溫州蜜柑果皮提取物總酚·總黃酮含量測(cè)定及其抗氧化活性研究

左龍亞， 于 杰

(1.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715；2.南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716)

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溫州蜜柑果皮提取物總酚·總黃酮含量測(cè)定及其抗氧化活性研究

左龍亞1,2， 于 杰1，2*

(1.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715；2.南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716)

[目的]研究溫州蜜柑果皮不同溶劑提取物總酚、總黃酮含量及其抗氧化活性，篩選最佳提取試劑。[方法]依次用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯及蒸餾水對(duì)溫洲蜜柑果皮進(jìn)行提取，檢測(cè)不同溶劑提取物體外抗氧化活性，并對(duì)不同溶劑提取物總酚、總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。[結(jié)果]溫州蜜柑不同溶劑提取物均具有一定的抗氧化活性，其中甲醇、丙酮提取物的抗氧化活性較強(qiáng)，APC指數(shù)位居前2位。不同溶劑提取物的抗氧化活性與其總酚、總黃酮的含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.905**、0.583**、0.948**、0.849**、0.760**、0.955**(P<0.01)。[結(jié)論]對(duì)溫州蜜柑不同溶劑提取物總酚、總黃酮含量測(cè)定及其抗氧化活性研究確定甲醇為其最優(yōu)提取試劑。

溫州蜜柑；提取物；酚類物質(zhì)；抗氧化活性

溫州蜜柑(Citrusunshiu)隸屬于蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(CitrusL.)植物，主產(chǎn)于浙江省溫州市，又稱無(wú)核橘，現(xiàn)為世界性主要柑橘之一[1]。溫州蜜柑抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，能早產(chǎn)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，品質(zhì)好，易栽培，在我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展中占據(jù)重要地位。相關(guān)性研究表明，溫州蜜柑具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含多種生物活性物質(zhì)[2-4]，其中生物類黃酮有較高的研究?jī)r(jià)值，對(duì)機(jī)體抗氧化、抗癌、提高免疫能力等有顯著作用[5]。筆者以溫州蜜柑果皮干粉為材料，對(duì)比分析5種不同試劑提取物總酚、總黃酮含量及其抗氧化活性，旨在篩選溫州蜜柑活性物質(zhì)最佳提取試劑，為溫州蜜柑果皮活性物質(zhì)綜合利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料 溫州蜜柑干品，采自重慶市北碚區(qū)柑橘研究所，洗凈剝皮放入50 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，過(guò)60目篩備用。主要試劑：1，1-1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、2，2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[ABTS]、三吡啶基三嗪[TPTZ]、6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、沒(méi)食子酸(Gallic Acid)，均購(gòu)自Sigma公司(St Louis，MO，USA)。甲醇、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、冰醋酸、鹽酸、氯化鐵、過(guò)硫酸鉀、二甲亞砜(DMSO)、無(wú)水乙醇等試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，試?yàn)用水為二次蒸餾水。蘆丁(純度≥95%)、福林酚，購(gòu)于上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。

主要儀器設(shè)備：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A型)，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；小型粉碎機(jī)(ZN-04A型)，北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司；超聲清洗器(KQ-500DE型)，昆山市超聲儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA N-1100型)，東京理化器械株式會(huì)社；臺(tái)式低速大容量離心機(jī)(TDL-5A型)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(PerkinElmer Lambda 25)，美國(guó)珀金埃爾默公司。

1.2 方法

1.2.1 溫州蜜柑果皮提取物的制備。準(zhǔn)確稱取溫州蜜柑果皮粉末1.0 g置于50 mL離心管中，按料液比1∶20 g/mL分別加入甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、蒸餾水，振蕩器搖勻，50 ℃超聲波輔助提取1 h，5 000 r/min離心10 min后轉(zhuǎn)移上清液，殘?jiān)?0 mL相應(yīng)提取液，振蕩器搖勻，重復(fù)提取2次，合并3次上清液真空減壓濃縮至油膏狀，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得相應(yīng)溫州蜜柑果皮提取物，于-20 ℃冰箱中存儲(chǔ)、備用。

