(xì)胞總數(shù)×1 000‰

(2)

總核異常率=微核率+核異常率

(3)

1.2.3 組織液的提取及生化指標(biāo)的測定。染毒24 h，每組各隨機(jī)選取鯉魚6尾，擦干后迅速解剖，取肝臟，并用0.65%的生理鹽水將表面的血跡沖洗干凈，用吸水紙吸干水分后稱重，并按w(g)∶V(mL)=1∶6的比例加入冰冷的0.65%生理鹽水，用玻璃勻漿器勻漿，使用冰凍離心機(jī)4 ℃下3 500 r/min離心20 min，取上清液置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。肝臟蛋白質(zhì)含量、MDA含量、SOD活性和POD活性的測定均按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 并使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DOP對鯉魚紅細(xì)胞微核及核異常的影響 由表1可知，DOP染毒24 h，紅細(xì)胞微核率、核異常率及總核異常率均隨著DOP染毒濃度的升高而升高，但0.3 mg/L DOP組總核異常率顯著高于對照(CK)組，微核率及核異常率與對照組差異均不顯著。1.5 mg/L DOP組核異常率顯著高于對照組(P<0.05)，總核異常率極顯著高于對照(CK)組(P<0.01)，但微核率與對照組差異不顯著。7.5 mg/L DOP組微核率、核異常率及總核異常率均顯著高于對照(CK)組(P<0.05)，且微核率和總核異常率均極顯著高于對照(CK)組(P<0.01)。這說明較高濃度的DOP能誘導(dǎo)鯉魚紅細(xì)胞微核的發(fā)生，具有遺傳毒性。當(dāng)DOP濃度較低時(shí)，遺傳毒性不明顯，但對細(xì)胞核具有致畸性。

表1 DOP對鯉魚紅細(xì)胞微核及核異常的影響

注：*表示與CK組差異顯著(P<0.05)，**表示與CK組差異極顯著(P<0.01)。

Note：*indicated significant differences (P<0.05)compared with CK group; and**indicated extremely significant differences (P< 0.01) compared with CK group.

2.2 DOP對鯉魚抗氧化性的影響 由表2可知，DOP染毒24 h，0.3 mg/L DOP組SOD活性高于對照組，但差異不顯著； 1.5 mg/L DOP組SOD活性顯著高于對照，7.5 mg/L DOP組SOD活性卻顯著低于對照，總體上表現(xiàn)出低促高抑的特點(diǎn)。POD活性也表現(xiàn)出低促高抑的特點(diǎn)，但僅0.3 mg/L DOP組POD活性顯著高于對照組(P<0.05)，1.5 mg/L DOP組、7.5 mg/L DOP組與對照組差異不顯著。DOP組MDA含量均高于對照組，且隨DOP濃度的升高而升高，但0.3 mg/L DOP組與對照組差異不顯著，1.5 mg/L DOP組、7.5 mg/L DOP組MDA含量卻顯著高于對照組(P<0.05)。這說明較高濃度的DOP能影響魚類的抗氧化系統(tǒng)，并對肝細(xì)胞具有損傷作用。

表2 DOP對鯉魚肝臟SOD活性、POD活性和MDA含量的影響

注：*表示與CK組差異顯著(P<0.05);**表示與CK組差異極顯著(P<0.01)。

Note：*indicated significant differences (P< 0.05)compared with CK group; and**indicated extremely significant differences (P< 0.01) compared with CK group.

3 討論與結(jié)論

微核，也稱衛(wèi)星核，游離于主核之外，為圓形或橢圓形小體，大小為正常細(xì)胞核的1/30～1/4，是染色體畸變的一種表現(xiàn)形式，一般認(rèn)為微核是在有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片或染色體在分裂過程中行動(dòng)滯后產(chǎn)生的[12]。微核率的大小與不良作用因子的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)。目前，由于微核試驗(yàn)測試方法簡單、靈敏，已成為推測不良環(huán)境污染物對真核類生物是否具有遺傳毒性的重要手段。核異常主要表現(xiàn)為核外凸、核內(nèi)陷、無絲分裂，核異形等，是有毒因子對遺傳物質(zhì)具有毒性作用的表現(xiàn)形式。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，較低濃度的DOP并不能引起紅細(xì)胞微核率的顯著升高，但能明顯引起核異常的發(fā)生，說明DOP對遺傳物質(zhì)細(xì)胞核具有一定的毒性，而較高濃度的DOP卻能極顯著誘導(dǎo)微核率的發(fā)生，說明較高濃度的DOP具有較強(qiáng)的遺傳毒性，這與張貴生[12]和王蕊等[13]報(bào)道的DEHP遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果相一致，其原因可能是DOP抑制了紡錘絲的形成，也可能導(dǎo)致了染色體的斷裂。李恒舟[14]報(bào)道DEHP能導(dǎo)致蚯蚓體腔上皮細(xì)胞DNA斷裂，DOP的作用機(jī)制可能與DEHP相一致，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