1.2.2 提取物抗氧化活性檢測(cè)。ABTS、DPPH自由基抗氧化活性測(cè)定參照張華等[6]的方法。亞鐵還原能力試驗(yàn)(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)值檢測(cè)參考Benzie等[7]的方法略加修改。取25 μL提取物，加入6 mL已經(jīng)預(yù)先混合的FRAP反應(yīng)試劑[0.1 mol/L pH 3.6醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ(溶于40 mmol/L 鹽酸)、20 mmol/L氯化鐵以體積比10∶1∶1混合]，振蕩30 s，反應(yīng)10 min，混合均勻后在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以VC為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的FRAP值(還原Fe3+的抗氧化活性)用VC含量表示(mg/g)。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.3 總酚、總黃酮含量的測(cè)定。 總酚測(cè)定參考Singleton等[8]的方法略加修改。準(zhǔn)確吸取25 μL檸檬皮提取液于10 mL試管中，加蒸餾水至2 mL搖勻；加0.5 mL福林酚試劑，混勻后暗處放置5 min；加入1.0 mL 5%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容至5 mL，充分混合后室溫放置60 min，于波長(zhǎng)750 nm處測(cè)吸光值。以沒(méi)食子酸做標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量用GAE(Gallic Acid Equivalent)含量表示。

總黃酮測(cè)定參考Kim等[9]的方法略加修改。準(zhǔn)確吸取50 μL提取液于20 mL試管中，加30%乙醇至2.5 mL，加0.2 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻放置5 min；加0.2 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻放置6 min；加1 mol/L氫氧化鈉溶液0.2 mL，用30%乙醇定容至5 mL放置15 min，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)其吸光度。以蘆丁做標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，總黃酮含量用蘆丁含量表示。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理。采用SPSS 17.0和Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并參照Z(yǔ)hang等[10]的方法引用APC綜合指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)其綜合抗氧化能力。

APC綜合指數(shù)=Σ[(樣品抗氧化值/最大抗氧化值)×100%]

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 沒(méi)食子酸標(biāo)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，蘆丁標(biāo)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of rutin

2.2 不同溶劑提取物總酚、總黃酮含量 總酚、總黃酮含量測(cè)定結(jié)果顯示，不同溶劑提取物種總酚、總黃酮含量差異性顯著(表1)。5種溶劑提取物總酚含量在(0.60±0.02)～(16.47±1.65)mg/g，甲醇提取物總酚含量最高，乙酸乙酯提取物總酚含量?jī)H為其3%。不同溶劑提取物總酚含量由大到小的順序依次為甲醇、丙酮、乙醇、蒸餾水、乙酸乙酯。不同溶劑提取物總黃酮含量在(4.63±0.10)～(10.36±0.21)mg/g，其中丙酮提取物總黃酮含量最高，甲醇次之，乙酸乙酯提取物總黃酮含量最低。不同溶劑提取物總黃酮含量提取由大到小的順序依次為丙酮、甲醇、乙醇、蒸餾水、乙酸乙酯，幾種溶劑提取物之間最大差異達(dá)1.24倍。

表1 不同溶劑提取物總酚、總黃酮含量

Table 1 Total phenols,total flavonoids content of different solvent extracts mg/g

注：同列不同字母為差異顯著(P<0.05)。

Note：Different letters in the same column stand for significant difference(P<0.05).

2.3 溫州蜜柑果皮不同溶劑提取物抗氧化活性 由圖3可知，溫州蜜柑果皮不同溶劑提取物對(duì)DPPH、ABTS自由基及FRAP值 3種抗氧化檢測(cè)均表現(xiàn)出一定的差異性(P<0.05)。其中丙酮提取物對(duì)DPPH自由基清除表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，清除率達(dá)(93.85±0.28)%，蒸餾水、甲醇提取物次之，清除率分別為(92.93±0.23)%、(92.15±0.49)%，乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基清除率僅為(15.68±51.55)%。不同溶劑提取物對(duì)ABTS自由基均表現(xiàn)出一定的抑制率且差異性顯著，對(duì)ABTS自由基清除率在(58.83±0.85)%～(87.46±0.83)%。5種不同溶劑溫州蜜柑果皮提取物均對(duì)ABTS自由基表現(xiàn)出較高的抑制率，大小順序依次為丙酮、甲醇、乙酸乙酯、蒸餾水、乙醇。FRAP鐵離子還原反應(yīng)表明，5種提取物均有一定的還原性，且不同溶劑提取物對(duì)FRAP抗氧化還原能力存在差異性。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，丙酮、甲醇2種試劑溫州蜜柑果皮提取物在FRAP氧化反應(yīng)中表現(xiàn)出較高的抗氧化活性[(28.06±0.61)、(26.55±3.10)mg/g]，同比乙酸乙酯抗氧化能力高出7倍。FRAP值在(3.27±0.22)～(28.06±0.61)mg/g。

2.4 不同溶劑提取物抗氧化活性綜合評(píng)價(jià) 5種溫州蜜柑果皮提取物APC指數(shù)顯示(圖4)，不同溶劑提取物的抗氧化活性差異明顯(32.58%～100%)。溫州蜜柑果皮5種不同溶劑提取物中丙酮提取物的綜合抗氧化指數(shù)最高，其次是甲醇提取物、蒸餾水提取物(91.70%～82.77%)。乙酸乙酯提取物綜合抗氧化指數(shù)最低，僅為32.58%，溫州蜜柑果皮不同溶劑提取物綜合抗氧化能力大小順序依次為丙酮、甲醇、蒸餾水、乙醇、乙酸乙酯。

2.5 酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性 從相關(guān)性分析看出(表2)，總酚含量與DPPH、ABTS自由基和FRAP值，總黃酮含量與DPPH、ABTS自由基和FRAP值都呈極顯著性的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.905、0.583、0.948、0.849、0.760和0.955。試驗(yàn)相關(guān)性系數(shù)分析顯示，總酚含量較總黃酮含量在溫州蜜柑果皮提取物綜合抗氧化活性檢測(cè)中發(fā)揮作用較大，與前人研究結(jié)果基本一致[11]。

注：不同字母為差異顯著(P<0.05)。Note：Different letters stand for significant difference(P<0.05).圖3 溫州蜜柑果皮不同溶劑提取物抗氧化能力比較Fig.3 The antioxidant capacity of different solvent extracts of Citrus unshiu peel

圖4 溫州蜜柑果皮不同溶劑提取物抗氧化活性APC指數(shù)Fig.4 APC indexes for antioxidant activities of different solvent extracts of Citrus unshiu peel

表2 酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性

注：**為差異極顯著(P<0.01)；*為差異顯著(P<0.05)。

Note：** stands for extremely significant difference(P<0.01); * stands for significant difference(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)對(duì)溫州蜜柑果皮不同溶劑提取物酚類物質(zhì)及其抗氧化活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同溶劑對(duì)溫州蜜柑果皮總酚、總黃酮含量提取存在顯著差異，同時(shí)在DPPH、ABTS自由基和FRAP值3種抗氧化體外檢測(cè)中也表現(xiàn)出不同抗氧化性能。綜合抗氧化APC指數(shù)顯示，蒸餾水提取物具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，這一現(xiàn)象可能與水提物中含有較多的多糖物質(zhì)以及一些具有抗氧化活性的多肽類物質(zhì)有關(guān)[12]；5種試劑對(duì)同一物質(zhì)中總酚、總黃酮、抗氧化活性差異可能與其試劑自身極性相關(guān)[13]。

5種不同溶劑溫州蜜柑果皮提取物酚類物質(zhì)含量測(cè)定及其抗氧化活性對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，丙酮、甲醇為溶劑所得溫州蜜柑果皮提取物比乙醇、蒸餾水、乙酸乙酯所得提取物具有更高的抗氧化活性和酚類物質(zhì)得率，這2種溶劑提取物在抗氧化活性和總酚、總黃酮含量上無(wú)顯著差異。由于丙酮具有較強(qiáng)毒性，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較大的傷害，因此該試驗(yàn)中選用毒性相對(duì)較小的甲醇作為溫州蜜柑果皮總酚、總黃酮及抗氧化活性物質(zhì)提取的最佳試劑。

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Detection of Total Phenols and Total Flavonoids Content in Extracts of Citrus unshiu Peel and Its Antioxidant Activities

ZUO Long-ya1,2,YU Jie1,2*

(1.College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University,Chongqing 400715; 2.Key Laboratory of Southern Mountain Horticulture,Ministry of Education,Chongqing 400716)

[Objective] The aim was to compare and study content of total phenols and total flavonoids inCitrusunshiupeel and antioxidant activity by different solvents,to screen out optimal extraction reagent.[Method] Methanol,ethanol,acetone,ethyl acetate and distilled water was used to get extracts fromCitrusunshiupeel.The antioxidant activity was detected.The content of total phenol,total flavonoids in different solvents was determined.[Result] The different solvents fromCitrusunshiuall had some antioxidant activity.The extracts from methanol and acetone had more stronger antioxidant activity than others,APC index was in top 2.The antioxidant activity had extremely significant positive correlation with the content of total flavonois,total phenols(r=0.905**,0.583**,0.948**,0.849**,0.760**,0.955**(P<0.01)).[Conclusion] The extracts of methanol ofCitrusunshiushow the best in antioxidant activities and contents of total flavonoids and phenols from different solvent extracts ofCitrusunshiu.

Citrusunshiu; Extracts; Phenolics; Antioxidant activity

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31171930)；重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(CSTC2013JCYJA8002)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(XDJK2014C091)；重慶市北碚區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015-35)。

左龍亞(1991- )，女，重慶人，碩士研究生，研究方向：果品營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量安全。*通訊作者，副教授，從事果品營(yíng)養(yǎng)研究。

2016-08-15

S 666

A

0517-6611(2016)28-0089-03