一般認(rèn)為，當(dāng)機(jī)體受環(huán)境污染物脅迫時(shí)，自由基就會(huì)大量產(chǎn)生，并攻擊細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，甚至細(xì)胞死亡[15]?？寡趸烙到y(tǒng)是機(jī)體內(nèi)重要的自由基清除系統(tǒng)，其中SOD和POD是抗氧化系統(tǒng)中重要的2種抗氧化酶類物質(zhì)，SOD 在機(jī)體內(nèi)主要是清除 ·O2-，同時(shí)生成H2O2，而POD在機(jī)體內(nèi)可清除H2O2。由此可見，SOD和POD在維持機(jī)體內(nèi)自由基動(dòng)態(tài)平衡方面起著極其重要的作用[16]，其活性變化反映著機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱，同時(shí)也是反映機(jī)體是否受外界不良因子脅迫的生物指標(biāo)。MDA是機(jī)體組織細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其含量變化是評價(jià)細(xì)胞膜是否受損傷及抗氧化防御系統(tǒng)是否受破壞的指標(biāo)之一[17]。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，DOP對鯉魚肝臟SOD活性表現(xiàn)為低濃度誘導(dǎo)高濃度抑制的特點(diǎn)，其原因可能是當(dāng)DOP進(jìn)入鯉魚機(jī)體內(nèi)后，引起O2-的大量產(chǎn)生，為防止機(jī)體組織免受氧化損傷， SOD被大量誘導(dǎo)合成，以清除多余的O2-，所以1.5 mg/L DOP組SOD活性明顯升高，但DOP濃度較高(7.5 mg/L)時(shí)，機(jī)體對于SOD活性的誘導(dǎo)跟不上機(jī)體內(nèi)O2-增加的速度，超過了機(jī)體自身的調(diào)節(jié)范圍，或者酶結(jié)構(gòu)受到損傷，所以SOD 活性受到明顯抑制。這與吳紅松[18]報(bào)道的三聚氰胺對鯉魚SOD活性的影響結(jié)果相一致。該試驗(yàn)結(jié)果表明，POD活性在較低(0.3 mg/L)濃度DOP組顯著高于對照，其機(jī)理可能與SOD的作用機(jī)理類似，但較高濃度時(shí)與對照組相比差異并不顯著。秦潔芳[19]報(bào)道DBP暴露3 d，能明顯抑制紫紅笛鯛肝臟POD活性，這與該試驗(yàn)結(jié)果并不一致，原因可能是該試驗(yàn)中DOP對鯉魚的染毒時(shí)間太短所致，也可能是DBP與DOP的毒性大小不同，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)中1.5 mg/L DOP組、7.5 mg/L DOP組MDA含量顯著高于對照組，說明較高濃度的DOP對抗氧化防御系統(tǒng)已造成一定程度的破壞，細(xì)胞膜已經(jīng)受到了一定程度的損傷。

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Effects of DOP on the Genetic Toxicity and Liver Antioxidant System in Carps

LI Feng-zhi

(Mengzhai Middle School in Yanglou Town,Shan County,Shandong 274300)

[Objective] To study the effects of DOP on the genetic toxicity and oxidation resistance of carps,and to provide theoretical basis for evaluating the biological toxicity and ecological risk to water environments of DOP.[Method] The effects of exposing with DOP (0.3,1.5,7.5 mg/L) for 24 h on erythrocyte nuclei abnormal rate and activities of liver SOD and POD and the content of MDA by Giemsa staining and the kit method.[Result] In the experimental concentration range of DOP,rate of micronucleus,nuclear anomalies and total nuclear anomaly on the erythrocyte were increased with the increase of DOP concentration,and the rate of micronucleus in the 7.5 mg/L DOP group was significantly higher than that in the control group.SOD activity was promoted in Low concentration and inhibited in high concentration.POD activity at 0.3 mg/L group was significantly higher,but it had no significant change at 1.5 and 7.5 mg/L DOP group compared with the control group.The content of MDA was increased with the increase of DOP concentration,and that in each DOP group was significantly higher than the control group.[Conclusion] A certain concentration of DOP has a genetic toxicity and can damage the antioxidant defense system of fish.

Dioctyl Phthalate (DOP);CyprinuscarpioLinnaeus(Carp); Micronucleus; Nuclear anomalies; SOD; POD; MDA

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2010CM046)。

李鳳芝 (1968- )，女，山東單縣人，中學(xué)一級教師，從事生物學(xué)教學(xué)及生態(tài)學(xué)研究。

2016-08-21

S 965.116

A

0517-6611(2016)28-0130-03